Способ получения кислотоустойчивых штаммов дрожжей

(54) (57 ТОЙЧИВЬ ривающи прерывн в С среде источни фосфора Н,И. Теосреды и в проце отбором о т л и И.НАцидо- дрож- в с целью ти штам жение р ществля кислото достиже роста к ва 6 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Институт микробиологии АН(56) 1 Семушина Г.С., МонаховПозмогова И,Н., Работнова И.Л.рия и практика управляемого култивирования микроорганизмов. Ки"Наукова думка", 1981, с.119,2. Андреева Е.А ПозмоговаРаботнова И,Л., Новикова А.Н,фильный термотолерантный штаммжей СапдЫа пЫЫз, полученныйусловиях непрерывного культивирния. - "Микробиология", 1978, с) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИСЛОТОУС- й ШТА 1 Ф 1 ОВ ДРОЖЖЕЙ, предусмат. - й выращивание дрожжей в неых условиях на питательной содержащей этанол в качестве ка углерода, источники азота,микроэлементы, при аэрации снижении рН от. заданного ссе выращивания с последующим кислотоустойчивых штаммов, .ч а ю щ и й с .я тем, что, повышения кислотоустойчивос". мов и скорости их роста, сни- Н в процессе выращивания осуют с 2,5 до 2,0, а отбор устойчивых штаммов ведут при нии максимальной скорости ультуры, равной 0,45-0,6 чИзобретение относится к микробиологической промышленности, а именнок способам получения кислотоустойчивых штаммов дрожжей, способныхразвиваться при низких значениях 5рН, при которых нет развития бактериальной микрофлоры, инфицирующейпроцесс получения кормовой биомассый нестерильных условиях,Иэвестен способ. получения ацидотолерантных штаммов дрожжей СапдЫазсоСН КСНапзепи 2 а апашайа БЦ продуцентов биомассы из гидролиэатовдревесины в хемостате. При значенияхрН 3,0-3,5 получают асоциацию с экономическим коэффициентом 453 как уисходной формы при рН 4,5 1.Ц,Однако экспериментальнополученныештаммы,сохраняемые на сусло-агареи в лиофилизированном состоянии, 20через 6-12 мес утратили способностьроста на гидролизных средах при р Н 3,5и ревертировали кисходным формам.Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности и достигаемо 25му эффекту является способ получениякислотоустойчивых штаммов дрожжей,предусматривающий выращивание дрожжей в непрерывных условиях на питательной среде, содержащей этанол в 30качестве источника углерода, источники азота, фосфора, микроэлементы,при аэрации среды и снижении рН отзаданного в процессе выращивания споследующим отбором кислотоустойчивых 5штаммов 121.Согласно известному способу получают кислотоустойчивый штамм СапйЫапйх 1 з ВКМ У, растущий на этиловом спирте. При проточном культивировании в хемостате, снижая рНпостепенно с 4,5 до 2,6 в течение104 генераций, скорость роста культуры увеличивают от Э , 0,01 тгдо0,3 ч . Из однои клетки, полученной 45юиз этой популяции, выделен штамм, ра. стущий при рН 2,6 со скоростью роста.ф0,3 ч и экономическим коэффи.-4циентом 707. ЫОднако данный способ характеризуется недостаточно низким значениемрН роста кислотоустойчивого штамма,снижением продуктивности при низком значении рНЦелью изобретения является повыше55ние кислотоустойчивости штаммов искорости их роста.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу получения кислотоустойчивых штаммов дрожжей, предусматривающему выращиваниедрожжей в непрерывных условиях напитательной среде, содержащей этанолв качестве источника углерода, источники азота, фосфора, микроэлементы, при аэрации среды и снижении рН от заданного в процессе выращивания с последующим отборомкисдотоустойчивых штаммов, снижениерН в процессе выращивания осуществляют с 2,5 до 2,0, а отбор кислотоустойчивых штаммов ведут при достижении максимальной скорости роста.культуры, равной 0,45-0,6 ч ,Сущность способа заключается вследующем,Процесс ведут в режиме рН-статас постепенным снижением рН с 2,5до 2,0, при автрселекции спонтанновозникшей кислотоустойчивой формыи сохранении культуры, выделеннойиз одной: клетки на жидкой среде прирН 2,0-1,7 и температуре 1-10 С,в коллекции.Сущность метода рН-статного культивирования заключается в том, чтовыращивание дрожжей ведут в ферментере, в среде устанавливают значениерН, замедляющее рост исходной культуры. При росте дрожжей среда подкисляется вследствие использования физиологически.кислого субстрата -сульфата аммония, рН-электрод, регистрирующий это подкисление связанс устройством, открывающим доступтитрующему агенту. Титрующнм агентомявляется питательная среда с рН 6,6.Подача среды автоматически осуществляется по сигналу смещения рН культурой, Культура растет со скоростью,максимальной в данных условиях рН,Культуру, выделенную из однойклетки, сохраняют без потери кислотоустойчивости и без снижения экономического коэффициента на жидкойсреде с этанолом, вместо обычногохранения дрожжей на скошенном суслоагаре, в холодильнике при темпера-отуре 1-10 С. Этот интервал температуры хранения не приводит к гибеликлеток нз-за замерзания и не допускает активной жизнедеятельности,что способствует длительному сохранению жизнеспособности в анабиотическом состоянии, При этом экстремально низкое значение рН 2,0-1,7не убивает клетки в течение нескольких месяцев.1092175 О Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Заказ 3207/16 филиал ППП "Патектфг.Ужгород, ул.Проектная, 4 П р и м е р 1, Дрожжи СапйЫаШх 1 дз ВКМ в 668 (находятся на хранении во Всесоюзной коллекции микроорганизмов с 06.07.73 г.) выращиваютопри температуре 30 С в аэробных ус-. 5ловиях при непрерывной подаче воздуха в количестве 2-3 л/мин и перемешивании мешалкой (400 об/мин) вусловиях рН-стата в 2-литровом ферментере, содержащем 0,5 а средыследующего состава, г/л: спирт 7,0КНРО 1,0;(МН)1 ЯО 1,5; МдЬ 0 0,2микроэлементы, вода дистиллированная.Исходная культура растет прирН,2,5 медленно, скорость роста Э = 5= 0,07 ч" из-за ингибирования роставысокой кислотностью. Через 106генераций рост ускоряется из-за появления более кислотоустойчивого варианта, который вытесняет исходную 20форму, Культивирование ведут до техпор; пока скорость роста рН 2,0 не.достигнет максимального значения.После автоселекции кислотоустойчивой популяции, растущей со ско" у 5ростью роста Э = 0,45 ч и экономическим коэффициентом 70%, из ферментера проводят выделение серийкультур из одной клетки. Проверяютрост методом периодического культи- . З 0вирования в колбах при 200 об/мини температуре 30 С при начальном знао"чении рН 4,5 и 2,2. Значение рН впроцессе роста снижается до 1,7.ПрирН 4,5 исходная и кислотоустойчивая35формы растут одинаково. При началь. -ном значении рН 2,5 с" высокой скоро стью растет только кислотоустойчивыйштамм,Хранение полученной формы осущест. 440вляют на указанной жидкой среде прирН 1,7 в холодильнике при 8 С. Пересевы на ту же среду делают один разв месяц. Полученные формы сохраняютуже более года,45П р и м е р 2, Дрожжи СапйЫа1 ашЬдса ВСБ(промышленный штаммнаходится на хранении во ВНИИСинтез-.белок с 1973 г) выращивают в рН-стате согласно примеру 1. Через 96 гене 50раций в ферментере селекционировалась популяция, растущая при рН 2,0 с экономическим коэффициентом 70%. Вы"деляют культуру из одной клетки и проверяют ее рост при рН 2,0 скорость роста Э = 0,6 чэкономический коэффициент 70%, содержание истинного белка,45%) . Культуру сохраняют согласно примеру 1 при темпе ратуре 3 С.П р и м е р 3. Дрожжи Епйошусев шаршзЫ Унаходятся на хранении в ИБфМ АН СССР) выращивают в режиме рН-стата, согласно примеру 1 на синтетической среде следующего состава, г/л: этанол 7,0; ( М Н) ЬО 1,0; КНРО, 0,1; КН РО, 2,0; Ф 50 0,5 ЯаСВ. 0,1; дрожжевой экстракт :2,5; микроэлементы, Исходная культура при рН 4,0 растет со скоростью, роста 2= 0,12 ч .После автоселекцииБ = 0,12 ч . После автоселекции при постепенном снижении рН до 2,2 через 60 генераций скорость роста культуры увеличивается до Э,= 0,25 ч экономический коэффициент 71%. Культуру сохраняют согласно примеру 1 при температуре 0 С, рН 2,0.Предлагаемый способ позволяет по сравнению с известным получать кислотоустойчивые штаммы дрожжей, растущие на этиловом спирте при низких значениях рН 2,2-2,0 с максимальной скоростью роста,0 = 0,45-0,60 ч экономическим коэффициентом 70% и сохранением кислотоустойчивых культур, .выделенных из одной клетки, в коллекциях.Применение кислотоустойчивых штам мов позволит промьшщенности, производящей кормовые дрожжи на этаноле, получать продукт, не инфицированный бактериями, так как рН 2,0-2,2 лежит ниже уровня кислотности, допуска ющего развитие гетеротрофных бактерий. При этом производительность промышленного процесса не снижается, так как экономический коэффициент и скорость роста полученных вариантов не отличается от таковых исходных форм при рН 4,5, принятом в проььпп. ленности.