Способ получения искусственного гена интерферона 2 человека и способ получения полипептида с активностью интерферона микробиологическим синтезом

(19) (11) З(51) С 1215100 ИСАЙ ОБРЕТЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ двторскомм свидетельств(71) Институт биоорганической химии, им. М. М. Шемякина и Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии(56) 1, РХ, ВгЫяеп еп а 1. Нцшап1 утрЬоЬ 1 авгоЫ 1 пегйегоп, 1.агрезса 1 е ргойцсг 1 оп апй рагп 1 а 1 рцгйхсас 1 оп. - .). Въо 1. сЬеш ., 1977, 65856587,2, Р, Ч, Соеййе 1 еп а 1, Нцшап1 ецЕосуе пгегйегоп ргойцсей Ь Е.со 1 х 1 з Ь 1 о 1 ое 1 са 11 у асйше. - Багцге , 1980, 287, 9 2, 411-45 (прототин).(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИСКУССТВЕННОГОГЕНА ИНТЕРФЕРОНА2 ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА С АКТИВНОСТЫО ИНТЕРФЕРОНА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМСИНТЕЗОМ.(57) 1. Способ получения искусственного гена интерферона с(,.2 человеказ а к л ю ч а ю щ и й с я в.том,что из мононуклеотидов фосфотриэфирным методом синтезируют олцгонуклеотиды длиной 9-15 звеньев, полученные олигонуклеотиды фосфорилируют с помощью полинуклеотидкиназы, олигомеры ной сшивкой фрагментов 1-4 по липким длиной от 28 до 99 пар оснований, да" лее их клонируют плазмидами рВЕ 322, рВВ. 322 мрп 3 и р 11 К 222, И-концевую половину гена собирают последовательно сшивкой фрагментов 1.-4 по липким концам в составе векторной молекулы причем липкие концы сайтов Крп 1 и Ваш Н удаляют ДНК-полимеразой 1 и 8 -нуклеазой а С-концевую половину гена собирают после клонирования одновременной сшивкой фрагментов 5-7 с Е определенной последовательностью нук- у леотидов, затем две половины гена сшивают в полный искусственный геи интерферона Ы, 2 человека внутри- или мекмолекулярным способом,2, Способ получения полипептида с активностью интерферона микробиологическим синтезом, включающим встройку ф искусственного гена интерферонаА 2 человека в векторную плазмиду, наработку целевого продукта трансформи- вй рованным микроорганизмом и выделение целевого .продукта, о т л и ч а ю ; щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхоа целевого продукта, при встройке искусственного гена интерферона о(. 2 человека используют лактозный оперон Е. со 1 в составе векторной плазмиды, а в качестве векторной плазмиды используют гибридную плазмы" ду р 1,еХР (р 1 ас) или р 1,е 1 Р-Б 1,СЕ е а е н Й О н ох нБюоО ДСОО О о О оО Ео О 1 Е- О о Ф О сч О О 1 ч О- о Оо морч Ь 8 Щ м ф И ьо мо мо ьо еч о м мф О Рф чм ао ж ж Ж Й е Я 4 мо 4 н о о ьо о о фью н Р 3 Щ в Ф н н Ф о Р 3ОИзобретение относится к биорганической химии, генетической инженерии и микробиологии.Изобретение относится к получению искусственного гена интерферона б 2 человека, аналогов и прототипа этогою фспособа в литературе не обнаружено.Изобретение касается также способа получения полипептида с активностью интерферона микробиологическим синтезом.Известен способ получения полипептида с активностью интерферона, основанный на использовании лейкоцитов крови, которые Ьосле индукции вирусом 5 продуцируют интерферон 111.Недостатками этого способа являются низкий выход продукта, высокая стоимость сырья и ограниченность его источников, что определяет высокую стоимость препарата.Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получе" ння полипептида, обладающего активностью ннтерферона, микробиологическим синтезом 21.Этот способ обеспечивает возможность получения продукта в больших количествах со сравнительно высоким выходом из дешевого исходного сырья, Однако недостатком данного способа является то, что копия гена из организма человека не является оптимальной для наработки кодируемого им по липептида в бактериальной клетке, поскольку первичная последовательность эукариотического гена содержит кодоны, характеризующиеся низким уровнем трансляции в бактериальной клетке, 40 что снижает выход продукта генетической экспрессии. Кроме того, копия природного .гена не приспособлена для создания штамма-продуцента, так как для ее использования требуется про ведение ряда перестроек первичной структуры с помощью методов генетической инженерии и химического синтеза.Целью изобретения является полу чение искусственного гена интерферона ф 2 человека, а также увеличение выхода полипептида с активностью ин.терферона.Поставленная цель достигается тем, 55 что согласно способу получения искусственного гена интерферона оС 2 человека при помощи фосфотриэфирного метода из мононуклеотидов синтезируютолигонуклеотиды длиной 9-15 звеньев,полученные олигонуклеотиды фосфорнлируют с помощью полинуклеотидкиназы,олигомеры сшивают ДНК-лигазой в 7фрагментово длиной от 28 до 99 пароснований, далее их клонируют плазмидами рВВ. 322, рВК 322 мрС 3 ирБК 222, Н-концевую половину генасобирают последовательной сшивкойфрагментов 1-4 по липким концам всоставе векторной молекулы, причемлипкие концы сайтов Крп 1 и Вам Н 1удаляют. ДНК-полимеразой 1 и Я -нуклеазой, а С-концевую половину генасобирают после клонирования одновре.менной сшивкой фрагментов 5-7 с определенной последовательностью нуклеотидов, затем две половины генасшивают в полный ген интерферонаоС 2 человека внутри- или межмолекулярлым способом,Кроме того, согласно способу получения полипептида с активностьюинтерферона микробиологичееким сии .тезом путем встройки искусственногогена интерферона сК. 2 человека в векторную плазмиду, наработки целевогопродукта трансформированным микроор"ганизмом и выделения целевого продукта при встройке искусственного генаинтерферона о 6 2 человека используютлактозный оперон Е. соЕ в составевекторной плазмиды, а в качестве векторной плазмиды используют гибриднуюплазгащу рЬе 1 Р раас) или рЬе 1 Р-В 1. На фиг. 1 изображены аминокислотная и нуклеотидная последовательности интерферона и искусственного гена интерферона с 62 (отличия от природной последовательности нуклеотндов в значащей цепи подчеркнуты); на фиг, 2 -нуклеотидная последовательность синтетических фрагментов гена (знаками Л указано разделение цепей фрагментовна олигонуклеотиды); на фиг. 3 - схема сборки Н-концевой половины гена 7-250) из фрагментов 1-4 путем последовательной сшивки фрагментов по липким концам в составе векторной молекулы с последующим удалением сайтов КРп 1 и Ваш Н 1; на фиг. 4 - схема сборки С-концевой половины гена 251-501) из фрагментов 5-7 путем одновременной сшивки фрагментов после клонирования и встрсйки в векторную молекулу; на фнг. 5 " первый ва1092176 3риант получения векторных плазмид и сборки полного гена из половин внутримолекулярной стыковкой половин гена в векторной ДНК; на фиг, Ь - второй вариант получения векторной плаз миды и сборки полного гена интерфе" рона межмолекулярной сшивкой фрагментов при одновременной вставке их в векторную ДНК; на фиг. 7 - схема по- . лучения рекомбинантной плаэмиды для 10 экспрессии искусственного гена интерферона о 2 .человека с использованием плазмидного вектора рзК 95.1 на фиг. 8 - то же, с использованием плазмидного вектора рВК"В 1. 15. Предлагаемый способ синтеза позволяет получить ген с любой наперед- заданной структурой. Синтез гена интерферона Ф 2 человека и его свойства ранее в литературе не описаны. Искусственный ген интерферона сс 2 человека, первичная структура которого представлена на фиг, 1, кодирует полипептид длиной 165 аминокнслотных остатков, соответствующий природному 25 интерферону оС 2 человека, однако является химическим соединением, принципиально отличающимся от природного гена по нуклеотидному составу и первичной структуре. Это отличие дости- З 0 гается за счет введения в процессе синтеза кодирующих триплетов, обеспечивающих максимальную экспрессию гена в клетках Есой в результате более эффективной трансляции мРНК.35Для синтеза гена его структуру разбивают на 7 фрагментов длиной до 100 пар оснований (фиг, 2). Для удобства клонирования синтетические фрагменты содержат на концах сайты, узнавания рестриктаз, которые при необходимости удаляют из них на этапе сбсрки гена. Каждьп.из фрагментов, в свою очередь, разбивают на олигонуклеотиды длиной 9-15 звеньев(фиг. 2). Для обеспечения однозначного сшивания олигомеров ДНК-лигазой по стратегии Кораны разбивку фрагментов проводят с помощью ЭВМ по специально разработанной программе. Схему 50 синтеза олигонуклеотидов рассЧитывают с учетом частот встречаемости различных повторов в составе последовательности нуклеотидов гена, а также с точ. .ки зрения минимизации затрат исходного нуклеотидного материала,что значительно снижает трудоемкость синтеза. 4Способ получения гена, включающий молекулярное клонирование после лигазной сшивки в качестве стадии очист ки и характеризации, обеспечивает получение фрагментов гена в индивидуальном виде в необходимом количестве. Длину фрагментов выбирают оптимальной с точки зрения лигазной сшивки из . олигонуклеотидов. Такой подход, впервые предложенньй и использованный и в данном изобретении является универсальным приемом для синтеза генома любой произвольной длины и последовательности.Химический синтез олигонуклеотидов проводят модифицированным фосфотриэфирным методомв растворе и на полимерном носителе, Оливонуклеотиды фосфорилируют с помощью полинуклеотидкиназы, 4-6 олигомеров сшивают действием ДНК-лигазы в дуплексные блоки, из которых затем собирают фрагменты для промежуточного клонирования Клонирование фрагментов после ригазной сшивки осуществляют в составе плазмид рВК 322, рВК 322 шрй 3 ирБК 222, как показано на фиг. 3 и 4. Структуру рекомбинантных плазмид,содержащих фрагменты гена интерферона, подтверлщают методом Максама-Гилберта.Сборку гена проводят в два тапа. На первом этапе из фрагментов 1-4 и15-7, соответственно, синтезируют двеполовины гена. На следующем этапе половины гена сшивают в полный ген,1 который затем встраивают в вектор для экспрессии, Схема сборки М-концевой половины гена представлена на фиг. 3. Сборку проводят путем последовательной сшивки фрагментов по липким конаам в составе векторной молекулы.На последних стадиях с помощью ДНКполимеразы 1 и Б -нуклеазы удаляютлипкие концы сайтов Крп и Ваш Н 1, невходящих в состав гена и использующихся для удобства клонирования исшивки фрагментов. С-концевую половину гена собирают путем одновременной сшивки фрагментов 5-7 после кло-,нирования, как показано на фиг. 4, ипоследующей встройки в векторнуюплазмиду р 1 Ж 222,Для осуществлейия сборки целогогена лейкоцитарного интерферона из половин необходимо сконструироватьвекторные плазмиды.С этой целью сначала в плазмиде рВК 322 проклонируют по ЕсоК 1-сайту. синтетический линкерный додеканукле. отнд ААТТТАСАТСТА, Полученную таким образом плазмиду рРК 14, обеспечиваю, щую устойчивость Е. со 1 к тетрациклину и ампициллину, отбирают по наличию сайта"рестриктазы Вя 1 11 и отсутствию сайта ЕсоК 1. Клонированием по ВашН 1-сайту додекануклеотида0 САТСССААТТСС, содержащего ЕсоК 1-сайт получают необходимую векторную плазмиду рРК 16. о 15,Место соединения половин гена не является сайтом эндонуклеазы рестрикции, поэтому сшивку половин необходимо проводить по затупленным концам (удалением Ндпс 1 111-выступающего конца М-концевой половины гена и заполнего нием ЕсоК 1-выступающего конца С-полу." вины гена). Такую сборку осуществляют двумя способами (фиг. 5 и 6), Согласно первому способу стыковкуг 5 половин проводят виутримолекулярно в составе плазмидного вектора (Фиг. 5). С этой целью сначала в плазмиде рРК 16 по сайтам Вя 111 и Н 1 пд 111 реклонируют Б-концевую половину гена, выделенную ,из плазмиды рЬе 1 Р (7-250), В получен- З 0 ную таким, образом плазмиду рЬе 1 Р (7-250). 2 вместо фрагмента ЕсоК 1 Яа 1 1-287 встраивают С-концевую половину структурного гена. В результате полу чают плазмиду рЬе 1 Ке 1, в которой обе 35 половины гена находятся.в нужной для стыковки ориентации и разделены последовательно в 352 нуклеотидные пары. Для окончательной сборки гена ДНК плаэмиды рЬе 1 Рй 1 гидролизуют ре стриктазой Нхпй 1 П, выступающие кон" цы удаляют мягкой обработкой Я 1 -нуклеазой, после чего ДНК подвергают гидролизу рестриктазой ЕсоК 1 и достраивают липкие концы при помощй 45 ДНК-полимераэы 1 Е. со 11. (Фрагмент Кленова) . Полученную таким образом ДНК обрабатывают Т 4 ДНК-лигазой в условиях сшивки по тупым концам, после чего используют для трансфор мации клеток Е. соЬ НВ 101 или ИМН 7118, Отбор трансформантов проводят гибридизацией колоний на нитроцеллюлозных фильтрах. В качестве зонда для гибридизации используют пентаде кануклеотид СТЫСАСАААТТСТАС, Строение полученной таким образом плазмиды подтверждают рестриктным анализом и анализом нуклеотидной последовательности вставки.Другой способ заключается в выделе нии соответствующим образом подготовленных половин структурного гена и одновремевяой вставке их в векторную ДНК.,В этом случае в качестве вектора используют большой Ве 11 Яа 1 1-Фрагмент плазмиды рРК 14, который выделяют электрофорезом в 57-ном полиакриламидном геле (ПАГ). Чтобы получить И-концевой фрагмент, ДНК плазмиды рЬе 1 Р (7-250), 2 сначала расщепляют рестриктазой Нпд 111, а послеобработки Я -нуклеазой гидролизуют рестриктазой ВД 11, и малый фрагмент выделяют электрофорезом в 57-ном ПАГ.Аналогичным образом для получения С-концевого фрагмента ДНК плазмиды рЬе 1 Р (251-501) гидролизуют рестриктазой ЕсоК 1, липкие концы достраивают ДНК-полимеразой 1 Е, сой после чего гидролизуют рестриктазой Яа 21, и фрагмент выделяют электрофорезом в 57-ном ПАГ. Зквимолярные количества половин сшивают ДНК-лигазой с векторным фрагментом, и полученной ДНКтрансформируют клетки Е, со 11. ВМН7118. Отбор рекомбинантных плазмидпроводят перекрестной гибридизациейс фрагментами Н- и С-концевой половины структурного гена, а также с пентадекануклеотидом СТССАСАААТТСТАС,Для получения рекомбинантной ДНК, содержащей полный структурный ген лейкоцитарного интерферона с человека, гидролизованную рестриктазой В Е 211 плазмиду рЬе 1 Рс 17 сшивают с избытком нефосфорилированного 22- -звенного олигонуклеотидаСАТСАСАСАССАТССАТСТСТ, .содержащего сайт эндонуклеазы Ваш Н 1 и начало гена, и полученной ДНК трансформируют компетентные клетки Е.соИ (Фиг. 6).Для того, чтобы искусственный ген лейкоцитарного интерферонас 2 чело века мог экспрессироваться в бактериальной клетке, необходимо снабдить его регуляторным сегментом ДНК, содержащим участки инициации транскрипции и трансляции, В качестве такой регуляторной ДНК выбирают промоторнооператорный фрагмен лактозного оперона Е.сой 1 (содержит промотор 1 асБЧ 5, оператор и сайт связывания рибосомы), под контролем которого протекает эфФективная экспрессия гена )5 -галактозидазы в бактериальной клетке..7В качестве одного из вариантоввекторной системы для экспрессии(фиг. 7) используют встрсйку гена всостав нлазмидного вектора рЯК 95;1(производное рВК 322, содержащее 51 асБЧ 5-промотор Е. со.ь 1.) путемсшивки ДНК-лигазой смеси векторарЯК 95.1, обработанного рестриктазами ЕсоК 1 и Яай 1, гена интерферона,выделенного из состава плазмидырЬе 1 Р 17 по сайтам Вд 11-Яай Т, исинтетического линкера, состоящегоиз олигонуклеотидов ААТТСАТСТЫТ иСАТСАСАСАТАС. В полученной в результате этого плазмиде рЬе 1 Р (Раас) 1,аспромотор оказывается расположеннымперед геном в положении, наиболее,благоприятном для экспрессии.В другом варианте (фиг. 8) в качестве вектора для экспрессии используют плазмиду рВК-В 1, отличающуюсяот рВК 322 тем, что она содержит перед ВашН 1-сайтом 90-нуклеотидный промоторный фрагмент лактозного оперона.Клонирование в РВИ"В 1 искусственного 25гена интерферона (выделяют из плазмиды рЬе 1 РТЗ) по сайтам ВашН 1 и ЯаХ 1приводит к плазмиде рЬе 1 Р-ВТ, в которой экспрессию синтетического геналейкоцитарного интерферона осуществляЗрют под контролем двух природных промоторов (Рйе 1 и Раас).Экспрессия гена интерферона с 1.2характеризуется в международных едини-.цах активности интерферона в лизатах,З.полученных после разрушения клетокЕ.со 11., несущих гибридные плазмидырЬе 1 Ы (Раас) и РЬеХР-В 1.Способ получения полипептида с активностью интерферона осуществляют 40следующим образом,Химический состав олигонуклеотидовпроводят, исходя из нуклеозид-фосфатов, защищенных по гетероциклическим основаниям (кроме Т) и фосфорному остатку Для защиты аминогруппгетероЦиклов используют бензонльнуюгруппу для А и С и изобутиральнуюгруппу для С, Фосфатный остаток защищается и-хлорфенильной ир -цианэтильной группами, 5 -ОН-группы -диметокситритильной или монометокситритильной группами. В качестве конденсирующего реагента используюттриизопропил- или мезитиленсульфотет 55разолид, в качестве полимерного носителя - полистирольный гель с 27. по-.перечных сшивок, Удаление 51-концевых моно- и диметокситритильных групп при синтезе в растворе и на носителе ,проводят с помощью 10 Е ТХУ или 27. бензолсульфокислоты, удаление 3 -Р- -защитной цианэтильной группы - с помощью раствора триэтиламина в ацетонитриле или водном пиридине. Полное удаление защитных групп проводят обработкой бензальдоксиматом тетраметилгуаниция (или лития) и/или аммиаком и далее 803-нойуксусной кислотой.Промежуточные фосфортриэфиры. выделяют колоночной хроматографией на силикагеле в хлороформе или в системе с обращенной фазой на силанизированном силикагеле в водном диоксане. Деблокированные олигонуклеотиды выделяют высокоэффективной колоночной хроматографией и метят с помощью Г( 3 а 1Р 1 -АТФ и полинуклеотидкиназы для анализа и последующей сшивкн ДНК-лигазой, Для этогок смесй олигонуклеотидов, входящих в. состав син тезируемого фрагмента, за исключением 5 -концевых, добавляют 1/1 О объема 10 Х лигазного буфера 1200 мИ трисСВрН 7,5, 100 мМ Ия СХр 100 мИ меркаптеэтанап 1-2 мкКм ф- АТФ и соответствующее количество полинуклеотидкиназы (из расчета 1 ед, фермента включает 1 нмоль Р за 30 мин при 37 С). Реакционную смесь инкубируют 30 мин при 37 С1) затем добавляют 10-.кратный мольный избыток АТФ (по отношению к общемуФколичеству 5 -концов и инкубируют еще,30 мин. Реакцию останавливают добавлением 1/10 объема 100 мМ ЭДТА и смесь выдерживают 5 мин при 75 С..о После остывания добавляют 5 -конце 1 вые олигонуклеотиды и 1/10 объема й100 мИ Ия Сй, Буферный состав для сшивки восстанавливают с помощью раствора, содержащего 200 мИ трнс- НСЬ, рН 7,5, 100 мМ Мя С 6,1 и 100 мИ меркаптоэтанола, и добавляют лигазу1до концентрации 50-100 нМ Сшивку проводят либо 4-18 ч при 1 О-. 15 С, либо 3 ч при комнатной температуре, добавляют 25 мкл ЗМ ацетата натрия, "доводят объем водой до 250 мкл, добавляют РНК до суммарной концентрации 50-100 мкг/мл и 750 мкл этанола, Раствор перемешивают и замораживают в жидком азотеПосле оттаивания смесь центрифугируют. Осадок ресуспендируют в 250 мкл 0,3 М ацетата натрия, рН 7,0 и переосаждают, Оса;,док промывают этанолом и высушиваютв вакууме.Распределение продуктов сшивки ДНКлигазой проводят в 10-207.-ном полиакриламидном:геле,содержащемили не со-, 5.трис-борат, 1 мМ ЭДТА, рН 8,3) размером 20 х 40 х 0,06 см, либо 10 х 20 х 0,06 смпри градиенте напряжения 30-50 В/см 1 Ов течение 1,5-3 ч.Местоположение продукта на гелевыявляют радиоавтографией с использованием пленки РМ"1 и усиливающегооэкрана в течение 1-2 ч. 15Полосу, соответствующую продуктусвивки, вырезают из геля, элюируютэлектрофоретическим способом в течение 3-5 ч при 100-150 В и концентри-.руют на диализной пленке или ионообменной бумаге ЭЕ. Удаление продукта с бумаги производят промывкой4 х 25 мкл 1 М БаСХ и 7 М мочевины ипродукт обессоливают на колонке 0,3 хх 20 см с биогелем Рв буфере 1 мМтрис-НСВ, рН 8,0, 0,1 мМ ЭДТА. Средний выход на стадии лигазной сшивкисоставляет 50-907.Клонирование синтетических фрагмен.. рВК 322 шр 3,В типичном эксперименте к 0,2 мкгвекторной молекулы добавляютф 1-2 пмоля 5 -фосфорилироцанного фрагмента илигируют как описано.В случае получения плазмидырЬе 1 Г (Нас) в реакционную смесь добавляют по 20 пмолей нефосфорилированных по 5 -концу линкерных олигону-оклеотидов 5 -ААТТСТАТСТСТ и 5 -САТСАСАСАТАС, Лигазной смесью трансФормируют клетки Е,соК, обработанные ОаС 1 и высеивают на 1,5 ЬВ-агар,содержащйй 20 мкг/мл ампициллина(атакже 10 М изопропилтиогалактозидаи 40 мкг/мл Х-Са 1 нри клонировании в,плазмиде р 11 К 222).Выделение ппазмидных ДНК для клонирования и гидролиз эндонуклеазами 50рестрикции ЕсоК 1, ВашН 1, Бай 1,НхпйШ, Вя 11 Яао За, ЕсоК 11, Ввр 1,Мвр 1, Рзй 1 и Крп 1 проводят стандартным способом. В случае использованияэндонуклеазы ЕсоК 11 плазмидную ДНК . 55выделяют из штамма В 834. Рестрикционные фрагменты разделяют электрофо"резом в 4-8-. ном полиакриламидном геле, Фрагменты ДНК из геля выделяютметодом электроэлюции и концентрируют, как описано,Выступающие 5 -концы удаляют спомощью экзонуклеазы, Б , Для этогок 5 мкг ВажН 1-гидролизата ДНК плазми.ды р 1,Р Б 4 в 200 мкл буфера, содержа-щего 0,5 М БаСЙ, 30 мМ БаАс, рЦ 4,8,3 мМ Еп 80, добавляют 10 ед. Я-нуклеазы и инкубируют 30 мин при 12 С.Затем фермент удаляют экстракциейнейтральным водным фенолом (рН 8,0)и ДНК осаждают спиртом.Выступающие 3 -концы ДНК удаляютс помощью ДНК-полимеразы 1 Е.сой.(фрагмент Кленова). Для этого 2 мкгплазмиды рЬРБ 1, гидролизованной эндонуклеазой Крп 1, инкубируют 40 минопри 12 С в 100 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-НСВ, рН 7,5, 10 мММя СХ , 1 О мМ меркаптоэтанол, 0,05 мИкаждого с,АТФ, Ы.СТФ, 3.СТФи. АТТФи 5 ед. ДНК-полимеразы, Белок удаляют экстракцией Фенолом и ДНК высаживают спиртом. Эти же условия используют для превращения липких концов втупые на стадии сборки полного генаиз половин.Отбор трансформантов, содержащих необходимый фрагмент, проводят с по-мощью метода гибридизации п зСц на нитроцеллюлозных фильтрах, используя в качестве зондов Р-меченные синте,Итические олигонуклеотиды или более длинные фрагменты после сшивки ДНК- лигазой. Колонии переносят на фильтр, проводят обработку Фильтра для разрушения клеток 0,5 М БаОН в течение 5 мин, фильтрат нейтрализуют в растворе 0,2 М трис-НСВ, рН 7,0, 1 М БаСХ, промывают в 0,25 М фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 0,3 И БаСЙ цитрат натрия, сушат при 80 С в вакууме,. а затем выдерживают в течение 2-16 ч в гибридизационной сме" си состава: 0,047. Фиколл 400; 0,047 бычий сывороточный альбумин; 0,047 поливинилпирролидон; 0,9 М БаС 1, 0,09 М:цитрат. натрия; 0,2 Ж додецилсульфат натрия, Р-меченный зонд с радиоактивностью 10 имп/мин/мкл.3Температуры гибридизации составляют: для олигонуклеотидов длиной 30 и более нуклеотидных остатков 55-65 С,а для олигонуклеотидов длиной 21-23 ос 0татка - 45-50 С; для олигонуклеотидао длинои 15 остатков - 37 С. Положениеколоний, содержащих искомую последо(контроль) ВМН 2,4 1 О 7118 1,4 1 О 5 10 -10 310"610 7118 ВМН То же р 1.е 1 Р-В 1 Ре 1 Р 1 ас 718 вательность ДНК, определяют радиоав" тографией, используя пленку РТ.Первичную последовательность фраг ментов в составе гибридных молекул определяют методом Максама-Гилберта. 51Для мечения 5 -концов используют полинуклеотидкиназу, как .описано, а для мечения 3 -концов проводят достройку с помощью ДНК-полимеразы.Тестирование активности интерферо- О на в клетках Е.сой 1 проводят известным способом.мл культуры Е.со 11 (штамм 294 или 3 МН 7118), трансформированной гибридной плазмидой с искусственным геном, выращивают. н 1 В-сре де с 50 мкг/мл ампициллина до А " 1 и разбавляют 25 мл среды М 9, содержащей 0,27 глюкозы, 0,57. казаминовых кислот, 50.мкг/мл ампициллина и 1 мМ изопропилтиогалактозид. Когда клетки достигают плотности А 5 = 0,5 их осаждают центрифугированием, суспендируют в 1 мл 15 Ж сахарозы, 50 мл трис-НСС, рН 8,0, 50 мМ ЭДТА. К суспензии клеток прибавля 00 т 1 мг лизоци ма и через 5 мин при ОС разрушают . клетки ультразвуком. Центрифугируют 10 мин при 100 000 я, Активность ин-. терферона определяют в супернатанте, сравнивая с активностью стандартного З 0 лейкоцитарного интерферона (препарат ВНИИОЧБ, Ленинград, охарактеризованный относительно международного стандарта (В 69/19) методом ингибирования цитопатического эффекта). 35Полученные и литературные данные для сравнения приведены в таблице. ФВМН Искусственный р 1,е 1 Р Р 1 ас Р 1 ас Как видно из таблицы, использование искусственного гена по сравнению с природным обеспечивает значительное повышение экспрессии (числа моле" кул продукта на клетку Е,со 11), сравнимое с эффектом удвоения промотора, Этот вывод является справедливым и для системы экспрессии стриптофановым промотором, использованном в прототипе. Очевидно, что экспрессия искусственного гена д.2 под контролем триптофанового промотора, использованного в прототипе, превышает уровень 9000 молекул на клетку./Внедрение в СССР микробиологического способа синтеза интерферона с использованием искусственного геиа позволяет значительно увеличить производство препарата для клинических и научных целей. Интерферон, получаемый микробиологическим путем, не отличается по свойствам от природного соединения и может быть получен в высокоочищенном состоянии.Значительный практический интерес представляет использование искусственного гена интерферона Д 2 в других, системах экспрессии в Е.со 1, а также создание продуцентов на основе промьппленных микроорганизмов.Синтетический искусственный ген интерферона А 2 не имеет природных аналогов. Он может быть использован в дальнейшем для создания продуцентов новых неприродных интерферонов с измененной первичной структурой, обладающих другими свойствами. 1,4 1 О 5 10 -10 3100-6100,13 Продолжение таблицы р 16117 К .Р 1 ас 3,5 О 2 1 О 50 НВ 01 рГ 1 Р 1 ас 9 Тандеиный 3,5 1 О 9 10 Р 1 ас 2250 Прототип 3,5 1 О З,б 10 9000 294 Природный 2 рЬе 1 Р А 25 Рйгр Ехргеввдоп оГ йЬе Ьцшап йдЬгоЬ 1 авс пйегГегоп,Ы Е.со 1, Т. ТапддцсМег. а 1, Ргос. Иаг. Асад Бсд. 08 А, 1980, 77, и 9, 5230-5233.ЗупСЬезз оЕ Ьшпаи ГдЬгоЬ 1 азй игегГегоп Ьу Е.со 1 д. Ц. СоеЫе 1 ес а 1.Бцс 1. АсЫв Вев. 1980, ч. 8, .и. 18, 4057-4074дд 3бб31о б 8о ос ч 8ь: 3фс о об Ьб Ь1а . о оИ б б1354 о оЬ боэ оО ое нэ о о