Способ получения рекомбинантной плазмидной днк prh w11 или prh w12, кодирующей омега-интерферон

(57)ческоструи генети он о лазм т ре иную Изобретени кой инженерии руированию эк для получения но к способу сионных плазм дирующих новы Способ осущя к генетиче сти к констотноси в част ионных плазмид рферонов, а именирования экспрес и рВН 1112, коЖероны,яют следующим рес нте констру ид рКН 4 е интер т образом. Человечес клеток, напр ую В-лимфо ер Маша 1 ш ую линклетк ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ ИЭ 42021 00/ 3 3935002/ 4 09,03,87 31. 07,85 Р 3505060,8 14,02,85 ПЕ 15,06,90. Бюл, Берингер Ингел ГмбХ (ПЕ) РудольФ ГауптмРастль-Дворкин,р Светлы, Кристрберт Гауэль (П 575,224,2:577, СПОСОБ ПОЛУЧЕН",ИДНОй ДНК ранамРУЮШЕЙ ОМЕГА-ИН зобретение относится к инженерии, в частности ованиюрекомбинантных пл К для получения интерфе иду р 9 А 2 или Е 79 Е 9 перев триктазой Ача 11, получ вставку к ДНК переваривают Ба и ЗА,выделяют Фрагмент длиной 189 п,оплазмиду рЕКЗЗ переваривают рестриктазами Есор 1 и Рчц 11, фрагментдлиной 389 п.о.,далее перевариваютэнзимом Ба и ЗА, выделяют фрагментдлиной 108 п,о который лигируютс Фрагментом длиной 189 п.о., полу-ченную ДНК обрабатывают Н 1 пй 111 илигируют с Ндпй 111 линеаризованнойплазмидой ЕК 1 03, полученной рекомбинантной ДНК трансформируют штаммЕ, со 11 НВ 101, полученную при этомплазмиду рКНМ 1 О переваривают Ваш Н 1,инкубируют в присутствии фрагментаКленова ДНК-полимеразы 1 и четырехдезоксинуклеозидтрифосфатов, плазмиду обрабатывают энзимом Исо 1, вьделяют большой фрагмент Исо 1 - А 1 ц 1плазмиды р 9 А 2 или Е 79 Е 9, которыйполучают в результате обработки.плазмйды Ача 11 с последующим гидролизомИсо 1 и А 1 ц 1, рекомбинантной плазмидой Д 1 К трансформируют Е, со 1НВ 101, 1 табл,обрабатывают вирусом, например БепЙа-вирус. Выделяют образовавшуюсяиз стимулированных Иаша 1 ъа-клетокмРНК и используют ее в качестве матрицы для синтеза кДНК. Чтобы повысить выход специФических для интерферона последовательностей в процессе клонирования, мРНК-препарат разделяют в сахарах с градиентом плотности соответственно на различнойдлины индивидуальные мРНК-молекулы, 19 157241 раствором 50 мМ трис х НС 1, рН 8,0, 30 мМ ЖаС 1, суспендируют н 1,5 мл промывочного раствора. Инкубируют с 1 мг/мл лиоцима при 0 С в течениеополучаса, бактериальную суспензию5 пятикратно замораживают и оттаивают. Остатки разрушенных клеток осаждают путем центрифугирования в течение 1 ч при 40000 об/мин. Надасадочную жидкость стерильно отфильтровывают и испытывают на интерфероновую активность. В качестве теста применяЮт бляшку редукционного теста с ЧЗ- клетками и вирус Чезгсц 1 аг Бошагг гз. Клон продуцируют до 9000 17 1,международных едиНиц) ннтерферана на. 1 л исходной культуры.П р и м е р 4. Получение экспрессивной плазмиды рКНЮ 12 и экспрессивНой плазмиды рЫ%11.а, Получение плазмиды рКН 110.100 мкг плазмиды Р 9 А 2 гидролизуют со 100 ед. рестрикционной эндонуклеазы Ача 11, После гидролиза фермент Инактивируют путем нагревания при 70 С и полученные фрагменты разделяют в 1,47.-ном агарозном геле с ТВЕ- буфером соответственно размеру. Полосу, которая содержит всю кДНК-встав ку, электроэлюируют и очищают на Е 1 цггр-колонке. Из полученных 20 мкг 6 мкг далее гидролизуют с рестрикционной эндонуклеазой БацЗА (20 ед. в 100 мкл раствора). Фрагменты разделяют в 2 Е-.ном агарозном геле в ТВЕ-буфере. После окрашивания с помощью этидийбромида (ЕГВг) электроэлюируют кусок ЦНК длиной 89 Ьр и очищают аналогично описанному, 40Для того, чтобы ген интерферона связать с промотором, местом связывания рибосомы и стартовым кодоном, соответствующий кусок ДНК изолируют из экспрессирующей плазмиды рЕК 33. 45 Для этой цели 50 мкг рЕК 33 двукратно гидролизуют рекстрикцианными ферментами ЕсоК 1 и Рц 11, полученные фрагменть Фракционируют соответственна их размеру в 1,4 Е-ном агарозном геле в ТВЕ-буфере. Кусок ДНК длиной 389 Ър, который содержит Тгр-промотор, место связывания рибасомы и стартовый (инициирующий) кодон, электроэлюируют и очищают с помощью Е 1 цГгрколонки. Полученный фрагмент затем гидролизируют с ЯацЗА и получают требуемый фрагмент длиной 108 Ьр путем электрофореза в агарозном геле, элект 20роэлюирования и очистки на колонкеЕ 1 цггр с выходом примерна 100 нг,20 нг фрагменталигируют при14 С в течение 18 ч с 20 нг Фрагмента с в объеме 40 мкл при применении10 ед. Т-лигазы в растворе, которыйсодержит 50 мМ трис-НС 1, рН 7,5;10 мМ МрС 1, 1 мМ ВТТ и 1 мМ АТР,Затем фермент инактивируют путем нагревания до 70 С и полученную ДНКоразрезают Нгпй 111 в объеме 50 мкл.10 мкг экспрессивной плазмиды рЕК103 линеаризируют с помощью Нгпс 1 111в объеме 100 мкл, Инкубируют 2 ч при37 С, добавляют 1 объем 2-фосфатазного буфера (20 мм трис-НС 1, рН 9,2;0,2 мМ ЕДТА) вместе с 1 ед, фосфатазы телячьего кишечника (С 1 Р). После 30 мин при 45 ОС добавляют следующую единицу С 1 Р и инкубируют еще разв течение 30 мин, Полученную такимобразом ДНК очищают двукратной фекальной экстракцией, однократной экстракцией СНС 1 , осаждают добавлением1/1 О объема 0,3 М ацетата натрия(рН 5,5) и 2,5 объемами этанала,100 нг линеаризированного рЕК 103и лигираванных фрагментов Б и с (после Нпс 111-гидролиза) вносят в100 мкл раствора, содержащего лигазный буфер, и лигируют при 14 С втечение 18 ч с помощью Т 4-ДНК-лигазы.200 мкл компетентной Е. со 1 гНВ 101 смешивают с 20 мкл легирующей смеси и инкубируют в течение45 мин на льду. Затем поглощениеДНК полностью прекращают тепловымнагревом в течение 2 мин при 42 С.Суспензию клеток инкубируют 1 О минна льду и наносят на 1 В-агар, содержащий 50 мг/л ампициллина. Из полученных 24 колоний выделяют плазмидную ДНК по методу ВггпЬогш и Ро 1 у.После гидролиза с различными рестрикционными ферментами плазмида имеетжелательную структуру. Она получиланазвание рКНУ 10,б, Получение плазмиды,рКНМ 12,Примерно 1 О мкг плазмиды рКНМ 10разрезают Ваш Н 1, затем добавляютФрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1.и4 дезоксинуклеозидтрифосфата и инкубируют в течение 20 мин при комнатнойтемпературе. Полученную линеаризированную плазмиду с тупыми концами очищают Фенольной экстракцией и осаждением спиртом. После этого разрезаютрестрикционной эндонуклеазой Исо 1 в419 22100 мл бактериальной культуры инкубируют до оптической плотности0,6 при 600 нм в минимальной средеМ 9, которая содержит все аминокислотыза исключением триптофана 120 мкг/млна аминокислоту); 1 мкг/мл тиамина;0,2 Ж глюкозы и 20 мкг/мл индол-(3)- актиловой кислоты (1 АА), индуктортриптофан-оперона. Затем бактерииосаждают путем центрифугирования(1 О мин при 7000 об/мин), промываютоднократно буфером 50 мИ трис-НС 1,рН 8; 30 мИ МаС 1, суспендируют в1,5 мл этого же буфера. Инкубируют втечение 30 мин с 1 мг/мл лизоцина нальду, бактерии 5 раз замораживают иоттаивают. Обломки клеток удаляютцентрифугированием в течение 1 ч при40000 об/мин, Надосадочную жидкостьстерильно фильтруют и испытывают наинтерфероновую активность в анализепо методу уменьшения пятна при применении человеческих А 549 клеток иЕпсорЬа 1 ошуосагд 1.Т 1.з-вируса,Результат: 1 л приготовленной бактериальной культуры содержит 1 106международных единиц интерферона. Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК рКН 1 Ь 11 или рКНК 12, кодирующей омега-интерферон, включающий обработку плаэмиды Р 9 А 2 или Е 79 Е 9 эндонуклеазой Ача 11, вьделение вставки кДНК, обработку полученного фрагмента зндонуклеазой Бац 3 А с последующим вьделением фрагмента размером 189 п,о., обработку плазмиды энзима- ми ЕсоК 1 и Рчц 11, обработку полученного фрагмента размером 389 л.о., содержащего Ггр-Промотор, место рибомного связывания и .стартовый кодон, эндонуклеазой ЯацЗА, вьделение фрагмента размером 108 п.о., лигирование полученного фрагмента с фрагментом размером 189 п,о. с помощью ДНК-лигазы, обработку полученной плазмидной ДНК эндонуклеазой Н 1.пй 111, дефосфорилирование, лигирование полученных фрагментов, трансформирование рекомбинаитными плазмидными ДНК штамма бактерий Е. со 1 НВ 101, культивирование штамма, вьделение плазмиды рКНИ 10, обработку плазмиды рКНУ 10 эндонуклеазой Ваш Н 1, инкубирование в присутствии фрагмента Кленова ДНК- полимеразы 1 и четырех дезоксинукле 21 1572объеме 100 мкл, Больший фрагмент получают путем электрофореза в агарозном геле, электроэлюирования и очистки наЕ 1 цгр. Фрагмент о получают путем гидролиза 4 мкг Ача 11-фрагмента, который5содержит Р 9 А 2-кДНК-вставку, с Мсо 1 иА 1 ц 1, гричем получают примерно 2 мкгфрагмента.В последней стадии лигирования фраг-,0мент а и добавленный к нему двукратно гидролизованный ВашН 1/Мсо 1рИИ 10 лигируют в объеме 10 мкл,причем каждой ДНК используют по10 нг, Лигирование достроенного Ваш 15Н 1-сайта рестрикции А 1 ц 1 дает сноваВаш Н 1-сайт рестрикции.Полученной после лигированиясмесью трансформируют компетентные 20клетки Е. со 11. НВ 101 аналогично описанному. Из полученных 40 колонийвыбирают одну, она получила названиерКНИ 12.Плазмиду изолируют и ЕсоК 1/Ваш 25Н 1-вставку секвенируют дидезоксиметодомПлазмида имеет ожидаемуюпоследовательность.в. Получение плазмиды рКНЧ 11,Осуществляют аналогично примеру 30 ф о р м у л а и з о б р е т е н и я4 б. 1 мкг плазмиды рКНУ 10 гидролизуют Ваш Н 1 Острые концы полученныхДНК делаются тупыми с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимераэы 1 и 4дезоксинуклеозидтрифосфатов, затемлинеаризированную ДНК разрезают с35помощью Исо 1. Больший фрагмент получают электрофорезом в агарозном геле,электроэлюированием и колоночнойхроматографией по типу элюирования, 40Исо 1-А 1 ц 1-фрагмент выделяют изклона Е 76 Е 9 аналогично примеру 4 б,Затем 10 нг векторной части лигируютс 10 нг кДНК-части в объеме 10 мкл всоответствующих условиях и при применении 1 ед. Т-лигазы. Полученнойсмесью ДНК трансформируют Е. со 1 дНВ 101, Селекцией полученных 45 колоний на содержащих ампициллин 1.В-чашках выбирают клон, который обозначаютрКНИ 11, Выращивают соответствующийклон, вьделяют плазмидную ДНК. Ееструктуру подтверждают наличием нескольких специфических мест разрезарестрикционной эндонуклеазой (А 1 ц 1,ЕсоК 1, Ндпй 111, Исо 1, Рзг 1).г. Экспрессия интерфероновой активности клетками Е. со 1 НВ 101, содержащими плазмиду рИ%12.аАССТТАААС АТСТСТСАТС ТСССТСАСАА ССАТССССТА СТТАССАССА АСАССТТССТ ССТТСТССАС САААТСАССА СААТСТСССС ТТТСТТСТСТ СТСААССАСА СААСАСАСТТ САССТТСССС САССАСАТСС ТАЛААСССАС ССАСТТССАС АЛСССССАТС ТСАТСТСТСТ ССТССАТСАС АТССТССАСС 50 00 150 200 АСАТСАСАСА ТСТТТААСсйСаи 3 А Нз.па 1 П лнгирование полученного фрагмента сфрагментом Исо 1-А 1 ц 11 плазмиды Р 9 А 2или Е 79 Е 9, полученные путем переваривания плазмиды зндонуклеазами, обра 1САТ ССС СТА СТТ АССАСС ААС АСС ТТС Мсо 1СТС СТТ СТС САС САА АТС АСС АСА АТС ТСС ССТ ТТС ТТС ТСТ СТС ботку полученной вставки кДНК энзинами Мсо 1 и А 1 и 1 со следующей нуклеотидной последовательностью: 28 73 ААС САС АСА АСА САС ТТС АСС ТТС ССС САС САС АТС СТА ААА ССС 118 АСС САС ТТС. САС ЛАС ССС САТ СТС АТС ТСТ СТС СТС САТ САС АТС 163 СТС САС САС АТС ТТС АСС СТС ТТС САС АСА САС ССС ТСС ТСТ ССТ 208 ССС ТСС ААС АТС АСС СТС СТА САС САА СТС САС АСТ ССА СТТ САТ 252 САС САА СТС САА САС СТС САС АСС ТСС ТТС СТС САС СТА СТС ССА 298 САА ССА САА ТСТ ССТ СХС ССА АТТ АСС АСС ССТ ССА СТС АСС ТТС 343 АСС АСС ТАС ТТС САС ССА АТС ССТ СТС ТАС СТС ААА САС ААС ААА 388 ТАС АСС САС ТСТ ССС ТСС САЛ СТТ СТС АСА АТС САА АТС АТС ААА 433 ТСС ТТС ТТС ТТА ТСА АСА ЛАС АТС САА СЛА АСА СТС АСА АСТ ААА 478 САТ АСА САС СТС ССС ТСА ТСТ ТСАААТСАТТСТСАТТСАТТААТТТСССАТА 530 ТААСАСТТССАСАТСТСАСТСТССТСААТТСЛАААСАСТСТ ТАТТТССС.СТТТААТСАС 589 АСААТТСАСТСАЛТТАСТТСТССАААТАСТТТСТСССТАТАТТААСССАСТАТАТСТТА 648 ААААСАСТТАССТТСАСССССЛТСЛСТСССТЛЛСАТСТТАТТТАТТТТТАСТСАТТТАТ 707 ТТАТТСТТАСАТТТТЛТСАТАТТТАТАСТАТТТАТАТТСТТАТАТААСАААТСТТТССС 766 ТТТАСАТТСТАТТЛЛСАТЛАСАЛЛАСАТСТТСАСсй 802А 1 ы 11где Х - нуклеотид С или А, рекомбинантной плазмидной ДНК с посхроматографии, лигирования и трансфор- ледующим выделением целевого продукта. мации штамма бактерий Е. со 1 НВ 101 Составитель Н, Кузенкова Редактор М. Петрова Техред М.Дидык Корректор Н КорольЗаказ 1524 Тираж 49,8 ПодписноеРчИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,Ужгород, ул. Гагарина,101 23 ,157241 озидтрифосфатов, обработку эндонуклеа,зой Мсо 1 с последующим выделением большего фрагмента плазмиды рКНУ 10,Нь.пй 111 БаиА Мсо 1 9 24которая в Н 1 пй 111-сайте плазмиды рЕК 103 содержит ДНК фрагмент со следующей нуклеотидной последовательностью:Предпочтительнее собирать (накацливатт ) мРНК в области около 128 (примерно 800 - 1000 оснований мРНК) .В этой области седиментирует специфическая для К - и 3 -интерферонов5мРНК, мРНК из этой области градиентов концентрируется благодаря осаждению ирастворению в воде,Составление библиотеки кДНК осуществляют известными методами. мРНКснабжают добавкой олиго-дг. Затем благо -даря добавке четырех дезоксинуклеозид -трпфосфатов (дАТР, дСТР, дСТР, дТТР)и фермента обратной транскриптазы всоответственно буферированном растворе в течение 1 ч при 45 С синтезиру-,оют кДНК, Благодаря экстракции хлороформом и хроматографии на колонкес гелем, например через сефадекс С 50, 2 рочищают гибрид кДНК/мРНК. ГНК гидролизуют благодаря обработке щелочью(0,3 моль ИаОН при 50 С, 1 ч), икДНК после нейтрализации с помощьюкислого раствора ацетата натрия 25осаждают этанолом. После добавкидезоксинуклеозидтрифосфатов и Е,со 1 дДНК-полимеразыв соответствующийраствор осуществляют двухнитевой;(двойной) синтез, причем ДНК служитодновременно как матрица и как затравка благодаря образованию структурытипа шпильки на своем 3 -конце (6 чопри 15 С), После экстракции фенолом,хроматографии на сефадексе С 50 и осаждения этанолом ДНК в пригодном растворе подвергают обработке специфической эндонуклеазой Б Т, При этом распадается структура шпильки, а также непревращенная в двойную нить ДНК, 40После экстракции хлороформом и осаждения этанолом двухнитевую ДНК(дз ДНК) разделяют по величине всахарах с градиентом плотности, Дляследующей стадии клонирования предпочтительно применяют только дз ДНКразмером 600 Ьр и более чтобы повнсить вероятность получения клоновкоторые содержат комплектную кодирую-.щую последовательность новых интер 4 эонов. дз ДНК длиной более 600 Ьрконцентрируют из градиентов путемосаждения этанолом и растворения вводе,Для того, чтобы увеличить образо 55вавшиеся дз ДНК-молекулы, их нужносначала внести в соответствующий вектор, а затем в бактерию Е.со 11. Вектор представляет собой плазмиду рВЕ 322. Эта плазмида состоит из репликона и двух селекционных маркеров, Онипридают хозяину резистентность противантибиотиков ампициллина и тетрациклина (Ар , Тс ). Ген для /5 -лактамазы.распознавания рестрикционной эндонуклеазы Рз 1 1. рВЕ 322 можно разрезать с помощью Рзг 1. Выступающие13 -концы удлиняются с помощью концевого фермента дезоксинуклеотидтрансферазы (ТдТ) при помещении дСТР в соответственно буферированный растворОдновременно также на 3-концах удлиняется дз ДНК с помощью фермента ТдТпри применении дСТР. Гомополимерныеконцы плазмиды и дз ДНК смешиваютв соответствующих концентрационныхсоотношениях и при пригодных условияхтемпературы, солевых и буферных условиях.Е, со 11 штамма 11 В 10 (генотип Р-,Ьздз 20 (г-В тп-В) гес А 13, ага,ргоА 2, 1 асЧ 1, яа 1 К 2, грз 1.120 (Бтг),ху 1-5, шг - 1, зпрЕ 44, 1 ашЬда в ) обрабатывают путем выращивания в СаС 1,Компетентный Е. со 1.1 НВ 101 смешиваютс ДНК и после инкубации при 0 С трансформируют полученной плазмидной ДНКпутем теплового нагрева при 42 С втечение 2 мин. Затем трансформированные бактерии помещают на содержащиететрациклинагаровые пластинки (10 мкгна 1 мл), На этом агаре могут раститолько Е. со 11 НВ 101, которые восприняли векторную или рекомбинантнуювекторную молекулу (Тс ), Рекомбинантные вектор-д ДНК-молекулы передаютз,хозяину генотип Ар ТС , так как благодаря введению дз ДНК в-лактамазуген разрушается информация для-лактамазы. Клоны переносят на агаровыепластинки, которые содержат 50 мкг/млампициллина. Растет только примерноЗЕ, что означает, что.97 К клонов содержат вставку дзДНК-молекулы. Из них28600 клонов переносят индивидуальнов лунки (выемки) пластинок для микротитрования, которые содержат питательную среду, 10 мкг/мл тетрациклина и глицерина, После того, какклоны увеличиваются в них, пластинкиохранят при -70 С (кДНК-библиотека),Клоны после размораживания переносят на нитроцеллюлозные фильтры, Эти фильтры расположены на содержащем тетрациклин питательном агаре. Послеувеличения колоний бактерий ДНК бактерии фиксируют на фильтре.В качестве образца служит предпочтительно вставка клона рЕКЗЗ, которая содержит ген для 1 РИ- - 2-Агя, Благодаря никтрансляции этот кусок ДНК радиоактивно маркируют, причем применяется ДНК-полимераза 1, с 1 АТР, ЙСТР, йТТР и с Г-с 1 СТР, Нитроцеллюлозные фильтры при пригодных нестрогих условиях гибридизации предварительно прежде всего обрабатывают без добавки радиоактивного образца и затем гибридизируют примерно в течение 16 ч при добавке радиоактивного образца, После этого фильтры промывают также в нестрогих условиях. Благодаря низкой строгости (точности) гибридизации и промывки охватывают не только со держащие интерферон-Ф,2-Агд-клоны, но также другие интерферонсодержацие клоны, последовательности которых могут заметно отклоняться от последо-. вательностей до сих пор известного ин терферона-К. После высушивания фильтры экспонируют на рентгеновской пленке. Почернение, которое четко находится над уровнем фона, показывает наличие клона со специфическими ин. - терферону последовательностями.Так как,сигналы радиоактивности имеют различное качество. то положительные клоны. подозреваемые как положительно реагирующие клоны, выращивают в маленьком масштабе, Плазмидную ДНК-молекулы изолируют, переваривают с рестрикционной зондонуклеазой Рз 1 1 и разделяют по размеру электрофоретически на агаровом геле (геле агарозы) 4 О ДНК в геле агарозы (агаровом геле) по методу Саутерна переносят на нитроцеллюлозный фильтр. ДНК этого фильтра гибридизируют с помощью радиоактивного, содержащего 1 РИ-ген, денатуриро ванного образца, В качестве положительного контроля служит плазмида 1 Р 7 (хранится в ПЯ М под номером 2362), содержащая ген для интерферона 0-2- агя. Ауторадиограмма четко показывает что клон Р 76 Е 9 и клон Р 9 А 2 содержат последовательность, которая гибридизируется при нестрогих условиях с помощью гена интерферона 06 -2-Агя, Для того, чтобы подробнее охарактеризовать Йз ДНК-вставку клона Е 76 Е 9 и клона Р 9 А 2, плазмиды этих клонов приготовляют в большем масштабе. ДНК переваривают различными рестрикционными эндонуклеазами, например с А 1 ц 1, Бац ЗА, Вя 111, Ндпй 1, Рз 1 и;Нае 111Образовавшиеся фрагменты ,разделяют в агаровом (агарозном) геле, Благодаря сравнению с,соответствующими маркерами величин, например с фрагментами, которые образуются путем переваривания рВК 322 с рестрикционной эндонуклеазой Н 1 пГ 1, соответственно Нае 111, определяют размеры фрагментов, Определяют последовательность этих фрагментов. Сделан вывод, что в случае вставки клонов, Е 76 Е 9 и Р 9 А 2 речь идет о до сих пор неизвестных интерфероногенах, а именно о омега-интерферонах.Информацию об омега-интерферонах используют для того, чтобы переварить кДНК-ставку с рестрикционными эндонуклеазами. Образовавшиеся фрагменты лигируют в с 1 з ДНК-форму (репликативная форма) М 13 тпр 9 и секвенсируют с помощью дидеокси-метода Бащег. Однонитевую ДНК рекомбинантных фагов изолируют. Послесвязывания синтетического олигомера в четырех отдельных приготовлениях осуществляют двухнитевые синтезы при применении большого фрагмента ДНК-полимеразы 1 из Е.со 1 (фрагмент Кленова). В каждой из четырех частичных реакций добавляют один из четырех дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ЙЙАТР; ййСТР; Йс 1 СТР; ЙЙТТР), Это приводит к статистически распределенным обрывам цепи в тех местах, на которых в матрице ДНК находится дополнительное к соответствующему дидезоксинуклеозидтрифосфату основание. Кроме того, дополнительно используют радиоактивно маркированный ИМАТР, По окончании реакции синтеза продукты денатурируют и однонитевые ДНК-фрагменты разделяют по величине в денатурирующем полиакриламидном геле. После этого гель экспонируют на рентгеновской пленке, Из ауторадиограммы можно определить ДНК-последовательность рекомбинантного М 13 фага. Последовательность вставки различных рекомбинантных фагов определяют с помощью пригодной компьютерной програмИзолированная кДНК клона Е 76 ЕД для омега (С 1 ц)-интерферона длиной 858пар оснований имеет 3 -нетранслированную область. Область, которая кодирует зрелый омега (С 1 ц)-интерферон,1572419 доходит от нуклеотида 9 до нуклеотида 524. Изолированная кДНК клона Р 9 А 2 для омега (С 1 ц)-интерферона длиной 877 пар оснований, кодирующаячУзрелыи омега-интерферон, доходит от нуклеотида 8 до нуклеотида 523, 3 - Нетранслированная область в случае Р 9 А 2 доходит до поли-А-отрезка (участка).10ДНК-последовательность, кодирующая омега-интерферон, полностью содержится в клонах Е 76 Е 9 и Р 9 А 2. Они начинаются на М-терминальном конце аминокислот цистеин-аспарагиновая кислота - лейцин, Оба зрелых омега-интерферона имеют длину 172 аминокислоты, что четко отклоняется от длин обоих известных интерферонов, например 166 (соответственно 165),аминокислот 20 .в случае с -интерферонов, Оба оме Характеристика Омега Альфа Длина протеина в аминокис 166 172 лотахПотенциальноеместо Н-гликозилирования в положении 78%Интерферон альфа-Л имеет только165 аминокислот.Интерферон альфа-Н имеет потен- М Мциальное место для Б-гликозилирования в положении 75,лизат бактерий после его роста испытывают в тесте сокращения пятна,Однако гены. экспрессируются в 45 плазмиде экспрессии рЕК 103, таккак этот вектор содержит все регуляционные элементы, которые приводят к высокой скорости экспрессии клонированных генов. Согласно изобретению 50 в плазмиде рВК 322 более короткийЕсоК 1/Ваш Н 1-фрагмент заменен ДНК- последовательностью формулы БацЗА ЕсоК 1 даайсасясС САТСССТААААСАТТСТССАААААСАСССТТСАСТТТСССТТССССА 591 шКНА-БйагсАССАСТТААСТАСТАСАСААСТТСАССССААСССТААССАССТТТААССТТАААС АТС 116КВБ Нпй 111 Е. со 11 НВ 101 с плазмидой Е 76 Е 9 и Е. со 1 101 с плазмидой Р 9 А 2 депонированы (3.7,1984) в немецкой коллекции микроорганизмов (1 Б М Соейпдеп) под номером 11 БМ 3003, соответственно ВБИ 3004,Для доказательства того, чтовновь найденные клоны продуцируютподобную интерферону активность,например культивируют клон Е 76 Е 9, и га-интерферона обладают потенциальнымучастком И-гликозидирования в положении 78 аминокислот (аспарагин-метионин-треонин),Сравнение ДНК клона Е 76 Е 9 и клонаР 9 А 2 показывает различие. Кодирующийаминокислоту 111 триплет в клонеЕ 76 Е 9 представляет собой САС и кодирует глутаминовую кислоту, в то время как этот триплет в клоне Р 9 А 2 представляет собой ССС и кодирует глицин,Оба омега-интерферон-протеина поэтому различаются одной аминокислотойи обозначаются как омега (С 1 ц)-интерферон (Е 67 Е 9) и омега (С 1 ц)-интерферон (Р 9 А 2) .ФСравнение обоих омега-интерферонов с до сих пор известным человеческим К -интерфероном дает следующую картину (см,таблицу),15724 Суз АврТСТ САТ СБацЗА 1 ГИ - ошеда - Сеп -1, Получение необходимых для этойцели отдельных фрагментов ДНК, Фрагмент а. 10 Для получения фрагмента а плаэмиду, которая содержит ген для 1 РИ-омега, например плаэмиду Р 9 А 2, перева 5 10 15 Н 1 з С 1 у Ьец Ьец Бег Ага Азп ТЬг Ьец СИсо 1 САТ ССС СТА СТТ АСС АСС ААС АСС ТТС 2820 25 30 Ча 1 Ьец Ьец Нв С 1 п Иег. Аг Аг 8 11 е Бег Рго РЬе Ьец Сув Ьец СТС 734561 уССС 11860Иег СТС САС САА АТС АСС АСА АТС ТСС35 40 Ага Ага Азр РЬе Агу РЬе Рго С 1 п АСА АСА САС ТТС АСС ТТС ССС САС50 55 Ьец С 1 п Ьув А 1 а Н 1 в Ча 1 Мег Яег АТС 163 75 А 1 аТТС САС ААС ССС САТ СТС АТС ТСТ65 70 С 1 п 11 е Рйе Бег Ьец РЬе Ндз ТЬг Ьец С 1 п С 1 ц Ага Бег Бег САС АТС ТТС АСС СТС ТТС САС АСА80 85 Азп Мег ТЬг Ьец Ьец Авр С 1 п Ьец ССТ 20890Нь.з САС ССС ТСС ТСТ Н 1 з ТЬг С 1 у Ьец СТС САС А 1 а Тгр ССС ТСС ААС АТС АСС СТС СТА САС САА СТС САС АСТ ССА СТТ САТ 25395 100 105С 1 п С 1 п Ьец С 1 п Нв Ьец С 1 ц ТЬг Суз Ьец Ьец С 1 п Ча 1 Ча 1 С 1 у САС САА СТС САА САС СТС САС АСС ТСС ТТС СТС САС СТА СТС ССА 298110 115. 120С 1 ц С 1 у С 1 ц Бег А 1 а 61 у А 1 а 11 е Бег Бег Рго А 1 а Ьец ТЬг ЬецСАА ССА САА ТСТ ССТ ССС ССА АТТ АСС АСС ССТ ССА СТС АСС ТТС 343125 130 135Аг Аг Туг РЬе 61 п С 1 у .11 е Агд Ча 1 Туг Ьец Ьуз 61 ц Ьуз Ьуз АСС АСС ТАС ТТС САС ССА АТС ССТ СТС ТАС СТС ААА САС ААС ААА 388140 145 150Туг Бег Авр Суз А 1 а Тгр С 1 ц Ча 1 Ча 1 Ага Мег С 1 ц 11 е Мег. ЬузТАС АСС САС ТСТ ССС ТСС САА СТТ СТС АСА АТС САА АТС АТС ААА 433155 160 165Бег Ьец РЬе Ьец Бег ТЬг Азп Мес С 1 п 61 ц Ага Ьец Аге Яег Ьуз ТСС ТТС ТТС ТТА ТСА АСА ААС АТС САА САА АСА СТС АСА АСТ ААА 478 170Авр Ага Азр Ьец С 1 у Бег Бег САТ АСА САС СТС ССС ТСА ТСТ ТСАААТСАТТСТСАТТСАТТААТТТСССАТА 530 СТС СТТ Ьув Азр ААС САС Бег С 1 п АСС САС 19 1 Оривают с рестрикционной эндонуклеазой Ача 11. После хроматографии и очистки полученной кДНК-вставки ее переваривают с рестрикционными эндонуклеаэами В со 1 и А 1 ц 1 двукратно и после этого изолируют с помощью хроматографии и электроэлюирования.Этот фрагмент содержит большую часть соответствующего омега-интерфероногена. Так, например, омега (61 у)-интерфероноген клона Р 9 А 2 имеет следующую структуру; ССТ ТТС ТТС ТСТ С 1 ц Мег Ча 1 Ьув САС АТС СТА ААА Ча 1 Ьец Нв С 1 ц СТС СТС САТ САС12 1572419 ТААСАСТТССАСАТСТСАСТСТССТСААТТСАЛЛАСАСТСТТАТТТССССТТТААТСАС 589 АСААТТСАСТСААТТАСТТСТССЛААТАСТТТСТСССТЛТАТТААСССЛСТЛТАТСТТА 648 АЛААСАСТТАССТТСАСССССАТСАСТСССТААСАТСТТАТТТАТТТТТАСТСАТТТАТ 707 ТТАТТСТТАСАТТТТАТСАТАТТТАТАСТАТТТЛТАТТСТТАТЛТААСЛААТСТТТССС 766 ТТТЛСАТТСТАТТААСАТААСАААЛСАТСТТСАСсг 802 А 1 ц 1 Фрагмент б вставки ее переваривают далее с рест 15 рикционной эндонуклеазой БацЗА ижелательной длиной 189 Ьр фрагментизолируют с помощью хроматографиии электроэлюирования. Он имеетследующую структуру:20 5 10 15Аяр Ьец Рго С 1 п Аяп Нхя С 1 у Ьец 1,ец Бег Ага Аяп ТЬг ЬецЯацЗА САТ СТС ССТ САС ААС САТ ССС СТА СТТ АСС ЛСС ААС АСС ТТС 42 20 25 307 а 1 Ьец Ьец Н 1 я С 1 п Мей Агя Агя 11 е Яег Рго РЬе Ьец Суя Ьец СТС САС САА АТС АСС АСА АТС ТСС ССТ ТТС35 40Ага Аяр РЬе Аге РЬе Рго С 1 п С 1 ц Мес Ча 1 ТТС ТСТ СТС 87 45 1,уя С 1 уАСА АСА САС ТТС АСС ТТС ССС САС САС АТС 50 55 Ьец С 1 п Ьуя А 1 а Н 1 я Ча 1 Мег Бег Ча 1 1.ецСТА ЛАА ССС 132 60 Ня С 1 ц МегАСС САС ТТС САС ЛАС ССС САТ СТС АТС ТСТ СТС СТС САТ САС АТС 177 Ьец С 1 п С 1 п 11 еСТС САС СЛБацЗАя асс 189 40 ЯацЗА ЕсоК 1 даагсас 8 сй САТСССТААААСАТТСТССАААААСАСССТТСАСТТТСССТТССССА 59 АССАСТТААСТАСТАСАСААСТТСАССССААСССТААССАССТТТЛАССТТАААС АТС 116КВЯ Ндпй П 1 Суя Аяр ТСТ аа 1 с ЯацЗА 123 Для получения фрагмента б плазмиду Р 9 А 2 переваривают с рестрикционной эндонуклеазой Ача 11, После хроматографии и очистки полученной кДНКСТС СТТ 1 уя АярЛАС САС Яег С 1 п Фрагмент сДля получения фрагмента с плазмиду рЕК 33 двукратно переваривают с рестрикционными ферментами ЕсоК и Рчц 11. Полученный после фракционирования на агаровом агарозном) геле и очистки фрагмент длиной 389 Ьр, ко-, торый содержит Тгр-промотор, рибосомальное место связывания и стартовый (инициирующий) кодон, затем переваривают с ЯацЗА. Желательный фрагмент длиной 108 Ьр получают путемэлектрофореза на агаровом (агароз-ном) геле, электроэлюирования и очистки на колонке Е 1 цг 1 р. Он имеет следующую структуру:3 5724 9 5Нпд 111ЯацЗА Хсо 1а АССТТАААС АТСТСТСАТС ТСССТСАСАА ССАТССССТА СТТАССАССА 50 АСАССТТССТ ССТТСТССАС САААТСАССА СААТСТСССС ТТТСТТСТСТ СТСААССАСА СААСАСАСТТ САССТТСССС САССАСАТСС ТААААСССАС ССАСТТССАС ААСССССАТС ТСАТСТСТСТ ССТССАТСАС АТССТССАСС 00 50 200 АСАТСАСАСА ТСТТТАаессЯацЗА Ндпд 111 5- АССТТАААСАТСТСТ 3 3 - АТТТСТАСАСАСТАСр 5 35 Лигирование фрагментов б и с.Фрагменты б и с лигируют Т 4-лигазой и после азрушения фермента разЭтот необходимый для получения плазмиды рКН 4 О ДНК-фрагмент можно также приготовить путем применения двух синтетически полученных олиго нуклеотидов: Олигонуклеотид формулыАССТТАААСАТСТСТоставляют дефосфо-. рилированным на своем 5 -конце. 25 Олигонуклеотид формулы 5- САТСАСАСАТСТТТА - 3, киназирует на 5 - конце с помощью Т - полинуклеотидкиназыи АТР. При гибридизации обоих олиго, нуклеотидов получают следующий короткий 30 ДНК-фрагмент: Благодаря этому на конце образуетсятипичный для Нпй 111 5-переход ина другом конце - типичный для БацЗА5-переход,Фрагмент б дефосфорилируют при при менении фосфотазы из телячьего кишечника, Фрагмент б и вышеописанныйфрагмент собирают вместе и связываютдруг с другом с помощью Т 4-лигазы,Так как лигазе необходим по крайней мере один содержащий 5 -фосфатконец, можно связать только кусок синтетической ДНК с фрагментом б илидва синтетических фрагмента по ихБац 3 А-концам. Так как оба полученных в результате фрагмента различаются по своей длине, их можно разделятьпутем селективного осаждения изопропанолом. Таким образом, очищенныйфрагмент фосфорилируют с помощью Тполинуклеотидкинаэы и АТР.Пример 2,11.,Получение экспрессионных плазмид в резают с помощью Н 1 пд 111Этот лигированный фрагмент имеет следующуюструктуру:а. 1 олучение плазмиды рВНИО, Линеаризируют экспрессионную плазмиду рЕК 03 с помощью Н 1 пд 111 и затем обрабатывают фосфатазой телячьего кишечника, После изолирования и очистки таким образом полученную ДНК дефосфорилируют и после этого лигируют с помощью лигированных фрагментов б и с (после их переваривания с Ндпй 111). Затем Е, со 11 НВ 101 трансформируют полученной после лигирования смесью и культивируют на ЬВ-агаре плюс 50 мкг/мл ампициллина, Обладающая желательной структурой плазмида получила название рКНЮО, которая после его репликации служила в качестве промежуточного продукта для получения дальнейших плазб. Получение плазмиды рКНУ 2, К разрезанной с помощью Ваш Н плазмиде рКНИ 0 добавляют фрагмент Кленова ДНК-полимеразыи 4 дезокси- нуклеозидтрифосфата, Полученную после . инкубации линеаризированную и снабженную тупыми концами плазмиду очищают и затем разрезают с помощью Бсо 1, Больший фрагмент, который получается с помощью электрофореза на агаровом (агарозном) геле, электроэлюирования и Е 1 цгдр-очистки по типу элюированяя, лигируют с помощью фрагмента а. Затем смесь после лигирования трансформируют в Е. со 11 НВ О и культивируют на ЬВ-агаре плюс 50 мкг/мп ампициллина, Обладающая желательной структурой плазмида получила название рКНУ 2,л полученной таким образом инкубированной бактериальной культуры (оптическая плотность .0,66при 600 нм).содержит 1 О международных единиц интерферона.157241в. Получение плазмиды рИ%11.К разрезанной с помощью Ваш Н 1 плазмиде рКН 1110 добавляют фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 и 4 дезок, синуклеозидфосфата, Полученная после инкубации линеаризированная,снабженная линейными концами плазмида очищается и затем разрезается с помощью Бсо 1. Большийфрагмент, который получается с помощью электрофореза в агарозном геле, электроэлюирования и Е 1 цр-очистки (по типу элюирования), лигируется с помощью полученного аналогично из плазмиды Е 79 Е 9 фрагмента а, в котором лишь кодирующий 111 аминокислоту - (С 1 у) ССС-кодон заменен на САС-кодон (С 1 п). Затем полученной после лигирования смесью трансформируют Е . со 11 НВ 101 20 и культивируют на .В-агаре. Обладающая желательной структурой плазмида Получила название рКНУ 11, рКНИ 11 экскретирует желательный омега-(С 1 у)-интерферон, 25П р и м е р 1, Нахождение специфических к 1 РИ-последовательности кло-/ нов.а. Приготовление кДНК-библиотеки.мРНК из стимулированных вирусом 30 Бепйах-клеток применяют в качестве исходного материала для приготовлеНия кДНК-банка по известным из литературы методам. Образовавшиеся 30000 клонов переносят индивидуально в углубления (лунки) пластин для микротитрования, Используют следующую среду для роста и замораживания колоний: 10 г триптона," 5 г дрожжевого экстракта; 5 г НаС 1; 0,51 г цитрата 40 натрия Х 2 НаО 7,5 г КНРО 2 НхО;1 8 г КНРО 1 0 09 г М 8 Б 04 7 Н О 0,9 г (ЮЦ)ЯО, 44 г глицерина;0,01 г тетрациклин 1 НС 1; вода до 1 л. 4Для микротитрования пластины с индивидуальными клонами инкубируютОв течение ночи при 37 С и затем хранят при -70 С.б. Гибридизирующая проба (образец).;0В качестве исходного материала гибридизирующего образца служит рекомбинантная плаэмида рВК 33, Эта плазмида содержит кодирующую область для зрелого интерферона 1 РНаге плюс 190 оснований 3 -нетрансляцированной области. 20 мкг реК 33 инкубируют в течение 1 ч при 37 С с 30 ед, Нпс 1 111 рестрикционной эндонуклеаэы в 9 16200 мкл реакционного буфера (10 мМ трис-НС 1, рН 7; 10 мИ МцС 1, 1 мИ дитиотрейтода (ДТТ);50 мМ ИаС 1). Реакцию прекращают добавлением 1/25 объема 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и прогревают прио70 С в течение 10 мин, После добавления 1/4 объема 5 х буфера (807 глицерина; 40 мИ трис-.уксусной кислоты, рН ; 8; 50 мМ ЕДТА, 0,053 додецилсульфата натрия (ЯЭБ); 0,17. бромфенолового синего) образовавшиеся фрагменты разделяют по величине в 1 Е-ном агарозном геле ( гель-буфер и электродный буфер (ТВЕ): 10,8 г/л трис-гидроксиметиламинометана (трис-основания);5,5 г/л борной кислоты; 0,93 г/л ЕДТА). После инкубации геля в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл ) участок геля, который содержит фрагмент ДНК с геном 1 РИ (длиной примерно 800 Ьр), вырезают. ДНК электроэлюируют в 1/10 х ТВЕ-буфере. Раствор ДНК экстрагируют однократно фенолом и четырехкратно эфиром и ДНК осаждают добавлением 1/10 объема 3 М ацетата натрия (На АС), рН 5,8, и 2,5 объемами этанола при -20 С. Осадок ДНК промывают однократно 70%-ным этанолом и высушивают в течение 5 мин в вакууме. ДНК растворяют в 50 мкл воды (примерно 50 мкг/мкл). Эту ДНК метят методом перемещения разрыва: 50 мкл реакционной смеси содержит 50 мИ трис-НС 1; рН 7,8; 5 мМ М 8 С 1, 1 О мМ меркаптоэтанола; 100 нг ДНК- вставки рЕК 33, 16 нг ПИаБе 1; 25 мкм йАТР; 25 мкм с 1 СТР; 25 мкм йТТР;20 мкС 1 1 Ы -Р 1-й СТР (более 3000 Сд/ ммоль), а также 3 ед, ДНК-полимеразы 1 (Е. со 11.). Реакцию проводят при 14 С в течение 40 мин, Реакцию заканчивают добавлением 1 объема раствора, содержащего 50 мМ ЕЭТА 1 27 ЯЭЯ;1 О мИ трис-НС 1, рН ,6, и прогревают при 70 фС в течение 1 О мин. ДНК отделяют путем хроматографии через сефадекс С 100 в ТЕ-буфере (10 мМ трисНС 1, рН 8,0; 1 мИ ЕДТА) от невключенной радиоактивности. Радиоактивно меченный образец (проба 1 имеет. удельную активность примерно 4 хх 10 срм/мкг.тв. Скрининг клонов на содержание вставок гена 1 РИ.Вмороженные в микротитр-пластины бактериальные культуры оттаивают (а).Кусок нитроцеллюлозного фильтра соот 15724ветствующего размера (размер пор .0,45 мкм) помещают на ЬВ-агар (ЬВ- агар:10 г/л триптона; 5 г/л дрожжевого экстракта; 5 г/л ИаС 1; 15 г/л бакто-агара; 20 мг/л тетрациклин 5 НС 1). С помощью приспособленного к микротитропластинкам штампа индивидуальные клоны переносят на нитроцеллюлозный фильтрБактерии выра- О щивают в течение ночи при 37 С до больших (диаметром примерно 5 мл 1) колоний. Для разрушения бактерий и денатурирования ДНК нитроцеллюлозные фильтры помещают по очереди на стопку пропитанных следующими растворами фильтров из ватмана ЗММ:1 - на 8 мин в 0,5 М ИаОН; 2 - на 2 мин в 1 М трис-НС 1, рН 7,4; 3 - на 2 мин в 1 М трис-НС 1, рН 7,4, и 4 - на 20 4 мин в 1,5 М НаС 1, 0,5 М трис-НС 1, рН 7,4, Фильтры высушивают на воздухе и затем выдерживают 2 ч при 80 С. Предварительную обработку фильтрово осуществляют в течение 4 ч при 65 С 25 в растворе для гибридизации, состоящем из бх ББС (1 х ББС соответствует 0,15 М ИаС 1, 0,015 М тринатрийцитрата, рН 7,0), 5 х раствора Денхардта (1 х раствор Денхардта соответствует 30 0,02% РЧР (поливинилпирролидон).;0,02% Рсо 11 (молекулярный вес 400000 0,02% ВБА (альбумин бычьей сыворотки) и 0,1% БПБ (додецилсульфата натрия), На фильтр берут примерно 1 10 срм6 пробы, приготовленной согласно (б), денатурируют кипячением и добавляют в гибридизационную смесь. Гибридизацию проводят в течение 16 ч при 65 С. Отмывку фильтра осуществляют 40 при 65 С четырехкратной промывкой в течение 1 ч в буфере Зх ББС/01% БПБ. Фильтры высушивают на воздухе, покрывают тонкой пленкой и экспонируют на пленке Кодак Х-Ошаз. 45П р и м е р 2, Перенос по Саузерну для подтверждения наличия 1 РИ-гена в рекомбинантных плазмидах.Из колоний, дающих положительный сигнал при радиоавтографии, выращи вают культуры объемом 5 мл в течение ночи при 37 С в ЬВ-среде 00 г/л триптона; 5 г/л дрожжевого экстракта;5 г/л БаС 1; 20 мг/л тетрациклина х НС 1). Плазмидную ДНК выделяют-по 55 ВхгпЬо 1 ш и Ро 1 у, 1,5 мл суспензии клеток центрифугируют и суспендируют при 0 С в 100 мкл.лизисного растовора, состоящего из 50 мМ глюкозы; 19 1810 мМ ЕДТА; 25 мМ трис-НС 1, рН 8,0, и 4 мг/мп лизоцима, Инкубируют 5 мин при комнатной температуре, добавляют 2 объема охлажденного льдом раствора (0,2 М ИаОН и 1% БОБ), инкубируют еще 5 мин, затем добавляют 150 мкл охлажденного льдом раствора ацетата калия, рН 4,8, и инкубируют в течение 5 мин, Образовавшийся осадок отделяют на центрифуге, Раствор ДНК экстрагируют 1 объемной частью смеси фенола с СНС 1(1:), ДНК осаждают добавлением 2 объемов этанола. После осаждения на центрифуге осадок в пробирке промывают однократно 70%-ным этанолом и высушивают в течение 5 мин в вакууме, ДНК растворяют в 50 мкл (ТЕ)-буфера, 10 мкл полученного раствора добавляют в 50 мкл реакционного буфера (10 мМ трис-НС 1, рН 7,5; 10 мМ МяС 1 ; 50 мМ МаС 1, 1 мМ ДТТ), переваривают вместе с 10 ед. РзТ 1-рестрикционной эндонуклеазы в течение 1 ч при 37 С. Затем добавляют 1/25 объема 0,5 М ЕДТА; 1/4 объемао 5 х буфера, прогревают 10 мин при 70 С ДНК разделяют электрофоретически в 1%-ном агарозном геле (ТВЕ-буфер). ДНК из агарозного геля по методу Саузерна переносят на нитроцеллюлозный фильтр. ДНК в геле денатурируют в течение 1 ч раствором 1,5 М ХаС 1//0,5 М ХаОН, Затем в течение часа нейтрализуют раствором 1 М трис х НС 1, рН 8 (1,5 М ИаС 1).ДНК переносят в 10 х БЯС (1,5 М НаС 1; 0,15 1 цитрата натрия; рН 7,0) на нитроцеллюлозный фильтр, После полного переноса (примерно 16 ч фильтр быстро споласкивают в бх ББС-.буфере, затем высушивают на воздухе и после этого прогреваютов течение 2 ч при 80 С. Затем фильтр .ообрабатывают при 65 С в течение 4 ч с помощью бх ББС/5 х раствор Денхардта/0,1% БПБ. Примерно 210 срм гибридизационной пробы денатурируют нагреванием до 00 С и затем вносят в раствор для гибридизации. Продолжительность гибридизации составляет 16 ч при 65 С.П р и м е р 3, Обнаружение интерфероновой активности в клоне Е 76 Е 9.100 мл культуры клона Е 76 Е 9 выращивают в ЬВ-среде (см, пример 2) прио37 С до оптической плотности Ао = 0,8. Бактерии отделяют на центрифуге в течение 10 мин при скорости 7000 об/мин, промывают однократно