Способ получения лошадиного и -интерферона

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 51)5 С 2 Н 15/20 Т АТЕНТУ радиоактивно мар.ловека с выделеоследовательносК в случае М-ин ЦС 9 с последукг к ДНК в вектор. 322 с получением д, в случае мощь нов ч инг ваннь осится к биоте ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР САНИЕ ИЗ(71) Берингер Ингельгейм Интернациональ ГмбХ (ВЕ)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛОШАДИНОГО 0 и"ИНТЕРФЕРОНА(57) Изобретение относится к биотехнологии, Получают ген библиотеку ДНткани печени лошади, осуществляют Изобретение отн хно логикСпособ получения лошадиного 06- ц -интерферона заключается в том, %го ткань печени лошади инкубируют в присутствии буфера, рН 8,0, экстрагируют ДНК с использованием фенола пиализом и осаждением ДНК этанолом, полученную ДНК центрифугируют при 40000 об/мин в буфере, рН 8,0, диапизуют и осаждают этанолом ДНК длиной более 50 к,Ь. (пар оснований), кото рую подвергают частичному перевариванию эндонуклеазой Бап ЗА в присутствии буфера, рН 7,5, полученные фрагменты фракционируют путем элект рофореза, выделяют фрагменты длиной 10 23 кЬ которые после дефосфориф лирования клонируют в векторе нием гомологенных итей, клонируют к ДНтерферона в вектор рщим реклонированиемрагр АТЕК 103 и рВКэкспрессионных плазми-интерферона клонируют к ДНК в вектор р 1 С 9, реклонируют фрагмент к ДНК, кодирующий/ -интерферон в плазмиду рагрАТЕК 103 и конструированием экс прессионной плазмиды рАН 62, полученные плазмиды экспрессии трансформи руют в штамм бактерий Е.со 11 1 М 101, трансформанты культивируют с после дующим выделением и очисткой целевого продукта, 2 зп, фг.лы, 1 табл,ЕМВ 1,3(-ЗА), полученную ген-библиоте"ку ДНК подвергают скринингу с помощью радиоактивно маркированных интерфероновых генов .человека с выделением гомологичных последовательностей, при этом для получения М антерферона Н 1 пд 111-Фрагмент клонаЕК-М лигируют с гидролизованным спомощью Яша 1 и дефосфорилированнымвектором рБС 9, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют бактерииЕзсЬегсЬа со 11 1 М 101 и отбирают устойчивые к ампициллину клоны, содержащие ппазмиду рАН 50, далее плазмидурАН 50 обрабатывают Ндпй 111-эндонуклеазой и лигируют с обработаннымиполинуклеотидкиназой ЯрЬ 1; связ ками,получают плазмиду рАН 51, плазмидурАН 50 гидролизуют Рш 11, лигируют19 . 16429о ого натрия5 глицер"нрН 4 6) Реакцию прекращают путемдобавления ЭДТА, экстрагируют фенолом и хлороформом и ДНК осаждаютэтанолом, Полученную ДНК с тупымиконцами лигируют со смесью олигонуклеотидов 12-мера 5 -АССХфГАААСАТС/и 8-мера 5 -САТСТТТА, образовавшую"ся ДНК оазрезают Н 1 пй 11 и БРЬ 1.ДНК-фрагмент длиной 1,1 к,Ь, выделяют из агарового геля и лигируют сплазмидой рагрАТЕК 103 р разрезаннойпо Н 1 пй 111- и БрЬТ-сайтаме Послетрансформации Е, со 11 НВ 101 получают54 колонии, Из 9 изолированных изних плазмидных ДНК выделяют фрагментЕсоК 1 - Ба 11 длиной 1,3 к,Ь который подвергают анализу последовательностей по .методу Сангера, Полученную из него плазмиду обозначаюткак рАН 62, Она позволяет осуществлять эффективную экспрессию зрелогононадиногоинтерферона н Е,со 11,П р и м е р: 3 Экспрессия интерферо но вой акти вно сти штаммомЕ.со 11 НВ 101, содержащей экспрессионную плазмиду рАН 52, рАН 52/2,рАН 53 или. рАН 62100 мл бактериальной культуры инкубируют при 37 С при интенсивномвстряхивании вплоть до указанной втаблице оптической плотности при600 нм в следующей, не .содержащейтриптофана, среде (на 1 л среди):10 г фосфата аммония, 3,5 г гидрогенфосфата калия, рН 7,3, 0,5 гхлористого натрия, 21 г СаБ-аминакислот (ки слотно-гидрализ ованных),11 г глюкозы, 1 мИ сульфата магния,0,1 мМ хлористого калия, 1 мг тианина-НС 1, 20 мг 1-цистеина, 20 мг3-3-индолакриловой кислоты (индуктора триптофанового оперона), Крометого, среда может еще содержить 50100 мг ампициллина, Затем бактериицентрифугируют в течение 5 мин при4000 об/мин, суспендируют в охлажденной льдом среде 50 мМ трис-НС 1, рН8 0 и 30 мИ хлористого натрия, взятойр50в количестве 1/10 объема культуры,ипри охлаждении во льду в течение30 с дважды обрабатывают с помощьюультразвука (20 кГц, 100 В). Остаткиразрушенных клеток удаляют в течение10 мин при 10000 об/мин (4 С) и после стерильной фильтрации надосадочную жидкость исследуют на интерфероновую (ИФ) активность в общеприня. 5620том опыте для определения цитопати ческого эффекта везикулярного вируса стоматита (ВВС) или вируса энцефаломиокардита (ВЭЦК) .Результаты представлены в таблице,Титр на А 549-клетки нормирован в международных единицах с использованием человеческого интерферона.Фо рмул а из обретения: 1Способ получения лошадиного 0- и 1-интерферона, заключающийся в том, что ткань печени лошади инкубируют в присутствии буфера, рН 8,0, экстрагируют ДНК с использованием фенола, диализуют и осаждают ДНК этанолом, полученную ДНК центрифугируют при 40000 об/мин в буфере, рН 8,0, далее диализуют и осаждают этанолом ДНК длиной более 50:к.Ь., которую подвергают частичному перевариванию эндонуклеазой БаиЗА в присутствии бу" фера, рН 7,5, полученные фрагменты фракционируют электрофорезом, затем выделяют фрагменты длиной 10-23 к,Ь дефосфорилируют и клонируют в векторе ЕИВ 1.3(-ЗА), полученную ген биб лиотеку ДНК подвергают скринингу с помощью радиоактивно маркированных интерфероновых генов человека с вьг делением гомологичных по следо ватель" ностей, при этом для получения 0-интерферона Н 1 пй 111-фрагмент клона Е 8-0 Р 1 лигируют с гидролизованным с помощью Бша 1 и дефосфорилированным вектором р 11 С 9, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют бактерии ЕзсйегсЬа со 11 ТИ 101 и отбирают устойчивые к ампицилпину клоны, содержащие плазмиду рАН 50, далее плазмиду рАН 50 обрабатывают Н 1 пй 111- эндонуклеазой и лигируют с обработанными полинуклеотидкинаэой БрМ-связ ками, получают плазмиду рАН 51, плазмиду рАН 50 гидролизуют Рщ 11 р лигируют с оли гонуклеотидом 5 -ТСТСАССТСССТСАС, который предвари тельно обрабатывают полинуклеотидкинаэой, денатурируют ДНК кипячением, удлиняют олигонуклеотидную затрав ку с помощью фрагмента Кленова в присутствии дАТРр ИСТР, ВСТР и дТТР, удаляют 3-выступ инкубацией с Т 4 ДНК-полимеразой в присутствии 6 АТР, дСТРр ИСТР и ЙТТР, далее фрагмент лигируют с олигонуклеотидами,642956 222-мером 5-ЛССТТЛЛЛСЛТС и 8-мером5 -САТСТТТА, полученную ДНК обрабатывают эндонуклеазами Ннй П 1 иВя 111, и Фрагмент длиной 90 к,Ъ.лигируют с гидролизованным Н 1 пй П 1и Вя 111 вектором рАН 51, полученнуюпл аз миду р АН 5/2 о бр аб аты в ают ЯрЫи Нкпс 111 и лигируют с Н 3.пс ТП -Ярй или Н 1 пй 1 Т 1 - ВашТ фрагментомплазмиды рагрАТЕК 03 с получениемэкспрессионной плаэмиды рАН 52 илирАН 52/2, или плазмиду рАН 52 гидролизуютэндонуклеазами ЯрЬ и ЕсоК 1, затупляют концы ДНК с помощью фрагментаКленова в присутствии ЙЛТР, ИСТР,ОСТР и сТТР, получают ДНК длиной, к,Ъ затем плазмиду рВК 322переваривают с помощью Рчи 11 и ЕсоК 1,затупляют концы ДНК с помощью фрагмента Кленова и дефосфорилируют сполучением ДНК длиной 2,4 к,Ь., которую лигируют с ДНК длиной , к,Ь.с получением экспрессионной плазмиды рАН 53, для получения 0-2-интер 25ферона плазмиду рКН 63, получаемую путем субклонирования рестрикционногофрагмента ЕсоК 1 длиной 3,3 к,Ъ. излямбда клона Е 8-Й 6 в ЕсоКТ сайтплазмиды рТС 8, обрабатывают Вя 111 и 30Ваш 111 и получаемый при этом фрагмент ДНК длиной ,0 к,Ь., содержащийкодирующую последовательность для2-интерферона 64 й аминокислоты,лигируют с большим Фрагментом, содер" 35жащим плазмидный вектор, промотор икодирующую последовательность дляпервых 63 аминокислот зрелого интерферона, который получают в результате обработки В 8111- и ВашН 1-плазмиды 40рАН 52/2, дефосфорилируют с помощьюфосфатазы телячьего кишечника, продуктом лигирования трансформируютбактерии Е всЬег сЬ а со 1 д И01 сполучением э кспрессионной плазмиды 45рАН 55, а для получения (3-интерферонаРчо 11-фрагмент отобранного клонаЕ 8-6 лигируют с гидролизованным спомощью Яша 1 и дефосфорипированнымвектором рОС 9,. полученными рекомбинантными ДНК трансформируют бактерииЕ.со 1 д ТМ О и отбирают устойчивыек ампициллину клоны, содержащие плазмиду рАН 60, затем плазмиду рАН 60обрабатывают Н 81 АТ-эндонуклеазой ипосле выпрямпения 3 выступающихконцов ДНК с помощью Т 4-ДНК полимеразы тупые концы лигируют с обработанными полинуклеотидкиназой ЯрЬТ-связ ками, ДНК гидролизуют ЯрЫ и Нхпй 1 Т 1,полученный фрагмент длиной ,85 к.Ьлигируют с разрезанной Н 1 пй 1 П иЯрЬТ плазмидой рагрАТЕК 03, полученную плазмиду рАН 6 обрабатываютВапН 1 и Яа 11 с получением фрагментадлиной ),3:к,Ь., который лигируют спереваренной ВашН 1 и ЯаП ЧЗшр 9-фаговой ДНК, полученную однонитевуюДНК лигируют с олигонуклеотидом5 -СТСАЛСТАТСАСТТС, который предва1рительно обрабатывают полинуклеотидкиназой, затем денатурируют ДНК кипячением, удлиняют олигонуклеотиднуюзатравку с помощью фрагмента Кленовав присутствии дЛТР, аСТР, ЙСТР ийТТР и осаждают, оставшиеся однонитевые участки ДНК переваривают с помощью Я 1-нуклеазы и ДНК с тупыми концами лигируют с олигонуклеотидами,2-мером 5 -АССТТЛААСЛ 6 и 8-мером5 САТСТТТА, полученную ДНК обрабатывают эндонуклеазами Нкпс 111 и ЯрЫ,Фрагмент длиной , к,Ъ лигируют сНпй 11 - ЯрЫ фрагментом рагрАТЕК 03с получением экспрессионной плазмидырЛН 62, экспрессионными плазмидамитрансформируют штамм бактерии Е,со 1. ТИ О, культивируют штаммы-продуценты в жидкой питательной среде, выделяют и осаждают белок из культуральной жидкости с .последукщей очисткойхроматографией,2Способ по и отличающ и й с я тем, при полученииО-интерферона осаждение белка осуществляют путем добавления сульфата аммония до 657. го насыщения центрифугирования и диализа, а очистку проводятдвустадийной колоночной хроматографией с использованием на второй стадии моноклонального лошадиного интерферонового иммуноглобулина с последующей элюцией связанного с антителоминтерферона раствором, содержащимлимонную кислоту, доведением рН до4,5 и хроматографией полученного сунернатанта на катионите и элюциейраствором ацетата аммония,3Способ по .п,2, о т л и ч а ющ и й с я тем, что при получении-интерферона выделение белка проводят путем добавления сахарозного буФера, содержащего лизоцим, центрифугирования, добавления к супернатантуполиэтиленимина и повторного центрифугирования, а осаждение проводятдобавлением к надосадочной жидкостисульфата аммония 503, трехкратнымцентрифугированием суспендированиемполученного осадка в буферном расе"воре с добавлением полиэтиленгликоляпосле первого центрифугирования и вТест система: КВ.-б-клетки (АТСС ССЬ 57, клетки эпидермисакожи лощади)/ВВС; клетки А 549 (АТСС ССЬ 185, клеточная линиярака легких человека)/ВЭЦК,Е.со 11 НВ 101, Оптическая Иф актйвность, ед/л культурысодержащий плотностьплазмиду при 600 нм БВЬ-б/ВВС А 549/ИЭЦК 1,8 х 102,Ъ 10 б18 х 101 х 10 ф 5,2 х 10Ф7,6 х 106,2 х 10 ф. 2,6 х 10 Редактор Л,Пчолинская Заказ 1153 Тираж 386 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раущская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 10 рАН 52 4,2рАН 52/2, б е Обь 0РАН 53 , 5,75,7рАН 62 3,03,0Н 812 (фс 2 С-интерферон,стандарт)642956сахар.озном буфере после второго, с последукщей очисткой центрифугирцва.вием, аффинной хроматографией с использованием сахарозного буфера и хроматографией с обратной фазой,Составитель: Т,ЗабойкинаТехред М,Дидик Корректор:Л,Пилипенко316429 олигонуклеотидом 5-ТСТСАССТСССТСЛС, который предварительно обрабатывают полинуклеотидкиназой, денатурируют ДНК кипячением, удлиняют олигонуклеотидную затравку с помощью фрагмента Кленова в присутствии,ИМАТР, йСТР, ИСТР и йТТР, удаляют 3 -выступ инкубацией с Т 4-ДНК-полимеразой в при сутстнии ЙАТР, с 1 СТР, дСТР и 1 О йТТР, далее фрагмент лигируют с олигонуклеотидами, 12-мером 5 -АССТТАААСАТС и 8-мером 5 -САТСТТТА, полученную ДНК обрабатывают эндонуклеазами Н 1 пй 111 и Вд 1 11 полу ченный фрагмент длиной 190 к,Ь. лигируют с гидролизованным Нпд 111 и Вя 1 11 вектором рАН 51, полученную плазмиду рАН 51/2 режут БрЬ 1 и Н 1 п 4 ТП и лигируют с Нз.пй 111 - 20 БрЬ Т или Нпй П 1 - ВашН. Т фрагментом плазмиды рагрАТЕК 103 с получением экспрессионной плазмиды рАН 52 или рАН 52/2, или плазмчду рАН 52 гидролизуют эндонуклеазами БрЬ 1 и 25 ЕсоКТ, затупляют концы ДНК с помощью фрагмента Кленова в присутствии ИМАТР, ИСТР, ИСТР и йТТР, получают ДНК длиной 1,1.кЬ плазмиду рВК 322 переваривают с помощью Рчц 11 и 30 ЕсоК 1, затупляют концы ДНК с помощью фрагмента Кленова и дефосфорилируют с получением ДНК длиной 2,4 кЬ которую лигируют с ДНК длиной 1,1 к.Ь. с получением экспрессионной плазмиды35 рАН 53, для полученияинтерферона Рчи 11-фрагмент отобранного клона Е 8-6, лигируют с гидролизованным с помощью Бтаа 1 и дефосфорилированным вектором рПС 9, полученными рекомби нантными ДНК трансформируют бактерии Е,со 11 1 М 101 и отбирают устойчивые к ампициллину клоны, содержащие плазмиду рЛН 60, затем плазмиду рАН 60 обрабатывают Нд 1 А 1- эндонуклеазой и45 после выпрямления 3 -выступакцих концов ДНК с помощью Т 4 ДНК полимеразы тупые концы лигируют с обработанными полинуклеотидкиназой БрЬ 1-связками, полученную ДНК режут БрЬ 1 и Нпй 11 Т, полученный фрагмент длиной 1,85;к,Ь, лигируют с разрезанной Нпй 111 и БрЬТ плазмидой рагрАТЕК 103, получен.ную плазмиду рАН 61 режут ВапНТ и Ба 11 с получением фрагмента длиной 1,3 к,Ь которцй лигируюг с перева" ренной ВашН 1 и БаП М 13 шр 9-фаговой , ДНК, полученную однонитевую ДНК лигируют с олигонуклеотидом 565 -СТСААСТЛТСАСТТС, который предварительно обрабатывают полинуклеотидкиназой, денатурируют ДНК кипячением,удлиняют олигонуклеотидную з атравкус помощью фрагмента Кпенова в присутствии сАТР, дСТР, ИСТР и ДТТР и полученную ДНК осаждают, оставшиеся однонитевые участки ДНК переваривают спомощью Б 1-нуклеазы и полученную ДНКс тупыми концами лигируют с олигонуклеотидами, 12-мером 5 -АССТТААЛСАТСи 8-мером 5 САТСТТТА, полученную ДНКобрабатывают эндонуклеазами Нжй 111и БрЬТ, полученный фрагмент дпиной11 к,Ь. лигируют с Ндпй 11 - БрЬТфрагментом рагрАТЕК 103 с получениемэкспрессионной плазмиды рАН 62, полу"ченными экспрессионными плазмидамитрансформируют штамм бактерии: Е, со 1. 1 М 101 и трансформанты культивируют с последующим выделением иочисткой конечного продукта,1П р и м е р 1 Получение экспрессионных плазмид рАН 52, рАН 52/2 ирАН 53,Стадия А, Выделение лошадиной ДНК,Замороженную ткань печени лошадиразмалывают в жидком азоте до порошка и в течение 3 ч при 55 С инкубируют в 0,5 М этипендинитрилтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1 О мМ трисНС 1, рН 8,0, .0,5% додецилсульфатанатрия (ДСН), 0,1 мг/мл протеиназы К(20 мл/г ткани), Полученный вязкийраствор освобождают от белка путемэкстракции фенолом и трехкратнойэкстракции смесью фенола с хлораформом и изоамиловым спиртом(25;24:1 по объему), диализуют против буфера 50 мМ трис-НС 1, рН 8,0,10 мМ ЭДТА и 10 мМ хлористого натрия, ДНК осаждают двумя объемамиэтанола После полного высушиванияв вакууме ДНК растворяют в ТЕ-буфере(10 мМ трис-НС 1, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА)при 4 С и вместе с хлористым цезиемов количестве 1,273 г/мп растворацентрифугируют в течение 62 ч при20 С со скоростью 40000 об/мин, После полного удаления СзС 1-градиентасодержащие ДНК фракции диализуютпротив ТЕ-буфера, затем ДНК осаждаютдвумя объемами этанола, промывают70 -ным этанолом, высушивают и снова растворяют в ТЕбуфере (4 С).Готовый ДНК-препарат свободен отРНК и имеет длину более 50 к,Ь., что55 определено путем электрофореза на0,45 -ном агаровом геле,Стадия: Б, Частичное перевариваниеэндонуклеазой и фракционирование поразмерам лошадиной ДНК,50 мкг лошадиной ДНК двукратноингибируют при 37 С с 1,6 ед, БаиЗАв 450 мкл реакционной среды (10 мМтрис-НС 1, рН 7,5, 10 мМ хлористогомагния, 1 мМ дитиотрейтола), Спустя5, 25 и 40 мин отбирают .по 150 мпраствора и смешивают с 15 мМ ЭДТА ипутем нагревания в течение 10 минпри 70 С прекращают реакцию, Послеодобавления 0,3 М ацетата натрия,рН 6,0, ДНК осаждают с помощью2,5 объемов этанола После повторного растворения в ТЕ-буфере ДНКразделяют по величине путем электрофореза в течение ночи на 0,45%-номагаровом геле в ТВЕ буфере (10,8 г/лтрис, 5,5 г/л борной кислоты,0,93 г/л НаЭДТА) примерно при1 В/см с использованием маркеров величины переваренная с помощьюЕсоК 1 и Н 1 пй 111 и с помощью Ндпй 111лямбда-ДНК) вырезают ДНК длиной 1023:к,Ь., ДНК электроэлюируют в течение 3 ч при 300 В (буфер 0,1 хТВЕ),очищают на колонке Элютип и дефосфорилируют следующим образом.ДНК инкубируют в течение 30 минпри 37 С в 40 мкл реакционной среды(50 мМ трис-НС 1, рН 9,5, 10 ммольхлористого магния, 0,1 мМ ацетатацинка, 1 ммоль спермидина) вместе с5 ед, кишечной фосфатазы крупногорогатого скота, добавляют следукщие5 ед, фермента и инкубируют 30 мин,После добавления ЭДТА до конечнойконцентрации 25 мМ ДНК экстрагируютоднократно смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24;1по объему), двукратно смесью хлороформа с изоамиповым спиртом (24:1 пообъему) и трехкратно диэтиловым эфиром, осаждают этанолом, высушивают ирастворяют в 0,1 хТЕ-буфере,.Стадия В, Построение лошадинойген библиотеки ДНК,Дефосфорилиро ванные длиной 10- 23:к,Ъ, фрагменты лошадиной ДНК клонируют в лямбда-векторе, лямбдаЕМВ 1 3 (или-ЗА), с тупьия С-А-Т-С- концами, полученными путем удаления внутреннего ВапН 1-фрагмента фаговой ДНК,10 15 20 25 30 35 40 45 50 8 мкг фрагмента ЕМВ 1,-3 А лигируютпримерно с 5 мкг фрагментов длиной10-23 к,Ъ. лошадиной ДНК длиной 1023.к.Ь. в присутствии 10 ед Т 4-ДНКлигазы, инкубируют в течение. ночипри 14 С и один день при 4 С в50 мкл реакционной среды (66 мМтрис-НС 1, рН 7,2, 0,1 М хлористогонатрия, 10 мМ хлористого, магния,1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитола,0,5 мМ АТФ), Продукт лигированияупаковывают в зрелые фаговые частицы с использованием п чдйго лямбдаупаковывающей системы,Компоненты этой системы, те,ультразвуковой экстракт (УЭ), лизат,получаемый путем замораживания-размораживания (ЛЗР), буферы М и А,приготавливают известным способом,10 мкл продукта лигирования в течение 2 мин инкубируют при комнатнойтемпературе вместе с 25 мкл УЭ, который так же,как и ЛЗР, в течение30 мин инкубируют во льду, смешивают с00 мкл ЛЗР и инкубируют далеев течение 60 мин при комнатной тем"пературе, Смесь разбавляют 150 мкллямбда-разбавителя (100 мМ трис НС 1,рН 7,5, 10 мМ сульфата магния, 1 мМЭДТА) и хранят при 4 С,Часть упакованных лямбда фаговтитруют на Е.со 11 БМ 528 ЗцрР. Вцелом получают примерно 1 л 10 независимых лошадиных рекомбинантныхДНК, Остаток упакованного материала .размножают путем нанесения на содержащие штамм ЮМ 528 и сульфат магния1.В-агаровые пластины плотностью30000 пятнообразующих единиц на13,5 см пластины,Стадия Г, Скрининг лошадиной генбиблиотеки,По О мкг высокомолекулярной лошадиной ДНК полностью перевариваютс помощью ЕсоК 1 (Ндпй 111), путемэлектрофореза разделяют в 0,8 Х иомагаровом геле и переносят на нитроцеллюлозные фильтры, Нпд 111-фрагмент плазмиды рЕКЗЗ длиной 845:к,Ь.,который содержит всю кодирующую бьлок область для зрелого человеческогох,-2 АРС-интерферона получают мар кированную Р 32 ДНК,Нитроцеллюлозные фильтры предварительно гибридизируют в течение 7 ч при 65 С в 5 х 5 ЯРЕ (0,9 М хлорис того натрия, 50 мМ гидрогенфосфаза.сыворотки крупного рогатого скота),0,17 ДСН, 20 мг/мп ДНК из спермы лосося и затем гибридиэируют .в такомже растворе, но без ДНК из спермылосося, с использованием 13106 срвмаркированной пробы, После инкубациипри 65 С в течение ночи фильтры проювают четырехкратно в течение 11,5 ч в 3 ЯЯС (0,45 М 1 ЧаС 1, 45 мИцитрата натрия), 0,1% ДСН при 65 фС иэкспонируют в течение 7 дней нарентгеновской пленке фирмы "Кодак" спомощью усиливающих пленок фирмы"Кодак", Появлени нескольких полосдоказывает наличие семейства интерфероновых генов у лошадей, как онобыло ранее обнаружено у крупного рогатого скота, свиней и у человека,Поэтому для скрининга генов интерферона в библиотеке лошадиных ДНКприменяются такие же условия гибридизации,600000 рекомбинантных лямбда-фагов наносят на содержащие штаммЕ.со 1 Р 1 528 пластины плотностью30000 пятнообразующих единиц на13,5 см пластины, Четырехкратныенитроцеллюлозные реплики готовят скаждой пластины После высушиванияов течение 2 ч при 80 С Фильтры проомывают в течение 1,5 ч при 65 С в1 И хлористого натрия, 10 мИ трис"НС 1 рН. 8,0, 0,17. ДСН, предварительно гибррдизируют в течение ночи ипо 2 реплики каждой пластины гибридизируют в течение 24 ч с использованием на 1 Фильтр 1,510 срв пробы6радиоактивного 0-инте рферона, Послетрехкратно повторенного скринингаполучают 8 клонов лошадиного -интерферона, которые дают положитель"ные сигналы гибридизации,Стадия Д, Характеристика рекомбинантных фагов,Из 7 гибридизирующихся с человеческим 06-интерфероном рекомбинантныхДНК готовят фаговую ДНК, ДНК переваривают рестриктазами Есой 1, ВавН 1,Н 1 пй 111, Рвй 1, ВК 111, ЯаП, Ява 1 ипутем электрофореза разделяют в0,8 Х-ном агаровом геле, Величинагибридиризувцих фрагментов определяется по способу Саусерна, Положениерестрикционных мест внутри лямбда вставки определяют после частичногорестрикционного переваривания ляибдаЦНК, маркировки правых или левых тупых концов лямбда-ветвей синтетичес 5кими, маркированными Р 32 олигонуклеотидами и электрофореза в 0,457 ном агаровом геле,Стадия Е, Субклонирование геналошадиногою-интерферона,Рестрикционный фрагмент клонаЕ 8-01, который гибридизуется с маркером чело вече ского К,-интерферона,субклонируют в векторе р 11 С 9 плазмиды рВК 322. Вставка чужого ДНК-фрагмента приводит к прерыванию 1 ас я-гена -галактозидазы и таким образомизменяет фенотип тр ан сфор миро ванного плазмидой штамма Е.со 1 1 И 01 от1 ас до 1 ас . Колонии бактерий с фенотипом 1 ас- отбирают по белойокраске.Нпй 111-фрагмент длиной 3,2 кЬ,из клона Ея-/;элюируют из агаро 25 вого геля, очищают на колонке Элютип Д, лигируют с 40 нг разрезанногос помощью Я 1 а 1 и дефосфорилированного вектора р 1 С 9 в примерно 10-кратном малярном избытке, трансформируют30 в Е.со 11. 1 М 101 и наносят на 1.В-топагар с 0,2. мг/мл БХИГ (5 бром 4хлор-и ндолил-/-Р гала кто зид),0,17 мг/мл ИПТГ (изопропилтиогалактозид) и 0,1 мг/мл ампициллина, Белыеколонии выращивают в 5 мл 1,В-бульонас 0,1 мг/мп ампициллина в течениеночи при 37 С с последующим скринингом, Полученную нри этом ллазмидуобозначают как рАН 50,40 Стадия Ж ДНК-последовательностьгена лошадиного 06-интерферона изклона Е 1-ЮНпс 111-вставку плазмиды рАН 50длиной 3,2 к,Ъ, подвергают анализупоследовательностей по методу Сангера 50 мкг плазмидной ДНК из рАН 50полностью переваривают рестриктазойНдпй 111, фрагмент длиной 3,2 к,Ьвыделяют из 1 Х-ного агарового геляи очищают, 15 мкг этого фрагмента в100 мкл среды лигирования лигируютс 4 ед Т 4-ДНК-лигазы при 14 С втечение ночи и затем при 4 С следукгщие 4 дня Лигированную ДНК фрагмен 55тируют с помощью ультразвука импульсами в 20 с в течение 140 с в ледяной бане, ДНКфрагменты в течение2 ч при 14 С в 250 мкл реакционнойсреды (50 мМ трис-НС 1, рН 7,5, 10 мМЕТЯВСРатЬСАСМБАСААДААТЯЯТОИЕ САСТКССТАСАГСС:ОСА САТСТАСЦСАТЛТЮаЛЩСАМжсАСГЩСАЯАСЯТСЯДАЕА 666 Д 545 ессткд 3 амдтеяагдстдзиссстстттмессдсдтясссссдбба бетспсжбмсссжоссссббстсдсжбтс сссссссбсдвсдстбсдсбдтссссд луЪ) .333 Ф -55Аг да 1 аа Рта Уа ЗАГ 3 га ага Аа 3 а 1 аа Уг УВ 3 Еаа 1 аГ Суа И 33 ЗаГ 3 а Суа ЙаГ Ма 63 ТЯЗИЮ 1 га Руа 636 ТЪГ 63 адя Вст сте сст еи тсс ттд сте дте Бсс ств Вте вте сс мс Тес сс сс Атс тес ст сте ебд 61 ВАС ся сст сдс Асс сдт 33 л 3 Ф 35 УФ 33 ЗФ 33Б 3 аа 63 у Иа тъг гр Уа 1 га 3 а аа Иа Пу Бта Аг агу Агр 3 г Заг Рга РЪг ЗггЯ.аа уз Аад Агр Ага Ага РЪа ЦуАвс С 1 бвс х АсА авя Втс пя Ате стс с 1 Бве сдд Ае сбе сел тс тсс ссс ис Тсс Тбс с 36 Вв есс Авд дд 1 есс ти звд 303. лФ л 3 3 Ф 53 АФ А 3Ръа Рга 1 а 63 а Угт Ръе Аад 3 у иа 6Ръг гр уз Ргг 6 а 3 а иг Баг 1 а уа 3 63 а 633 ъг иа ета,вта иа Ръг 3 а гапс ссс сАЯ вт етв ит вдс еас Асс 03 ттс свв Адв сс сад есс Атс тст бсб 6 с сдт Бдв Асв 1 с сдд ссв Атс цс сдс стс Аул УФ 33 ВФ 3 ФФ Т 3РЪэ Заг Ъ дав 63 у Заг Заг 63 а да тгв дав 3 а Згг Оа 1 га лад Еуъ 1 га Туг ТЬг у 3.га туг 1 а 1 а 1 га ТЪг На Сга Иапс 336 с дсд ю евс тд та всс есс твя всс,еав Авс стс стд едс вл стс тдс Аст ад стс тдт ссв сдв ав Аст ва ста Бдд 6 ФФ 343ИФ И 3 3:Ф ЯДтаЩ 3 аа,Заг 3 а 1 а Тг 6 Уа 3 Иа Вта тъг Рга 0 а Аг 1 Даа 63 а Агв Заг Оа 1 аа Д 3 а Уа 3 Агр Агр ттг РЪг 63 а Агр ИФВсс 1 бт втя Абс сся вдв ете 6 етв Бсд 94 Асе ссс сте Атв Адс есв бдс тсс стя сте Бст е 6 Аве Авд тдс пс ссд щ цс вуч 3 ф 4 333 3 АФ . 343 333А 3 а 0 а Туг Оа 1 а 3 а аул Суа Туг Згг РгаЯА 3 а Тгд Ца Та Уат Агр На 3 а Иа да Агр Заг РЪФ Заг Заг Заг тдг Амест стс тдт ств сдд ядв Адв сдд тдс Авс сп 61 есс тев едв Атс ес Авд есд ег 4 Атс дтв Авд тсс пс тст тсд тсс Асд дсс У 34 36,Фа Рга 63ЗеИЯ ссв сдв Авт тсд евсвяддвдддтвсссстввттсддсдтбздддтвсттстсдпедствд тддтдтслсдсттссдсттестствссдтс Тсдсбвсс Осдтетст рте 43 тмтсдтдсстеддпБддтсддптттсАдАтяттт 3 сд 6 тд 6 тАпсАТ 6 АдтвттввтстсАссстят 66 Асдпс 6 тствдРсдбссздссдтеттедтстдтпдут ФудтпдптдслтдптдптсдттдптдтвсватттсддпдтттттепестдАссдттдтятесдсстпдсстяАбтттддтдтсдсддсдтвтдтбспсстдптсвсс п 3 Ф АтттдидиттСТВТрисдиссдСТТТАСтетдвддсдтдтсистдптетИАПСтпдсддбсбдД:СдссссссстедвтвБСААЯСТЯА 3 тсдаЗААТЕЯАТЗЯСД" 31 Л АпсдтттксдтсдтЯтсдтдттсддвттсвддстжмсвссттсстстд 9 хтевттетдтепбдссСеьидтвдббтвсассссссдсдтсссвттсствстпст 333 л уеддтетттвПптствееяматсссстсдввстдсссддпедттевтсдцвсдтсттмпдптпмдттдсссстддТсдтдттсвщпдттдтсдвттсбВт 3 ду 3ТАДтсстдсдтеесРАСЯЯЛДДСДМБЯД 6 ТКДСДТЯТССХТБЯАТАПСРЯРТЯСААТПАСМБССАИССАТЕАССТБТАЕЕТ 66 ААТТЫСБТСЯБСАББАСЯТБВТС 303 ОТВЯЬаебдбс.ЗС АЕАД 16 СбАСАСВЕАСЦМАДП 6 АЦССтАббАССИСАСССПСССАбб 6 АА 6 БСССС 6 ССАтЮ 66 ССДСС 6 ЯТБ 6 САт 6 аССАТАТБТТСАССЕЯД 313 ЯДЯДЖСДЮТБДБДТЗСССДЕТПАДББе 3 ТТАСДСТБСТ дедБасСАДИЛСАЯАССА 66616 бюеедствСССССССЖТЯБЯМСббдбБСБСАТТевс 3 ФЗФ хлористого магния, 1 мМ дитиотреитола, 0,5 мг/мч альбумина сыворотки крупного рогатого скота, по О, мМ йАТР, ИСТР, ИСТР, ЙТТР) обрабатывают1 15 ед, б ольшо го фрагмент а и олиме разыиэ Е.со 11 (фрагмент Кленова), После концентрирования путем осаждения этанолом ДНК разделяют в 1 Х-ном агаровом геле и ДНК-фрагменты длиной 30 0,35-1,0 кЬ. выделяют и очищают, Примерно в 10-кратном молярном избытке фрагменты лигируют с разрезанной рестриктаэой Бша 1 и дефосфорилированной репликативной формой бактериофага М 33 шр 8 и трансформируют Е.со 11 1 М 10Однонитевую ДНК полученного рекомбинантного фага выделяют и пос ле связывания с одним синтетическим. олигонуклеотидом осуществляют синтез второй нити в четырех отдельных реакциях с использованием фрагмента Кленова ДНКполимеразьг 1 из Е.со 11.Ниже приводятся нуклеотидная Н 1 пй 111-вставки плазмиды рАН 50, аминокислотная и полная нуклеотидная последовательности Ед-ф;интерферона,%2".И 61 АПЬаОаа 161 АЦСС 1 С 16111 АА 16 П 11 АП 1 КП 1 ААА 1 А 1 АЛА 1 ЯЦ 1 АА 11 А 11 АаА 1 А 1 юееЦ 1 А 1 АЦА 1 АбА ЯЗ АС ";:ф"1 1 А 1 АЦАЦ 1 АбАПЯ 31 А 1 Я 1 ЦВАА 1 А 16;21Р1 4 В е аве а6161",1.,164 А;СА 1 АСА.ЯААЯс 41 бЯАС:ЯС 11 Я 1 АЯб;АЦ 161 С 1 ЯА 6 ф Я"ллф 1 ец,ле,дЬ ф:1 А;А",1 1 1 . 1 1 Д 1 А 1 аАА 1 Щ 1 А.-Ц 1А1 фцб";1 баалАббббЯАббАААСАА 616 А 11 А ПбАААА 161 бемААЯА 1 АСА 611 ПАЯ 1 ПСАП П 1 АС ц,С 1 АП 1161 А 1 МС 1 УЛА 1 АА 21 аа 1 А 6361 ААПСА 6 А 1 ААААСАА 111%СААббАЮ 1 А 1 АЦ Ф 4 Я 1 ЯАСА 1 ЮАЯА 1 А 1 ЯААЯАс"1 ААФС 1 Я 61 ЯААХЯЯЖЛббЯАбц 111;ЗСД фСАССфОАббА 11 А 11 С 1 ЯСа П 11 РС 161 ЯбА 16 РААЯАБАТ%АЯ 1 АбВ 111 ААА 11 А 1 АСФА 1 ЯА 11 А 6 А 1 АПМПРАа 1 ЦЪА 116261 ААЦ АЦА 1 ИС 1161611 ААА 1 АбА 11 ААСААбА 11 Яба"СЦ 111 АббА 6 Ц 111 СААЯСА 11 ЯА 1 А 1;АППО а а АММ 4 ЮабА 111 Я%1:Аббябс 1 сб 16 АА 1 АдАяя бябббоаААияб 1 сббА 1 Аюмд аАпцбццябобААбяяо 1 А 1 пАА 1 яяб 11 Аябц 1 ЯААА 1 я зт 2 ф иА;, и 1;Ц 1,Я.П 20 50 Стадия К, Конструкция экспрессионных плазмид рАН 52, рАН 52/2,рАН 5320 мкг плазмиды рАН 50 (см, стадию Е) переваривают с помощью 30 ед,Н 1.пй 111 и ДНК-фрагмент длиной4,2 к,Ь который содержит весьген Я 1 интерферона, выделяют изагарового геля с помощью ДЕ 81 бумагии очищают, Для этого после разделения ДНК-фрагментов в агаровом гелеперед и после выделяемой ДНК-полосывырезают щель, в которую вставляютполосу ДЕ 81-бумаги Электрофорезпродолжают до тех пор, пока желаемый ДНК-фрагмент полностью не будетсвязан с передней полосой бумаги,Задняя полоса предотвращает загрязнение более крупными фрагментами ДНК,40ДЕ 81-бумагу со связанным ДНК-фрагментом промывают дважды в течение5 мин в 400 мкл буфера с низким содержанием соли (0,2 М хлористого натрия, 25 мМ трис-НС 1, рН 8,045ЭДТА) и затем ДНК дважды в течение10 мин элюируют с бумаги ДЕ 81 с помощью 200 мкл буфера с высоким содержанием соли ( М хлористого натрия,25 мМ трис-НС 1, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА)и осаждают 1 мп этанола. КонцыН 1.пй 111-фрагмента снабжают связкамиБрй 1. Для этого 0,2 мкг связки БрЫвместе с 2 ед, полинуклеотидкиназыинкубируют в 1 О мкл реакционной средыв течение 45 мин при 37 С (70 мМо 55трис-НС 1, рН 7,6, 10 мМ хлористогомагния, 1 мМ АТФ, 5 мМ дитиотреитола),БРЬ 1-связки лигируют с Ндпд 111 фрагментом с помощью 8 ед, Т 4-ДНК-лигазы в течение 20 ч при 4 С. Затем фрагмент инактивируют при 70 С и ДНК переваривают с помощью 30 ед, БрЫ в, общем объеме 100 мкл, экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом, ДНК лигируют и трансформируют Е.со 1 НВ 101, Получаемую плаз миду обозначают как рАН 51 с Она содержит ген ф,1-интерферона с укороченной 3-нетранслированной областью и дополнительным БрЫ-местом разреза,Для того, чтобы встроить ДНК- последовательность зрелого лошадиного ф, -антерферона на нужном расстоянии от последовательности промотора, используют ДНК" фрагмент длиной 0,4 к,Ь, который выделяют из 200 мкг разрезанной РЕП плазмиды рАН 50, 1 нмоль синтетического 1,5-мерного олигонуклеотида с последовательностью 5 -ТСТСАССТСССТСАС обрабатывают полинуклеотидкиназой, Он содержит после довательность, которая кодирует пер оле 5. аминокислот зрелого 01-интерферона из клона рАН 50, 15-мер смешивают примерно с 7 пмоль Рчи 11-фрагмента длиной 0,4.к,Ь. и в общем объе ме 34 мкл кипятят в течение 5 мин, чтобы денатурировать двунитевую ДНК, После охлаждения связанную с одной нитью олигонуклеотидную затравку в 70 мкл реакционной среды (50 мИ трис НС 1, рН 7,2, 10 мМ сульфата магния, 0,1 мМ дитиотреитола, 50 мкг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота, 1 мМ ИМАТР, дСРТ, дСТР, йТТР) удлиняют с помощью 30 ед, фрагментаПолученную после трансформации Е.со 1 ь НВ 101 экспрессионную плаз миду обозначают как рАН 52Она содержит все необходимые для индуцируемой экспрессии зрелого лошадиного ф,1-интерферона информации, Аналогичным образом из разрезанной Нпс 111 и Ващ Н 1 ппазмиды рагрАТЕК 103 полу 55 чают экспрессионную плазмиду рАН 52/2Эта экспрессионная плазмида примерно на 0,2 к,Ъ. длиннее, чем рАН 52, и50 Кленова в течение 3 ч при 37 фС. Для удаления возможного 3 - выступа ДНК/затем инкубируют вместе с 16 ед, Т 4-ДНК-полимеразы в течение 20 мин5 при 37 С в 120 мкл реакционной среды (33 мМ трис-ацетата, рН 7,9, 66 мМ ацетата калия, 10 мМ ацетата магния, О, 5 мИ дитиотрейтола, О, 1 мг /мп апьбумчна сыворотки крупного рогатого скота, по 1 мМ с 1 АТР, ИСТР, с 1 СТР, с 1 ТТР). Образовавшуюся ДНК с тупыми концами экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают при 0 С в течение 15 мин 0,45 М ацетата натрия и 5 0,6 об.ч, 2-пропанола, С полученной ДНК лигируют смесь олигонуклеотидов: 12-мера 5 -АССТТАААСАТС, 8"мера 5 -САТСТССА,которая дает Нпс 111- место разреза и трансляционный старт кодон АТС, По 1 нмоль этих двух олигонуклеотидов лигируют с ДНК-фрагментом в 20 мкл с помощью 14 ед, лигазы в течение 40 ч при 4 СПосле инактивации фермента при 700 С полу 25 ченную ДНК в 100 мкл разрезают с помощью 80 ед, Нкпс 111 и 20 ед. В 8111 и ДНК-фрагменты длиной примерно 190.к,Ь. выделяют из 2 ного агарового геля на Е 81-бумагу и очищают,30 Полученный ДНК фрагмент лигируют с 50 нг разрезанным Нпс 111-и Вя 111 рАН 5 вектором и транслируют Е.со 1 НВ 101 Из 65 полученных колоний выделяют 4 плазмиды, которые обладают желательным рестрикционным рисунком. Из них выделяют один Ншс 111 - ВащН 1-ДНК-фрагмент, который подвер гают анализу последовательностей по методу Сангера, Эту плазмиду обозна чают как рАН 51/220 мгк плазмиды рАН 51/2 разрезают рестриктазами БрЬ 1 и Нкпс 111, образовавшийся ДНК- фрагмент длиной 1,0:к.Ь . выделяют из агарового геля и лигируют с 40 нг 45 разрезанной с помощью Нкпс 111- и БрЫ-плазмиды ратрАТЕК 103дополнительно имеет сингулярноеВащН 1-место разреза,В плазмиде рАН 53 триптофановые промоторы, ген 0 интерферона, устойчивый к ампициллину ген и начапо репликации ориентированы в одном направленни,Плазмиду рАН 53 получают из плазмид рАН 52 и рВК 322 следующим образом,10 мкг рАН 52 разрезают с помощьюБрй и ЕсоК 1, ферменты ннактивируютпри 70 фС и после добавления по0,15 мМ дАТР, с 1 СТР, с 1 СТР и ЙТТР ДНКконцы делают тупыми с помощью фрагмента Кпенова в течение 1 ч при22 С,ДНК-фрагменты фракционируют повеличине в агарсвом геле и выделяютфрагмент длиной 1,1 к,Ь которыйсодержит промотор и ген интерферона,10 мкг плазмицы рВК 322 перевариваютс помощью ЕсоК 1 и Рчц 1; концы такжевыпрямляют с помощью фрагмента Кленова и затем дефосфорилируют с помощьюфосфатазы . телячьего кишечникаДНК-фрагмент длиной 2,4 к,Ь. выделяютиз агарового геля, Оба полученныхтаким образом фрагмента ДНК лигируютс помощью Т 4-ДНК-лигазы и трансформнруют Е.со 1 НВ 101., Таким образомполучают экспрессионную плазмидурАН 53, которая, содержит два местараспознавания ЕсоК 1.П р и м е р 2, Получение экслрессионной плазмиды рАН 62 дпя получениялошадиного Я -интерферона1Стадии А-В осуществляют аналогично примеру 1Стадия. Г, Скрининг лошадиной генбиблиотеки генов интерферона,По0 мкг высокомолекулярной лошадиной ДНК полностью переваривают спомощью ЕсоК 1 (Н.пс 111), разделяют путем электрофореза в 0,8%ном агаровом геле и переносят нанитроцеллюпозные фильтры, Готовятрадиоактивно маркированную ДНК-пробу из Рзс 1 - Вя 111-фрагмента, кодирующего человеческий /3 -интерферонкДНК клона Р 1 Р 12. Эта проба кодирует аминокислоты 48-166 зрелого(3-интерферонаНитроцеллюпозные фильтры предварительно гибридизируют в течение7 ч при 65 С в 5 ИББРЕ (0,9 И хлористого натрия, 50 мМ гидрогенофосфатанатрия, 5 мИ ЭДТА, рН 7,4), 5 И раствора Денхардта (0,1 фиколла, 0,1%16 642956 ААбсттсттсстабттттсабттататтбтабатабттбабаттбссабААлябсаасАААТбтббстбабАААбсТАТбтбятбГспбстбтасятб 301 бттббббссстасаажяаатттабататбсттабттбаасапасбатбстабятА,".ААААААбтаббвтбтстттптААААтсАТААААтбсятатаптаттбттттбтбат 220 ябтбтаяпбббААттааатстааттсттябяААААбмААттсссА 1 АсАААбАсссстсАААААсАтстсАтяАтАстААААРйААААятяААААпАстттбссАяят 6 Асаба 331 ястст 6 тяАтА 6 сА 6 А 6 тсстАААт 6 АГттА 6 сттятттт 6 ттссттб 6 тАтпААсААтАсА 6 т 6 ясястттАсялААсАттабАААтсстсабабтттбтятбттттсссстААГА 166ЯСАТААААТЯААаТА 66 АСПТАЯ 6 бЯТАСА 6 А 6 ТПТЯ 6 А 6 АСТАСАААТААТбТАЯАТбАСАТА 66 ЯАААСАбААА 66 бАбААСТ 6 АААбтбббААЯТТССТС 16 АААТАФАААбаб 577 тббаббассатсссбтатая;.1 АбсссасястсасббаббдаббасаптяябстсААбссбпбссасстсРстт ббстссдбббябтаяаббсаасастбттсстбтспсатс ятя фтФ -1 .30- 1 5ффЪ ТЪР ттР ф РР 33 в СВВ РГО Ы Я 4 Ьюм Ем СВВ Ств РЪЯ бю ТЪГ Ъ ЯЬЯ Ею ЙФГ 043 ИВ 131 Я 50 Си 0 АГ 6 Зь 161 Асс ТАС ябб 16 яс стс сся ятб бсс стс стб стб тбт пс тсс ясс Асб бст стт тст бтб яас тАт бас ттб стт сббсс сАА тбь ЬФ 1330 Ме Яф ба Зю аав вг ИЯЯ 1 к Ы 1 и Ь.и ста бба абс Рк аат 1 са бса тбт с 16 ятб стсст Я 6630 1 е С СЯ 6 Пб ЯФ Ю 50 тМ РРв 3 в 3Ив 3 в 63 а ЯЬЯ 63 е 63 а РЪа 3 в атс сст А 6% яп бя 6 сна бса сяб саа пс сАФ тв 63 в ЬР поливинилпирролидона, 0,1% альбумина сыворотки крупного рогатого ско,та, 0,1% альбумина сыворотки круп, ного рогатого скота), 0,1% ДСН,20 мг/мп ДНК иэ сперьы лосося, затем гибридизируют в таком же растворе, но без ДНК из спермы лосося сиспользованием 133110 срш маркированной пробы, После инкубации при 65 Св течение ночи, фильтры промываютчетырехкратно в течение 1-1,5 ч в3 Я ББС (0,45 И хлористого натрия,45 мМ цитрата натрия), 0,1% ДСН при65 С и экспонируют в течение 7 днейна рентгеновской пленке фирмы "Кодак"с помощью усиливающих пленок фирмы"Кодак",Дня скрининга генов интерферона в библиотеке лошадиных ДНК применя" ются такие же условия гибридизации.600000 рекомбинантных лямбдафагов наносят на содержащие штамм Е.со 1 х НМ 528 плотностью 30000 пятно- образующих единиц на 13,5 см пласти ны. Четырехкратные нитроцеллюлозные репликаты готовят с каждой пластины, После высушивания в течение 2 ч при 80 вС фильтры промывают в течение 3,5 ч при 65 С в 1 И хлористого нат рия, О мМ трис-НС 1, рН 8,0, 0,1% ДСН, предварительно гибридизируют в течение ночи и по 2 реплики каждой пластины гибридизируют в течение 24 ч с использованием 1 к 0 срш пробы радиоактивного -интерферона на фильтр, После трехкратно повторен ного скрининга получают 6 клонов лошадиного 3 интерферона, которыедаютположительные сигналы гибридизации,Стадия Д, Характеристика рекомбинантных фагов,Из 3 гибридизирующихся с человеческим 3-интерфероном рекомбинантных ДНК готовят фаговую ДНК,ДНК,переваривают с помощью ЕсоН 1ВашН 1, Нь.пй 111, РвС 1, Вя 111, БаП,Бша 1 и путем злектрофореза разделяютв 0,8%-ном агаровом геле, Величинагибридизирующихся фрагментов опреде 15 ляется по способу Саусерна, Положениерестрикционных мест внутри лямбдавставки определяют после частичногорестрикционного переваривания лямбдыДНК, маркировки правых или левых ту 20 пых концов лямбда-ветвей синтетическими, маркированными Ролигонуклеотидами и электрофореза в 0,45%ном агаровом геле,Стадия Е, Субклонирование геналошадиного /3 -интерферона,Рчц 1 П-фрагмент длиной 4,5.кЬкоторый гибридизуется; с пробойчеловеческого 3 -интерферона выделяют,очищают, лигируют по Бша 1 сайту плазмидй рцС 9 и трансформируют Е.со 111 И 101, Трансформант с желательнойвставкой (рАН 60) выращивают и плазмиду характеризуют,Последовательность Нпй 111-фраг35 мента, аминокислотная и нуклеотиднаяпоследовательности ЕВ-ф-интерферона,рАН 60 представлены ниже,3 30 ИЯва 1 т а а Ргв 63 а Ягб НРеф 30 ЯЯФ ТЪР аат,ам РЪа 6 ЬАат ббя Вас сст саа сбт 1 бс ссс 66 бас аса атб яас пс сяб 70 35 ЯФИМа ЯЬЯ м 7 Я Ие Ттг 1 а Ы Мв 3 в 33 Я ТЪг Тгр Ягб Пвбст бся ттб бтс атс тат баб ап стс сяб сас асс 16 сбт ап тая17 8 1642956 ТР У 5 Ю ча ЧаЪа ЭВ ЬЧ Иа РЬЯ АГЯ Бег Ттм 61 У ТГР Аьл 6 а ТЛг 11 ч ЧЯ 1 УР Иа Сю в Чд 1 ата ЧЯ ач в 1 а ЛЯ 1 ИР МВ еГ 6 атс Абя яая Аят пс Бст яас яст Ббс тба ААт БАв Асс ятс аут ААВ ААс стс сп БТВБАА атс сат ста сяа ятв бяс сбт ста БАВ Яаь;ря 05 иа 5 12 Ф 125Я Яаа аа БТ6 в И Я Лей 61 а Ва ате ваг Бег ТЪг тур 61 у ЯТЪг Пю Ие Яа Агав СТЯ ур Туг Туг 61 у Яга Ир БегА мс ств ВАБ ббя Ата Атв БАБ БАа БАА Абс тсс Асс таа ббя ААс АсА Асс яп ств сбс ста Аяб ААА тАс тАс ббя Аба ятс тса и та 15 ГГО ГГ 5 50 Яа Ту щ уф А я уз уя Туг Баг ЛвСуюЯЯ ТГР ТТй Чй Уя 61 а А я 61 а Юа Ац Ага Ая йа Я я Ин в Аяа у йа :в ГАс ста яйз 6 с ААБ ААБ тйс Абс АС тбт Бсс тба АСА бта бтс РА Бсб 6 АА Атб стс Абб ААС па Бсс пс стт ААС ббя стс 25 ь ь 1 Иф ЯЯР ту и а Мь Ф-я Бат тАС стс АА АА таА ВаАтстсссАБсст 6 сАсГсб 5 й 6 ййбаБАсАйт 6 ст 6 йсАбтБйстБсАебтбтспсссАбсАБА 55 стсп 6 Аат 6 АстВААбст 135"ббсАст 5 сАтт 6 бАААеБАсАбттАсйбйстттАсАппттАстААспАтбйАпААпАтттптАтттАтттААсйтпАссттББААААГАААтптпАТБАААААА ньу ГтсААсАс 6 естбтптААтттсйАстт 6 АтттятйеААтАсссйеАГтАйАйАстбсААйсйстбтййАйтБтттттБтАААйтбтбтеАААГАБГАГАБГГГтабсс 1;,Вь :тксттсААБеАйГпяАйАГссм 55 АА 6 ссАтбсяААтАтАсййбяГААейб 5 тейбйАБ 5 БеАстсАйс 5 тАйБбйБййейАйтбтббГГБАБсАГАГАААББАА Трб АййАТбЕЕАЕйБАСАЕ 6 СА 5 й 5 БСГСГБ 5 ССТСАбй 5 ЕАСЕЕбБСТбГБТГГБССТбТ 6 ТССбТГТББСйА 6 ГТА 5 ААГГбАТЕ 5 ТСТйбббтбАЕАББ 21:ГАт 6 тАестсттесБттт 5 стеБАбАссААс 6 ейБА 51 тес 1 АссАйййеейГГ 6 тййййГАтГттбтет 5 ййетййб Фс Ъч 5 йй 5 ГСССйЕБАГТТ 6 ббййСГбТАйбТ 6 бА 5 ТПТАГББТАГГТТГЕЕайСйАСбйбТ 6 ТАйЕЕГБГСТАйБЕЕБА 6 СйбБТСТСТБГТСТТСА 2 ОД КАСАЕААСААЕ 55 ААЕАААБААСТГБТТТСАТАСтбйтббСТЕБГТГТБСГСССТАТТТТГСйбйбйй 5 ААБТСТБТ,".БЕСПТТССТБСГБСГТЕСЗТСТ 2 В йбАСйТСГСССААА 5 СААЕбСААа 6 СА 5 БТЕй 6 СА 5 АТТАЕбТАбТСТйбБй 5 ТЕйбйАйСбЕБййБАГББЕй 5 йййбБйААТТАББГЕБЗАТАБАБАББ 2500 ТААЕТГсйА 5 ТТйАТ 555 ййАТТббйЕАГГТтйббйбТТТбббй 55 йбйтйбТ 5 ТГГТСТБГСТБГ 5 тбййГГЕЕБйй 575 йГТАТГЯГ 2132 ГБПСГТ 1 йт:йбйЕббйтБГбйтбйбАА 5 ГТ1 ТАЯТ Остающиеся однонитевые участки ДНК переваривают с 150 ед, 51-нук леазьГ в 400 мкл реакционной смеси в о течение 2 ч при 14 С (14 мИ ацетата цинка, 30 мМ ацетата натрия, 250 мМСтадия ЖКонструкция экспрессионной плазмиды рАН 62 для зрелого лошадиного-интерферона,3530 мкг плазмиды рАН 60 разрезают спомощью 30 ед, Н 81 А 1 в 50 мкл объемаПосле инактивации фермента при70 С 3 -выступающие ДНК-концы затупОляют в течение 30 мин при 37 С с по 40мощью 7 ед, Т 4-ДНК плазмиды (в присутствии по 1 мИ дАТР, дСТР, дСТР,дТТР). На тупые концы лигируют ВрЫсвязки, получен ую ДНК разрезают спомощью .ЯрЫ и Нпд 111. Образовав 45шийся ДНК фрагмент длиной 1,85 к,Ь.выделяют из агарового геля и лигируютс 50 нг разрезанной Нпд 111 и ВрЫплазмиды рагрАТЕК 103Полученный после трансформации Е,со 1 НВ 101 клонсодержит плазмиду рАН 61Эта, плазмида50представляет собой промежуточную ступень дпя дальнейшего построенияэкспрессионной плазмиды 20 мкг плазмиды рАН 61 разрезают ВаГпН 1 и Ба 11 иобразовавшийся фрагмент ДНК длиной1,3 к,Ъ, выделяют из агарового геля,очищают и лигируют с перевареннойрестриктазами ВапН 1 и Яа 11 М 13 щр 9 фаговой ДНК, После трансформации Е.со 11 1 М 10 из рекомбинантного И 13 фага (МЗрАН 6) выделяют однонитевую фаговую ДНК. 3 пмоль этой одноиитевой ДНК смешивают с 38 пмоль 15-мерного олигонуклеотида 5 ГЬТСААСТАТСАСТТС в 50 мкл 20 мМ трис.НС 1, рН 8,0 и 10 мМ хлористого магния, нагревают до 95 С и медленно охлаждают до ком натной температуры, Олигонуклеотид точно связывают начиная с первого основания последовательности зрелого ф интерферона, Синтез двунитевой ДНК исходя из 15-мерной затравки осу ществляют в 100 мкл объема после до бавления по 3 мМ дАТР, дСТР, дСТР, дТТР и 15 ед, фрагмента Кленова в течение 1 часа при 22 С, После до бавления 20 мМ ЭДТА ДНК экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом