Штамм sтrертомyсеs fradiae продуцент рестриктазы sfr i

) Из я к биотехЦелью ение ново ноло изобретения является вьянго штамма - продуцента БЕгадгае ВКПИ Б, ветре ргопу езнательноССССО с высо м таимаеого уюцег знава ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГННТ СССР К А ВТОРСКОМУ СВИДЕ 1 ЕЛЬСТВ(56) агапэ. А.А., ег а 1, Аврес.Г 1 с епдопс 1 еазе Егосцв гад 1 одгапз. - 1982,184.(54) 11 ТПРОДУЦЕН Изобретение относится к биотехноогии и генной инженерии, н частноси к выявлению микроорганизма, способ ого синтезировать эндонуклеазу рестикции, узнающую и расщепляющую поседовательность нуклеотидон СССССС названную согласно общепринятой ноенклатуре 81 г 1,.Цель изобретения - выявлениеа - продуцента Бггерьошуеез ГгаВКПИ Б(303), нетребовательк питательным средам и синтезио одну рестриктазу, способную ть и расщеплять последовательго к питательным средаг и синтезирующего одну рестриктазу, способную узнавать и расцеыять последовательностьнуклеотндов СССССС с высоким выходом.ртам получен в результате поиска продуцентов рестрктаз среди микроорганизмов группы стрептомцетов, растетна простой дешевой питательной средеотечественного производства, обеспечивает пвышенный выход рестриктазы при оолее простом экономическом способе выделения Фермента по сравнению с известной Из 1 г влажной биомассы выделяют 30000-35000 уд, фермента с удеьной актв.остью 30000 ед/мл., Ытамм Ббгерногпус ез 1 гадз.ае (303)О Бпродуцирует Рестриктазу 81 г 1, имеет сайт узанання СССССС, идентичный сату узнавания Бас 11, и может заменить Бас 11 во всех генно-инженерных работах. ность нуклеотидоввыходом.1,1 там Б гадз.ае 303 получен в результате поиска продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов группыстрентомицетов.Предлагаемый штамм обладает следующп свойствами.,Иорфологические: клетки нитевидные, неподвижные, грамположительные,на крахмало-аммиачной среде образуютвросье колонии; воздушьп мицелийбелый или серо-розовый, субстратпй -грязно-желтоватьй. Споры овальные, 1645300(ВГ 1) - желтовато-белый, субстратныймицелий (СИ) - желтовато-рыжеватыйф 5растворимьп пигмент (РП) - отсутствует.На рыбно-питательном агаре: ВМ -отсутствует, колонии кожисгого типа;СИ - рыжеватый: РП - нет. 1 ОНа овсяном агаре: ВМ - серо-розовый, СИ - желтовато-бурый, РП - нет.На минеральном агаре: ВМ - белорозовый, СИ - желто-розовый; РП - нет,физиологические и биохимические 15свойства. "Факультативный аэроб, теьгпературный оптимум 30 С, рН среды7,0-7,5, Культура ферментирует глюкозу, галактозу, арабинозу, салицин;восстанавливает нитраты, разжижает 2 Ожелатин, не выделяет индол, сероводород, амилаэоположителен, тирозин неФерментирует. Обладает антагонизмомпо отношению к грамположительным нграмотрицательньщ бактериям, но не 25к дрожжам. Меланоидные пигменты необразует.штамм не усваивает маннит, иноэит,сахарозу: слабо усваивает рафиноэу,обладает амилазной и желатинаэной активностью, растет на клетчатке; несодержит тирозиназу,Устойчивость к антибиотикам: штаммустойчив к пенициллину, мономицину,неомицину, карбенициллину, оксациллину, ампициллину,сульфатиаэолу.штамм хранится в лиофильно-высуыенном состоянии и в растворе ЭОХ-гоглицерина при -60 фС,Для культивирования Б.йгайае 303применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированнойводы: БВК 20, НаС 1 5,0; глюкоза 3,0;рН 7,2. Культивирование проводят при30 С с хорошей аэрацией в течение48 ч. Выход сырой биомассы составляет в среднем 40 г/л культуральнойжидкостиВыход Фермента составляет 3000035000 ед.акт./г влажной биомассы,что в 15-17 раз больше, чем известного.Полученная рестриктаза .Бйг 1 характеризуется следующими свойствами 1узнает и специфически расцепляютпоследовательность нуклеотидов ССССО;оптимальное значение рН для действиярестриктазы 7,5-8,0; оптимальная температура действия 37 С, активностьо сохраняется также при 50 С; оптимальоная концентрацияионов Ия ф 5-15 мИ.БаС 1 50 мИ.Электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага Ф С 1 857 рестриктазамиБЕг 1 и Бас 11 и Бас 11 показывает,что картина гидролиэа полностью совпадает как при параллельном, так исовместном гидролизе. Следовательно,рестриктаэа Бйг 1 является изошиэоме,ром рестриктаэы Бас 11, узнает и расцепляет последовательность нуклеотидов СССССС,П р и м е р 1. Получение биомассыБ. йгаЫае 303, Клетки Б. йгайае 303,храняциеся в ЗОХ-ном растворе глицерина в, питательной среде при -20 С,овысевают на чашку с плотной питательной средой и инкубнруют при 30 С втечение 44-48 ч. Затеи клетки вносятбактериологической петлей в колбу с50 мп жидкой питательной среды, г/лдистиллированной воды: БВК 20 г/л;НаС 1 5,0 г/л, глюкоза 3,3 г/л; рН 7,2и выращивают на качалке при ЗОфС в течение 30 ч. Полученную культуру используют для засева 200 мп среды.Выращивание проводят также на качалкесо скоростью 150-200 об/мин в течение 48 ч. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин на центрифуге нИдзСга 1". Выход сырой биомассысоставляет 38 г/л культуральной жидкостиИ р и м е р 2, Выделение сайт-специфической эндонуклеазы рестрикцииБйг 1.10 г влажной биомассы суспендируютв 30 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера рН 7,5, содержацего 0,01 М 2-меркаптоэтанол и 1 мГ 1 ЭДТА, озвучиваютна дезинтеграторе УЗНДТ в диапазоне22 кГц 4-8 раз по 30 с, с таким жеинтервалом цен трифугируют (18000 об/мин60 мин., 4 С) и к полученному супернатанту добавляют сульфат аммониядо 753-го насыщения. Суспенэию выдерживают 18 ч при 4 С и центрифугируют.Полученный осадок растворяют в 20 мл0,02 И калий-фосфатного буфера, содержацего 1 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,5 мМЭДТА, 0,1 Ы тритон Хи 0,8 М Г 1 аС 1(буфер А). Раствор наносят на колонкус биогелем А 0,5 М (Вьо Вай), объемом500 мл, уравновешенную буфером А, иведут элюцию тем же буфером со скоростью 20 мл/ч. Фракции объемом 10 мпсобирают и анализируют на наличие5300 Ф о р и у л а изобретения Составитель И. ПриваловаТехред М,Дидык Корректор М. Шароши Редактор И, Касарда Заказ 1322 Тираж 377 ПодписноеВНИИПИ Гостдарственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР13035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 5164 фермента. Фракции, содержащие максимальную рестриктазную активность, объединяют и диалнэуют против 2 л 0,02 11 калий-фосфатного буфера рН 7,5, содержащего 1 мМ 2-иеркаптоэтанол и 0,5 мМ ЭДТА (буфер В), меняя буфер дважды. Диалиэуит, наносят на колонку объемои 30 мл с ДЕАЕ-целлюлозой (ДЕ, ЛаЬпап), уравновешенную буфером В. Колонку промывают буфером В и адсорбированный фермент элюируют 300 мл градиента МаС 1 (Э,Э 1 - 1,О М) в буфере В фермент после диализа наносят на колонку с Фосфоцеллюлозой (Р, йатап) объемом 10 мп, уравновешенную буфером В, и промывают колонку тем же буферои. Элюцию Фермента проводят 200 мл градиента ПаС 1 (0,0-1,0 11) в буфере В Фракции, содержащие рестриктазу, элюируют при 0,60-0,07 М ИаС 1, объединяют и диализуют против буфера В, содержацего 0,1 11 ИаС 1 и 507.-ный глицерин.,Ферментный препарат хранится при -20 С не менее 6 мес., хорошо трансопортируется в термосе с сухим льдом Выход фермента ЗОЭЭЭ ед,акт/г биомассы активность 3 ОЭЭО ед/мл.За единицу активности принимают минимальное количество фермента,необходимое цля полного расцеплеипя1 икг /01 К Фага ф С 1 857 в течение1 ч при 37 СОпределение последовательностинуклеотидов, узнаваемой рестриктазойБйг 1.Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестрик тазой Бгг 1, проводят гидролиз ДНКФага 9 С 1 857 рестриктазами Ыг 1и Бас 11 по отдельности, а также совместный гидролиз этими рестриктазами.Наблюдаемая картина полного совпаде ния Фрагментов, полученных при параллельном и совместном гидролизе, указывает на то, что рестриктаэа БЕг 1является изонизомером рестриктазыБас 11, узнает н расщепляет последовательность СССССС. Поскольку рестриктаза Мг 1, имеетсайт узнавания ССССО, идентичныйсайту узнавания Бас 11, она можетзаменить Бас 11 в экспериментах поФрагментации ДНК пб этим сайтам. 30 утаим БсгерСошусев 1 гадаае ВКПМ Б- продуцент рестриктазы Бйг 1,