Фрагмент днк alv 7, кодирующий синтез альфа-амилазы, способ его конструирования и штамм бактерий bacillus suвтilis продуцент альфа-амилазы

(5)5 С 12 й 1 ОСУДАРСТВЕННЪИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ТОРСКО ИДЕТЕЛЬСТ ательский омышленва, Ю,В. бченко, И. КозГ, Деба 22, с,ИРУЮ, СПО- ШТАММ(71) Всесоюзный научно-исследовинститут генетики и селекции прных микроорганизмов(34) ФРАГМЕНТ ДНК А Ч 7, КОДЩИЙ СИНТЕЗ АЛЬФА-АМИЛАЗЬСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ ИБАКТЕРИЙ ВАСЮЯ 5 ОВТ 1115 -ЦЕНТ АЛЬФА-АМИЛАЗЫ Изобретение относится к микробиологической промышленности и, в частности, к генетической инженерии, и представляет собой фрагмент ДНК, кодирующий" синтез термостабильной а-амилазы, способ его конструирования и штамм В.зцЬ 111 з - продуцент термостабильной а-амилэзы.а -Амилаза - фермент, рэзлагающий амилозную компоненту крахмала, используется в пищевой промышленности для разжижения крахмалсодержащего сырья с целью получения глюкозно-фруктозных сиропов. Кроме того, а -амилэзэ применяется в текстильной промышленности для расшлихтовки тканей, Эти процессы требуют протекания реакций при высоких темпера(57) Изабретение относится к микробиологической промышленности и генетической инженерии, Целью изобретения является повышение термостабильности целевого продукта, Фрагмент ДНК А ч 7 сконструирован нэ основе фрагмента ДНК. кодирую- щего структурную часть гена а-амилазы В.11 с)епИогт 1 з и фрагмента ДНК, содержащего регуляторные элементы а-амилазы В,апу 1 о 11 с 1 цеасепз. Фрагмент А ч 7 кодирует синтез а-амилазы, термостэбильность которой достаточна для промышленного применения. Разработан способ конструирования фрагмента ДНК, кодирующегосинтез термостабильной а -амилазы клетками Вэс 111 цз зцЬ(111 з. Получен штамм Вас 1 Ицз зцЬ 111 з ВКПМ В, являющийся продуцентом термостабильной а-амилазы. 3 с,п, ф-лы. 2 табл. турах (до 105 С), что обуславливает необходимость повышения температуры термоинактивации фермента. Лучшими продуцентами бактериальных разжижающих а -амилэз являются штаммы Вэс 1 Ицз а(пу 1 о 1 щцеас 1 епз или штаммы Вас 111 цз зцЬО 11 з, содержащие фрагмент ДНК, кодирующий а -амилазу из Вас 111 ц з эгпу 1 о.11 с 1 це 1 ас 1 епз, например штамм В. зцЬт 111 з (рВТ 5).Однако инактивация этой а-амилвзы происходит уже при 70 С.Известны штаммы-продуценты а-амилазы: В.зцЬйз ВВВ 89, В.зцЬ(111 з 8 ЯВ 360 и В.зцЬ(111 з ВЯВ 361. Штамм В.зцЬЮ з ВВВ 89 содержит фрагмент ДНК, кодирующий аамилазу из ВасИ 1 оз авуоИсое 1 ас 1 епз, и настыла-амилазы В.ИсЬепИогв 1 з, Для кажидентичен штамму В.зоЬт 11 з (РКТ 5). дого фрагмента ДНК представлена также В.зоЬсИз ВКВ 360 и В,зоЬтИз ВЙВ 361 со- кодируемая им аминокислотная последовадержат плазмиды со слитым геном а-ами- тельность. Последовательности ВКВ 360 и лаза В,аву 1 о 1 цое 1 ас 1 епз - а-амилаза 5 А Ч 7 кодируют полноразмерную зрелую В.Исйеп 0 огв 1 з и обеспечивают синтез фер- форму термостабильной а-амилазы мента с термостабильностью не хуже термо- В,ИсЬеп 0 огвз. однако ВВВ 360 имеет обстабильности фермента из В.ИсйепИогвз, ласть стыковки, различающуюся на 9 нуклеОднако место стыковки последовательно- отидов (соответственно аминокислоты: стей, кодирующих сигнальный пептиди эре валин, аспарагин и глицин), в то время как лую форму а -амилазы не является А Ч 7 только 3 нуклеотида, соответствую- оптимальным по структуре, поэтому продук- щие аминокислоте аланин. Наличие аланиция термостабильного белка составляет на в месте стыковки наиболее эффективно, лишь 17 от продукции мезофильной а- так как эта же аминокислота является лоамилазы (из В.аву 1 оИцое 1 ас 1 епз) в подо следнейаминокислотойсигнальногопептибной конструкции. Штамм ВВВ 360 да а-амилазы В.ИсЬеп 0 огвз,рассматривают в качестве аналога по сход- Для достижения цели используют споству в методе конструирования, структуре соб конструирования фрагмента ДНК А.Ч 7, фрагмента ДНК, кодирующего термоста- кодирующего синтез термостабильной абильную а-амилазу, и термостабильности 20 амилазы, заключающийся в том, что ДИК получаемого белка, плазмиды рЧ 51 гидролизуют эндонуклеазаИзвестен штамм - продуцент а-амила- ми рестрикции Есой и Всо 1, достраивают зы с повышенной температурой инактива- однонитевую ДНК до двунитевой Кленовым ции, в котором произведены мутации фрагментомДНКполимеразы 1 Е.соИ,затем гена а-амилазы В,аву 1 о 1 оеасепз в об смешивают с Есой 1 линкером, имеющим по- ласт; ответственной за термостабиль- следовательность 66 ААТТСС, обрабатываность белка. Термостабильность белка ют ДНК-лигазой фага Т 4, полученной увеличена на 13 градусов, что.однако на смесью трансформируют клетки В,зоЬИз 7 градусов ниже термостабильности а - известногоштамма 21 гесЕ 4 аву 4 трансфор 30 манты высевают на среду с эритромицином,Целью изобретения является повыше- иэ полученных трансфор 4 антов выделяют ние термостабильности целевого продукта. плаэмидную ДНК и гидролизуют эндонуклеЦель достигается использованием азой рестрикции Есой и экзонуклеазойВа 131, продукты гидролиза обрабатываютФрагмент ДНК А Ч 7 кодирует синтез 35 Кленовым фрагментом ДНК полимеразы 1 термостабильной а -амилазы. Этот Е,соИ и ДНК-лигазой фага Т 4, трансформифрагмент получают подстыковкой фраг- руют клетки В.зоЬт 1 з штамма мента ДНК, кодирующего зрелую фор гесЕ 4 аву 4, трансформанты высевают на му а-амилазы Вас 111 оз 1 сЬеп 11 огвз к среду с эритромицином и амилопектиназуфрагменту ДНК, содержащему регу ром и отбирают клоны, продуцирующиеА- ляторные элементы (промотор, об- амилазу. Выбор штамма .зоЬ 3В. о 111 з ласть связывания с рибосомой) гена 21 гесЕ 4 аву 4 в качестве реципиентного а-амилазы в В,аву 1 всоеасепз и кодиру- . обусловлен тем, что этот штамм имеет мутающему сигнальный и ти нальный пептид а -амилазы цию в хромосомном гене а-амилазы и соот- В.аву 1 оИцое 1 ас 1 епз, из плазмиды рйТ 5, 45 ветственно может продуцировать толькоФрагмент ДНК А 1.Ч 7 кодирует синтез а -амилазу, кодируемую рекомбинантной термостабильной а -амилазы и содержит плазмидой. Анализ нуклеотидной последоег ляторные области гена а-амилаэы вательности ДНК полученных плазмид по- В.авуоИцоеасепз; промотор нуклеотиды зволяет выявить плазмиду, сод р щуежа ю 200 - .270), область связывания с рибосомой 50 фРагмент ДНК со структурой А Ч 7. Плазми(нуклеотиды 1055 - 1070) и кодирует сигналь- да, содержащая этот фрагмент и сконструиный пептида-амилазы В,авуоИгое 1 ас 1 епз рованная по предлагаемому способу, (нуклеотиды 1077-1169) и зрелую форму - является плазмидой р Ч 7. Особенность амилазы ВасИоз ИсЬепйогвз (нуклеотиды фРагмента А.Ч 7 состоит в том, что он коди 55 рует оптимизированный синтез термостаФрагмент ДНК А Ч 7 кодирует синтез бильнойа-амилазы. ПлаэмиднаЯДНКР Ч 7, белка, оптимизированного поструктуреоб- полученная таким способом, содержит пороцессинга сигнального пептида, следовательность А.Ч 7, которая может обладающего структурой и термостабиль- быть изолирована на Нпс 1 фрагменте Ди перенесена на любой вектор, имеющий ющей полную зрелую часть а-амилазы. Нпб 111 сайт для клонирования фрагментов В.ИсЬепИога 1 з к последовательности, кодиДНК и способный рэплицироваться в клет- рующей сигнальный пептид а-амилаэыках бацилл, В.ащу 1 оИцце 1 ас 1 епз.Для достижения цели используют 5 Известный фрагмент аглуаву 11 сЫ полштамм В,зцЬ 1 Из ВКПМ В-продуцент учен заменой в последовательности ДНК,термостабильной а -амилазы. Штамм пол- кодирующей мезофильную а-амилазуучают трансформацией клеток В,зоЬОИз В.аглу 1 оИоие 1 асепз, 128 нуклеотидных ос 21 гесЕ 4 эту 4 плазмидой р Ч. татков на гомологичный фрагмент, кодируПолученный штамм депонирован во 10 ющий часть термофильной а-амилазыВсесоюзной коллекции промышленных В.Исйеп 0 опп 1 з. В результате произведенмикроорганиэмов и имеет регистрацион- ной мутации фрагмент ДНК апуавуИсЫный номер ВКПМ 8-4766, обеспечивает синтез и секрецию а-амиШтамм В.зоЬМИз ВКПМ Вхаракте- лазы с термостабильностью, увеличенриэуется следующими признаками, 15 ной на 13 градусов, что однако на 7Морфологические признаки. градусов ниже термостабильности а-амиКлетки прямые, палочковидной формы лазы В,ИсЬепИопп 1 з. а-Амилаза, кодируе 1,2 - 1,6 х 2,0 х 6,0 мкм, подвижные, грэмполо- мая предлагаемым фрагментом ДНК А Ч,жительные, спорообразующие. по своим свойствам молекулярная масса.Культуральные признаки. 20 термостабильность, рН-оптимум) не отличаКлетки хорошо растут на простых пита- ется от а -амилазы В.ИсЬепНопп 3. Послетельных средах. прогрева культурэльной жидкости штамПри росте на мясо-пептонном агаре, пи- мов, продуцирующих а-амилазу, при 90 С втательном агаре "Дифко" колонии шерохо- течении 45 мин сохраняется 95 О амилаэнойватые, круглые, прижаты, серые, край 25 активности при использовании штамманеровный, мутные, В,зцЬИз ВКПМи только 5 О 5 - приПри росте в жидких средах: мясо-пеп- использовании известного В,зоЬт 1 Из ВКПМтонном бульоне, 1:бульоне образуют ров,ную интенсивную муть. Выход белка при использовании штамФизиолого-биохимические признаки. 30 ма В.зиЬИз ВКПМтакой же как и вКлетки растут в пределах от 10 до 50 С случае известного В,зоЬб 1 з. ВКПМ-при оптимуме рН от 6,5 до 8,0, 15 мг/л в условиях ферментации по примеруВ качестве источника углерода исполь,зуют многие углеводы, спирты, органиче- Сравнение продуктивностей штаммаские кислоты, в частности: О-глюкозу, 35 В зоЬтИз ВКПМс аналогом ВЯВ 360Э-фруктозу, глицерин, сахарозу. Хорошо ус- приведено в табл. 1 и 2, Поскольку иэ-завэивают крахмал, недоступности аналога не имеется воэможВ качестве источника азота используют ности произвести прямые измерения, сравкэк минеральные соли в эммонийной и нит- нение произведено косвенно, поратной форме, так и в органической форме 40 литературным данным, через штаммыв виде пептона, аминокислот, В,зеЬОИз ВЯВ 89 и В,зиЬОИз (рйТ 5), являюНитрэты восстанавливают до нитритов;щихся исходными соответственно дляЖелатину разжижают. штэммов В.зоЬОИз 888360 (аналога) иУстойчивость кантибиотикам., предлагаемого штамма В,зцЬт 1 Из ВКПМПроявляется устойчивость к эритроми 4766. Штаммы В.зцЬтИз 88889 и В,зоЬт 111 зцику, обусловленная наличием плазмиды (рВТ 5) содержат фрагменты ДНК, выделенр Ч. ные из В,аглу 1 оИцоеасепз и обеспечиваютНа среде с амилопектиназуром образу- синтез мезофильной а-амилазы, направляют вокруг колоний зоны гидролиза емойсобственными регуляторными элеменПредлагаемый штамм В.зцЬИз ВКПМ 50 тами, поэтому их активность принята эа8-4766, содержащий рекомбинантную плаэ О, Штаммы В.змЬЮИз ВЯ 8360 и 8-4766миду р Ч, полученную на основе Фрагмен- содержат фрагменты ДНК, полученные ната А Ч, характеризуется более высокой основе фрагментов ДНК иэ соответс-веннотермостабильностыю продуцируемой а- штаммов В,зиЬт 113 ВЯВ 89 и В,зцЬ 11 Изамилазы, по сравнению с известным 55 (рВТ 5).В.зоЬОНз ВКПМ 8-4632, Эффект получен за Определение активности а-амилазысчет того, что в предлагаемом фрагменте производятизвестнымспособом, ТемпераДНК А Ч произведена оптимальная под- турный оптимум для а-амилазы, кодируе.стыковкапоследовательностиДНК,кодиру- мой фрагментом ДНК А 1.Ч, составляет5 10 15 20 30 40 45 50 55 75-85"С. Меньшая продуктивность штамма, синтезирующего термостабильную а -амилазу связана с меньшей удельной активностью термостабильного белка из В.ИсЬепИогглз. измеренной в неоптимальных условиях (37 С).Б р и м е р 1, Конструирование фрагмента ДНК АУ/7, кодирующего синтез термостабильной а -амилазы,Клетки бактерий В.мЬИз (рЧ 31), содержащие плазмидную ДНК рЧЯ 1, выращивают в 10 мл 1-бульона (триптон 10 г/л; дрожжевой экстракт 5 г/л; ЙаС 10 г/л; рН 7,5) с добавлением эзоитромицина (0,02 мг/мл) до титра 1 х 10 кл/мл, Клетки осаждают центрифугированием (5000 д, 5 мин, 4 С) и ресуспендируют в 0,1 мл лизирующего раствора (лизоцим 2 мг/мл; трис-НО (рН 8,0) 25 мМ; ЭДТА 10 мМ; глюкоза 50 мМ), выдерживают 5 мин при 0 С,Далее прибавляют 0,2 мл раствора (йаОН 0,2 М; додецилсульфата натрия 1%) и перемешивают до просветления лизата. 150 мкл раствора уксуснокислого натрия (рН 4,8) вносят в осветленный лизат, осторожно перемешивают до заметного снижения вязкости 1.:.створа, выдерживают 1 ч при 4 С и образовавшийся осадок отделяют центрифугираванием (1000 д, 5 мин, 4 С). К полученному супернатанту добавляют 2,5 объема охлажденного при -40 С этилового спирта и выдерживают при -40 С. Образовавшийся осадок плазмиднвй ДНК собирают центрифугированием (5000 д, 5 мин, 20 С 0) и ресуспендируют в 0,2 мл буфера (10 мМ трис-НС 1 (р Н 8,0), 1 мМ ЭДТА).ДНК плазмиды ЬЧБ 1 подвергают гидро- лизу эндонуклеазами рестрикции Есой 1 и Вд 11 в буфере, содержащем 50 мМ трис-НО (рН 7;6), 50 мМ йаС 1, 10 мМ МдО 2, 1 мМ 2-меркаптоэтанол, "Липкие" концы полученных фрагментов достраивают до доунитевой ДНК Кленовым фрагментом ДНК полимеразы 1 Е.соИ в буфере, содержащем 50 мМ трис НО(рН 7,5), 10 мМ МдС 12, 10 мМ ДТТ, 10 мкг/мл АТФ, затем обрабатывают ДН К-лигазой фага Т 4 в буфере, содержащем 50 мМтрис НС 1(рН 7,5);10 мМ МдС 2,10 мМ ДТТ, 10 мкг/мл АТФ, и смесью рекомбинантных молекул трансформируют компетент,ные клетки В.зцЬ 111 з 21 гесЕ 4 аау 4, трансформантц высевают на агаризованную средуВ С эритромицином, ДНК плазмиды, выделенной из клеток-трансформантов, подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции Есой 1, и в буфере, содержащем 20 мМ трис НС 4 рН 8,1), 12,5 мМ МдС 12, 12,5 мМ СаС 12, 0,6 М МаО, 1 мМ ЭДТА. - экзонуклеазой ВаЬ 1. После обработки ДНК Кленовым фрагментом.дНКполимеразы 1 Е.соИ и ДНК-лигазой фага Т 4, полученной смесью трансформируют клетки В,зцЬИз 21 гесЕ 4 атпу 4, трансформанты высевают на среду с эритромицином и амилопектиназуром и отбирают клоныйроду-., цирующие а -амилазу. Плазмидную ДНК, выделенную из клеток-трансформайтое проверяют на наличие в сзставе большего Н 1 пб 11 фрагмента последовательности Я 1 Ч 7, Анализ последовательности ДНК проводят методом дидезокситерминаторов Сэн гера,П р и м е р 2, Получение штамма В.ыЬОИз ВКПМ В.Ночную культуру клеток В.зоЬО 1 з 21 гесЕ 4 аглу 4 разводят в 10 раз в 10 мл бульона Спицайэена (К 2 НР 04 18,3 г/л; КН 2 РО 4 6 г/л; (ИН)2304 2 г/л: натрий лимоннокислый 1,2 г/л; глюкозы 0,5%; каэаминовых кислот 0,2 г/л; дрожжевого экстракта 1 г/л; МдБ 04 50 мг/л) и культивируют 4,5 ч при 37 С с аэрацией, 1 мл полученной купьтурц смешивают с б мл бульона Спицайзена и культивируют в тех же.условиях 1;5 ч, К 1 мл полученных компетентных клеток добавляют ДНК плазмидь р Ч 7, инкубируют ЗО мин при 37 С без встряхивайия, разводят в два раза средойВ (триптон 10 г/л; дрожжевой экстракт 5 г/л;.ИаС 10 г/л; рН 7,5) с добавлением эритромицина (0,02 мг/мл) и культивируют 30 мин при.интеНсивной аэрации при 37 С. Трансфо.рманты в.ысевают на ага ризован ную седу 1.В с эритромицином (20 мг/мл) и амилопектйназуром (0,15%). Отбор трансформантов производят по наличию зон гидрелиза амилопектиназура. Клетки, получеййые таким образом, несут плазмиду рЮ 7:и являются клетками штамма В.зцЬ 13 ВКЙМ В.П р и м е р 3. Ферментация штамма ВяЫИз ВКПМ В, получение термостабильной а-амилазц и оценка ее термостабильности, "Культуру штамма В.зоЬО 11 з ВКПМзасевают петлей в пробирку со средой .В (триптон 10 г/л; дрожжевой экстракт 5 г/л; йаО 10 г/л.; рН 7,5) с добавлением эритромицина (20 мг(мл) и выращивают при 37 С в течение йочи при сильной. аэрации. Ночную культуру разводят в 100 раз средой 1.В с добавлением мальтозц (до 2%), СаС 12 (до 10 мМ), МдС 12(до 10 мМ) и эритромицина (до 20 мгмл) в обьеме 250 мл и проводят ферментацию в течении 48 ч при 37 С в колбах при интенсивной аэрации, По окончании ферментации клетки осаждают центрифугированием(10000 д, 15 мин), а в надосадочной жидкости проверяют уровень амилолитической активности по стандарту. Активностьфермента, полученного таким образом, по- точников, таких, например, как а-амилаза вышается до 0,8 ед/мл, В.сЬепИогаз, что позволяет проводитьДля проверки термостабильности й- гидролиз крахмала при 85 - 95 С без потери амилазы, синтезируемой клетками его активности и при 105 С (при пов .зиЬО з ВКПМ, 100 мкл супернатанта 5 ном давлении) в течение времени, необхоклеток делят на 4 части и прогревают О, 15, димого для разжижения крахмала.ЗО и 45 мин при 90 С. Затем определяют Полученный положительный эффект активность а -амилазы, для чего образцы предлагаемых изобретений достигается за. инкубируют с 300 мкл 1 -ного раствора счет свойств сконструированного фрагменамилопектиназура, 0,03 М Асйа, РН 8,0, 4 10 та ДНК АЫ 7, кодирующего синтез термо- мМ СаСг при 37 С в течение ЗО мин. Затем, стабильной а -амилазы, Предлагаемый раствор разбавляют до 1,3 мл водой, цент- фрагмент ДНК позволяет также конструирорифугируют при 12000 об/мин и проверяют вать штаммы других микроорганизмов. крооптическую плотность супернатанта при ме В,зоЬйз про3, продуцирующие термоста нм. Она должна быть одинаковой у каж бильные а-амилазы,дой пробы, что свидетельствует о термоста- Формула из бормулаизобретения бильности фермента, кодируемого 1, Фрагмент ДНК АО/7, ко и ю ий фрагментом АЮ 7.т, кодирующийсинтез альфа-амилазы, содержащий регуляПредлагаемые изобретения позволяют торн ые зле менменты гена а-амилазы повысить термостабильность а-амилаэы, сек В.агпуоИрце 1 ас епз. гпу о рце ас епз и структурную часть геретируемой клетками В,зоЬйз. Термоста- на а-амилазы В.11 сйеп 0 огабильность п о и мь Р дуц РУемого фермента не ной последовательностью фрагмента ДНК. с еп ога з с нуклеотидотличается от термостабильности лучших . А щферментов, выделенных из природных исцаса 1 ссцсааацдцсдсаСсаадйа 1 сацсассаасаадсдцддсаа 50 цсассссдса 1 ацдаааадас 1 цдс 1 дааааса 11 цадсс 111 ца 1 цас 1 100 дасдасссццс сцаадаацсцда 1 сда 1 д 11 дацаааацаацаадасс 150 аааааа 1 асс 11 цс:цссассацасацдц 1 а 1;111 асдссд 1 ссад 200 асд 1 ссдсц 1 д 1 ааАаааацдаа 1 аааддццццд 11 аС 1 аФ 111 а 250 сца 1 а 1 дсааааасаа 11 д 1 ааадаааадацдаа 1;дас 1 ссаас 3 00 ацаадц 1-.аСцсадааасссСдацасСЕдсацса З 50 цс 1 ссассда 111 дадаасцасадсдас 11 ссцсссацссц 1 цссадд 4 00 дссдсссацаСсацдадссцс 1 саасдсдсцасасдссс 450 дс 1 да 11 асцсцсадсссс 11 сацдсддда 1 сасасадсдцссодс 500 сассдссассаасассоссасдссаааддцсдасацсаддсЕсасаада 550 сцссссоцсдсдссасадсдсц 11 сассдаа 1 асддсцсаасаассдС 600 сссссддадас 1 цссаасцсд 1 аааасацссадсдс 1 дцсцсда 11 оц, 650 ссссдаса 1 ацссссас 1 ц 1 сд 1 ссаФ 11 ссдсцсацасдацосцссо 700 ссдсссдцс 1 цса 1 дсдсцадцассдассдсддссдацссссссоад 750 сцасдсоааа 1 сдЬдссцадцссаасдссса 1 аа 1 дсцдцссц 11 дсссд 800 цса 1 ссаасдссо 1 сацдсса 1 а 1:саа 1 да 1111 с 1 ццсдсдассцд 850 ц 11 дадаадсдд 1 дсаад 1 даас 1 дсад 11 дсса 1 ц 111 асддсад ца 900 цадсадацаСадсцс 1 дад 1 ссддсдд 1 дсс 111 цссц 1 асдсассас 950 сссдВсадсодссцоасоддодддасадс 1 дасоцаоасодаодссосд 1000 цадсасс 1;саоааосассосососос 1 ооосацсоад;ддспдса 1.с 1050 ассадаааа 1 дададццадацдааасаВда 11 сааааасдааацсцдаса 1100 ц 111 сд 1 садас 1 д 1 дс 11 а 1 д 1 дсасдс 1 д 11 а 11 цссад 1: дсс 1150 дас 1 асаааааса 1 садсддсддсаааВс 11 аасдддасдссцасдсац 12001717633 а 111 даа 1 дд 1 аса 1 дсссаа 1 дасддссааса 11 дцаацсдс 11 цсаа 1250 аасцас 1 сддса 1 а 111 ддс 1 цаасасдц 1 а 11 асцссдт;с 1 ддаст;сс 1300 сссддса:а 1 ааццдаасдацссаадсцца" дсдддс 1 асдд 1 дс 11 асд 1350 асс 111 а 1 ца 111 аддцдад 11 са 1 сааааацддасдц 1 сцдасааад 1400 Сасдцсасаааадцацадс 1 дсаа 1;с 1 цсца 1 саааад 1 с 11 саСсссд 1450 сцаса 11 аасц 111 асддцца 1 д 1 ццсса 1 саассасааацдсддсдсц 1500 ацсдассдаада 1 д 1 аассцсдц 11 даад 1 сца 1 сссцс 1 дассдсаас 1550 сдсдсаасс 1:садцацаасассцаа 11 ааацсс 1 ццасаса 1111 са 1 1600 т;ссцццдсдсцдсацсаса 1 асацсдасФссааа 1 дцса 11;цц 1 асса,1 16 50 сСцасдцаассцадццасцад 1 сссцааадсцаассдса;са ц 1700 11 саадцаааццс 11 ддца 1 дццаац 111 ссаасдаааасцдсаас 1 а 1750 адат;т:а 111 цасцса 1 дссдаса 1 сцаст;а 1 дасса 1 сс 1 да 1 ц 1 сдсад 1800 сацааа 1 Саацада 1 цдцдсас 11 цц 1 а 1 цссаа 1 цаасдсаа 11 дцас 1850 ддссдсЬйдацссдссааасаса 1 ааас 1:1 цсццца 1900 т,сдцд 11 аа 1 са 1 ц 1 садццаааааасцдццаацдааа 1 ц 11 асцдсац 1950 с 1 цаа а 1:1 дцсадаа 1 цас 1 цццсцсцс 1 ццаааасса 11 цаасааа 2000 асааасс 1:1;ааса 11 сац 1 ц 11 цасдцссцс 1 са 11 асацс;сса 2050 1 ".ц ссассцасасаццдаццсдцс са;даа цацдааа 11 цссцааса 2 100 цасцдсцссаадса 1 ссдцааацсццаса 11 ц 1:сда 1 аас 2150 сада 1 асасацссддцдсаассдс 11 дадссцас 1 ц 1 ссаааса 1 цц 1 2200 1;аацссцс 1 цс 11 асдс: -.1;ас 1 ссасаацддаат:с 1 дда 1 ассс 1 с 2250 ацц 111:с 1:асццдцаса 1 д 1 асцддасдаааццадас ссссацсцсдаа 2300 ат;ссс 1 дсс 1:1 цааасасаааас сдаассда 1;с:1 аааадсдадааааса 2350 д 1 а 1 дсд 1 асддацсасацсаца 1;1 а 111;сцассасса 1 даса 11 д 1 сд 2400 цс 1 ццасаацццааццсдасацс 1 сцц 11 дсааа 11 сацц 111 дцсццса 2450 1 аа 1 аасадасцдасссцц 1 дцццсааацсцаа 1 ц 1 а 1 д 1 сццссццса 2500 ааасцссцц 1:цацаса 1 ддсасдасас сассццааассд 11 сццадесдц 2550 ст:дт;са 1 саа 1сцдааддссдддцадац 1 йсасдааасдцсддсфац 2 б 00 ц 11 сааЫ 1 а 1 д 11 сааадасацаададсацацаддасдда 1 ссда 2650 адцааа 1 ссд 111111 а 1111:дсссц 1 с 11 а 1 ааа 111.с 111:да 11 аса 2700 1 т;а 1 аа 1 Ьаа 11 ст;аасааад 1 д 1 са 1 садссс 1 саццаацдас 11 цс 2750 1 цасад 11 цаа 1 сцса 1 ацц 1 ааддсдцдца 1 цааа 1 ддсаасц 11 а 1 с 2800 1 цаСд 1 ацсааадааадсааа 1 д 1 д 1:сдаааа 1 дасцд 1 а 1 сдсцддда 2850 1 са. 2, Способ конструирования фрагмента ДНК АО/7, кодирующий синтез альфа-амилазы, эаклачающийся в том, что ДНК плаэмиды рЧ 31 гидролизуют зндонуклеаэами рестрикции Есой и Воб, достраивают концы ДНК до двунитевых Кленовым фрагментом ДИК полимеразы 1 Е,соб, смешивают с Есой 1 линкером, имеющим последовательность ООААТТСС, обрабатывают ДНК-лигаэой фага Т 4, полученной смесью трансформируют клетки ВлцЫИэ штамма 21 гесЕ 4 аеу 4, трансформанты высевают 55 на среду с эритромицином, из полученныхтрансформантов выделяют плазмидную ДНК, гидролиэуют эндонуклеазой рестрикции Есой 1 и экзонуклеазой Ва 1231, продукты гидролиза обрабатывают Кленовым фрагментом ДНК полимераэы 1 Е.соб иТаблица 1 Таблица Составитель В.Баев Техред М.Моргентал ктор Н,Король бак еда ктор Тираж Подписноенного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 3035, Москва, Ж, Раущская наб;, 4/5 Заказ 853 ВНИИПИ Госуд ельский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Производственн 13 1717633 14ДНК-лигазой фага Т 4, полученной смесью амилазу, из которых выделяют плазмиднуютрансформируют клетки В,зоЬ 1 в ДНК, включающую фрагмент ДНК ИМ 7,21 гесЕ 4 агпу 4, трансформанты высевают на 3. Штамм бактерий ВасЬз зцЬ 1 зсреду с эритромицином и амилопектиназу- ВКПМ В-продуцент а- амилазы.ром, отбирают клоны, продуцирующие а