Способ амплификации фрагмента днк неизвестной последовательности, расположенного на некотором расстоянии от фрагмента днк известной последовательности

: МЕ ВА НЕ ТЕЛ,В. Евграфов и А.В. Поляков . Тг 9 а ет а 1. ЙАВ, ч. 16, М 16. 1988, Ж 04, Биология, 1989. СПОСОБ АМПЛИФИКАЦИИ ФРАГТА ДНК НЕИЗВЕСТНбй ПОСЛЕДОЛЪНОСТИ, РАСПОЛОЖЕННОГО НА ОТОРОМ РАССТОЯНИИ ОТ ФРАГТА ДНК ИЗВЕСТНОЙ ПОСЛЕДОВАНОСТИ отки ДНК рестриктав результатекоторых стной послерпватель-" й в нативной ДНК на и от фрагмента ДНК ельности, оказываетримыкающим к фрагпоследовательности; дных праймеров, проованием амплифика) фрагмента ДНК ательности, 3 ил. следовательные обраб зами и легирование, фрагмент ДНК неизве ности, расположенны некотором расстояни известной последоват ся непосредственно и менту ДНК известной синтез олигонуклеоти ведение с их использ ции (размножения неизвестной последовтол мен сти зобретение относится к молекулярной ген тике, а именно к способам размножения,фрагментов ДНК неиввестной последоват льности из определенной области ДНК. Раз ножение фрагмента ДНК является важ ейшим необходимым этапом для его дал нейшего изучения, в частности, определен я его последовательности, и использования в других исследованиях, например, в кач стве зонда ДНК, Преимущественно изобре ейие может быть использовано в работах о поиску неизвестных генов в рамках стр тегии "обратной генетики", а также для кло ирования неизвестных последовательнос ей ДНК, поиска новых полиморфных мар еров ДН К. В настоящее время известенко один способ амплификации фраг а ДНК неизвестной последовательнорасположенного на некоторомрасстоянии от фрагмента ДНК известной последовательности - способ инвертированной цепной полимеразной реакции.Данный способ(фиг. 1) включает синтез олигонуклеотидных праймеров, получение линейных фрагментов ДНК, в которых фрагмент ДНК неизвестной последовательности флакирован фрагментами ДНК с известной последовательностью путем выделения ДНК из исследуемого объекта, обработки ДНК мелкощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой В 1 присутствует во фрагменте ДНК известной последовательности, легирования- полученной смеси, обработкой ДНК крупнощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой 82 находится в известной последовательности на большем удалении от фрагмента ДНК йеизвестйой последовательности, чем сайт50 рестрикции В 1; или, вместо этой операции, нагреванием раствора ДНК для производства статистических разрывов в кольцевых ДНК; с последующим проведением реакции полимеризации с использованием фрагмента ДНК неизвестной последовательности и праймеров,Недостатком способа является то, что может быть размножей только фрагмент, непосредственно примыкающий к фрагмен.- ту ДНК известной последовательности. Указанный недостаток делает практически неэффективным применение этого способа для поиска неизвестных генов в рамках стратегии "обратной генетики", для чего в типичном случае необходимо проанализировать несколько десятков фрагментов, расположенных примерно равномерно на участке обгцим размером несколько десятков - несколько сотен тысяч нуклеотидных пар,Цель изобретения - расширение функциональных воэможностей способа за счет , увеличения расстояния между фрагментом ДНК известной последовательности и размножаемым фрагментом ДНК неизвестной последовательности.Цель достигается тем, что после выделения ДНК из исследуемого объекта проводят дополнительную обработку ДНК крупнощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой ВО присутствует во фрагменте ДНК известной последовательности, а сайты рестрикции В 1 и В 2 лежат между сайтом рестрикции ВО и фрагментом ДНК неизвестной последовательности; и последующее легирование полученной смеси для получения кольцевых молекул ДНК,В результате этой процедуры фрагмент ДНК неизвестной последовательности, расположенный на расстоянии, ойределяемым расстоянием между сайтами рестрикции ВО, оказывается непосредственно примыкающим к фрагменту ДНК известной последовательности (фиг, 2), К такой конструкции в принципе можно применить способ прототипа для размножения полимеразной цепной реакцией фрагмента ДНК неизвестной последовательности, непосредственно примыкающего к фрагменту ДНК известной последовательности.Совокупность отличительных .признаков в литературе не описана,Использование изобретения позволяет расширить функциональные возможности способа за счет увеличения расстояния между фрагментом ДН К известной последовательности и размножаемым фрагментом ДНК неизвестной последовательности, Расстояние между фрагментом ДНК известной последовательности и раэмножаемым фрагментом ДНК неизвестной последовательности при использовании способа прототипаравно нулю, тогда как при использовании5 способа изобретения расстояние междуфрагментом ДНК известной последовательности и размножаемым фрагментом ДНКнеизвестной последовательности может достигать нескольких десятков тысяч нуклео 10 тидных пар, Этот факт делает возможнымэффективное использование способа, предложенного в изобретении, для поиска неизвестных генов в рамках стратегии "обратнойгенетики". В типичном случае для поиска15 гена необходимо размножить и изучить несколько десятков фрагментов ДНК, расположенных примерно равномерно в области,размеры которой составляют несколько десятков - несколько сотен тысяч нуклеодит 20 ных .пар. Таким образом, способ,предложенный в изобретении, по своимфункциональйым возможностям сравним сиспользованием методов прогулки по хромосоме и прыжка по хромосоме, но в связи25 с использованием цепной полимеразнойреакции, является значительно более деше-вым, простым и не требует дорогостоящегсоборудования,П р и м е р. Для проверки заявленного30 способа мы применили его к 5 концевойобласти гена дистрофина человека, последовательность которой была известна (рис.3).Были синтезированы олигонуклеиодит 35 ные праймеры следующей последовательности ДНК;первый 5 АТАТААО ОТТО ТО СТТССАС САТААСААО,второй - 5- 40 ОТО СО САООТССТООААТТТОАААТАТССОПри этом первый праймер мог гибридизоваться с участком ДНК между сдйтом рестрикции В 2 рестриктазы Мсо(сайт 749) и сайтом рестрикции Я 1 рестриктазы ЕсоВ45 (сайт 701) в нативной ДНК до обработкирестриктазами, и мог обеспечивать синтез ДНК в йаправлении сайтов рестрикции В 1 рестриктазы ЕсоВ (сайты 701 и 315) в нативной ДНК до обработки рестриктазами,а второй праймер мог гибридизоваться с участком ДНК между сайтом рестрикции В 2 рестриктазы Мсо . (сайт 749) и сайтом рестрикции ВО рестриктаэы Юа Ч(сайт 836) в нативной ДНК до обработки рестриктаза ми, и мог обеспечивать синтез ДНК в направлении противоположном тому, в котором мог обеспечивать синтез ДНК первый праймер,ДНК была выделена йз крови по следующей схеме, первая стадия состояла в пол1792972 уч тво про бе об К ин ле чт дл ос ря 10 ст ро ме М об зт фр фр ро ем чт дл ос ря 20 30 ме И ре 70 35 нии ядер, затем проводили лизис в расре, содержащем 0,5% ЮЯ и 100 ед/млтеиназы К, и фенольную экстракцию ков,10 мкг геномной ДНК в объеме 100 мкл абатывали 40 единицами рестриктазы И в течение ночи при 37 С, Рестриктазу гибировали 10 мин при 65 С. Тупые концы ировали 500 единицами Т 4 ДНК-лигазы бъеме 1 мл при 21 С в течение носи с тем, бы интересующие нас фрагменты ДНК ной 693 нп замкнулись в кольца, ДНК ждали в присутствии 0,4 МС и раствои в 80 мкл ТЕ рН 8,0, ДНК обрабатывали 50 единицами реиктазы ЕсоВ 1 (сайты рестрикции котоВ 1 (сайты 315 и 701) располагались ду сайтами рестрикции ВО рестриктазы И (сайты 143 и 836) в нативной ДНК) в еме 100 мкл в течение ночи при 37 С, при м от интересующего нас кольцевого гмента ДНК длиной 693 нп отщеплялся гмент длиной 386 нп, Ликие концы легиали 50 единицами Т 4 ДНК-лигазы в объ 0,7 мл при 21 С в течение ночи с тем, бы интересующие нас фрагменты ДНК ной 307 нп замкнулись в кольца. ДНК ждали в присутствии 0,4 МС и раствои в 50 мкл ТЕ рН 8,0. ДНК обрабатывали 60 единицами реиктазЙсо(сайт рестрикции которой (сайт 749) в нативной ДНК располагался ду сайтом рестрикции ВО рестриктазы И (сайт 836) с одной стороны и сайтом трикции В 1 рестриктазой ЕсоВ(сайт ), за которым на большем удалении от; Формула изобретенияСпособ амплификэции фрагмента ДНКнеизвестной последовательности, расположенного нэ некотором расстоянии от фраг 1,мента ДНК известной последовательности,включающий синтез олигонуклеотидныхпраймеров, получение линейных фрагмен.тов ДНК, в которых фрагмент ДНК неизвестной последовательности фланкированфрагментами ДНК с известной последовательностью путем выделения ДНК из исследуемого обьекта, обработки ДНКме 4 кощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой В 1 присутствует во фрагментеДНК известной последовательности, легирование полученной смеси, обработку ДНКкрупнощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой В 2 находится в известнойпоследовательности на большем удаленииот фрагмента ДНК неизвестной последовательности, чем сайт В 1. или путем нагревасайта В 2 следовали последовательно еще один сайт рестрикции В 1 (сайт 315) и сайт рестрикции ВО (сайт 143), с другой стороны), в объеме 100 мкл в течение ночи при 37 С, при этом происходило "раскрытие" интересующего нас кольца.Затем была проведена полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием первого и второго праймеров, по следующей схеме: 1,0 мкг подготовленной (обработанной тремя рестриктазами) ДНК, 0,05 цМ каждого праймера, 200 цМ каждого дИТр в 50 мкл стандартного буфера для ПЦР(50 АМ КС, 10 гпМ Тгз рН 8,4, 2,5 АМ М 9 С 2, 200 мкг/мл желатитны) прогревали 10 мин при 95 С, добавляли 2 ед, Тац-полимерэзы, и проводили 38 циклов с параметрами; 95 С - 1 мин., 56 С - 1 мин., 68 С - 2 мин затем добавляли дополнительно 2 ед. Тац-полимеразы и 0,5 цМ каждого праймера, проводили еще 14 циклов с теми же параметрами и финальную инкубацию при 68 С в течение 8 мин, Амплификацию проводили без минерального масла, после каждых семи циклов пробирки центрифугировэли для осаждения конденсата,В результате описанных процедур был амплифицировэн фрагмент ДН К ожидаемой длины 242 нп, который включал в себя фрагмент ДНК расположенный в нативной ДНК между сайтами рестрикции ВО рестриктазы а И (сайт 143) и В 1 рестриктазы ЕсоВ(сайт 315) и удаленный в нативной ДНК на некоторое расстояние от области ДНК, с которой могли гибридизоваться первый ивторой праймеры,ния раствора ДНК для производства статистических разрывов с кольцевых ДНК с последующим и роведением реакции полимеризации с использованием фрагмента ДНК неизвестной последовательности и праймеров, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью расширения функциональных возможностей способа за счет увеличения расстояний между фрагментами ДНК известной последовательности и размножаемым фрагментом ДНК неизвестной последовательности, после выделения ДНК из исследуемого объекта проводят дополнительную обработку ДНК крупнощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой ВО присутствует во фрагменте ДНК известной последовательности, а сайт рестрикции В 1 и В 2 лежат между сайтом рестрикции ВО и фрагментом ДНК неизвестной последовательностй и легирование полученной смеси для получения кольцевых молекул ДНК,ЪИРО 60 щка ДНЯпасооауИ 1261 1271281 1291 13011311АтАтАтАтОтлтттлттсАООААтАтАтАтгтттсАттОООААААсттттслАсАОАААт 1321 1331ООАОТОТАЬААОТТТТТ 341 1351 1361ОСОАТАОААСТАААСАСАТОАТТТ371ГОЛТТААСАААСС знаваемая лослеьовательнос Рестикта Сант 1 аваиия 315, 701 143, 836 749 Есор КаУ ОААТТС ООЯЯСС ССАТО о дэкто С,Пека о 2 . Тираж ПодписноеИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям п113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 За Т СССР енно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина,Ю ф ФипдЛТРогФи 8. 3оставитель О.Евграфовехред М,Моргентал