Способ получения человеческой м о -дисмутазы

СОЮЭ СОВЕТСНИХсоцидлистичеснихРЕОЪ БЛИН 1)Ь С 12 У 81 ИЗОБР Ен ОП 4 ь О или и И ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТпО изОБРетениям и ОтнРытОРИ ГННТ СССР(71) Берингер Ингельгейм Интернациональ ГмбХ (0 Е)(56) Аналогов в научно-технической ипатентной литеоатуое не обнаружено. (54) СПОСОБ Н 031 УЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ ЖО-ДИСМУТАЗЫ(57) Изобретение относится к биотех- " нологии и генетической инженерии, в Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии,.в частности к способам получения человеческой МпО"дисмутазы для терапев" тических целей, например, в качестве антивоспалительного средства.Способ .заключается в .том, что из .плацентарной или печеночной ткани.человека выделяют мРНК, получают воли . (А)1 РНК, синтезируют двунитевую кДНК,конструируют банк кДНК, выделяютпоследовательность ДНК, кодирующую МаО"дисмутазу, при помощи зондов 1 С С С5- ТОЕТА ТТ ТС ТС 1 СТ 1 АС 1 ТТЖ 1741610 2частности к способам получения человеческой дисмутазы ИпО для терапевтических целей, например, в качестве противовоспалительного вещества. Способ получения человеческой дисмутазы предусматривает конструирование плазмидной ДНК рЧЗ 550 А, или рУЗ 490 А, или рИЗ 491 А,или АЗ 371 А, или рУЗ 372 А, или АЗ 373 А, или рЕ 024- РВ, или рЕ 025 -АС, илирЕ 026 "АО, или рЕ 040, или рЕ 042, или рЕ 043, или рЕ 044, или рЕ 045, или рЕ 050, или рЕ 051, которой трансформируют штаммы Вассйагоаусев сегечхвьае, или плазмид 1 .рЗЧ 2 йЬГг ЗОН или рЗЧ 2 ЙЫг ЗОП 2, которой трансформируют штамиы культивируемых клеток, культивируют транс-. формированные клетки, выделяют и очи-щают целевой продукт путем экстракции, осаждения и хроматографии. 4 табл,С . А5 ТС 1 СТ 1 АС ТТ ТСССАС Т С оследовательности кДНК гена ИпО-дисмутазы человека, последовательность ДНКь д достраивают до стартового кодона или стоп-кодона н епосд венно за стартовым кодоном генаразмещают митохондриальную ли е н или сигна льную последовательность ДНК ИпО челов -дисмутазы З.сегеч 1 з 1 ае илиеловека, последовательность ДНК, ко. дирующую МлО-дисмутазу, используютя конструирования вектора зкспрес1741610,5 г/л литонной кислоты; 15 г/лглутаминрвой кислоты; 0,2 г/л гис" тидина; 0,5 г/л триптофана; 100 г/л глюкозы, получают в Ферментере ем" костью 20 л, В качестве инокулята используют Я количества предвари.тельной культуры. Выращивание осуществляет аэрацией при размешивании(00 об/мин) и постоянном значении 10 рН 5,0 при 28 С.После снижения содержания глюко" эы до 50 г/л еще раэ добавляют 50 г/л глюкозы и продолжают Ферментацию до тех пор, пока содержание 15глюкозы не составит 10 г/л (пример". но через 45 ч) охлаждают, центриФугируют и биомассу замораживают. Выход биомассы 18 г/л влажных клеток,П р и м е р 14. Получение .дрожже вых митохондрий.Для того, чтобы установить при" водит ли введение дрожжевой митохондриальной лидерной последовательности перед геном чИп-Д к импорту протеина в митохондрии изготовляют дрожжевые митохондрии й определяют активность Мп-Д в митохондриях ицитоплаэме.Культуру выращивают путем встря хивания (300 об/мин) при 28 С в те" чеииа ночи, инокулируют в 225 мл среды УР 0 и выращивают в укаэанных условиях в течение ночи. После достижения оптической плотности 5 - 7 35при 6000 нм клетки центрифугируют при6500 еб/мин в течение 5 мин, Клетки промыввют ведой, суспендируют в Мманнита,20 мМ. КР;:(КНРОВ НРО), рН 7,4, добавляют 1 мг/мл цимолаэы с мол.массой 500 и 2 ч встряхивают (50 об/мин) при 28 С, получая сферопласты. Ихоцентрифугируют при 3000 об/мин в те" чение 5 мин, промывают раствором 1 М маннита, 20 мИ КР рН 7,4,мМ 45 фторида Фенилметилсульфонила (ФФИС). Надосадочную жидкость удаляют и добавляют стеклянные шарики диаметром 0,1 мм в количестве, соответствующем 1 - 2 объема промытых клеток. 50Клетки разрушают, суспендируют в 2,5 мл 0,65 М маннита, 1 мМ ЭДТУК,мМ ФФМС, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, Митохондрии выделяют из надосадочной жидкости путем центрифугирования при 12000 об/ /мин в течение 1 О мин. Надосааочная жидкость содержит цитоплаэму и поэтому ее хранят с тем, чтобы потом 0 20исследовать активность Ип-Д Краснокоричневый, центрифугат промывают буФером (белые цитоплазматические компоненты выливают) и затем митохондриисуспендируют в 2,5 мл того же буфера.Загрязнения еще раз удаляют путемцентрифугирования при 4000 об/мин втечение 5 мин. Митохондрии удаляютиз насадочной жидкости путем повторного центрифугирования (при 122000об/мин в течение 10 мин). Митохондрииразрушают при помощи стеклянных ша"риков и, используя активирующий гельих исследуют на содержание Ип-Д.П р и м е р 15. Очистка чМп-Д.Стадия 1: разрушение клеток.1Клетки (пример 13) промывают в1 О мл дистиллированной воды на 1 гвлажной массы и центрифугируют при16000 об/мин в течение 15 мин. Осадокповторно суспендируют в натриевокалиевом фосфатном буФере (50 мМ,рН 7,0) при соотношении 1:3. Затемклетки разрушают в мельнице при помо"щи стеклянных шариков диаметром0,1 мм при расходе 6 л/ч. Экстрактклеток центрифугируют в течение15 мин (16000 об/мин 4 С) и осадокудаляют,Стадия 2: осаждение полиэтиленимином.К надосадочной жидкости первойстадии добавляют 54-ный водный раствор полиэтиленимина (рН 8,0) конечнойконцентрации 0,54. Затем продолжаютразмешивать еще в течение 30 мин иосадок удаляют центрифугированиемпри 16000 об/мин втечение 30 мин..Стадия 3: осаждение путем термообработки.Надосадочную жидкость второй ста"дии при перемешивании нагревают до60 С в водяной бане с температурой80 С, находящейся в стальных стаканах. Затем в ледяной бане охлаждаютдо комнатной температуры. Выпавшийпротеин удаляют центрифугированием(.10000 об/мин, в течение 10 мин при4 С).Стадия 4: осаждение сульфатомаммония,Надосадочную жидкость-стадии 3 на"сыщащт сульфатом аммония до 201 иосадок отделяют центрифугированием(10000 об/мин в течение 15 мин при4 С). Затем концентрацию сульфатааммония повышают до 90 и осадок.отделяют центрифугированием (10000об/мин в течение 15 мин при 4 С).аОсадок поглощают в незначительном количестве (50 мИ, рН 6,0) буфера мор"фолиноэтансульфоната - 2-морфолино"этансульфоновой кислоты (буфер ИЭС)и диализуют в течение ночи с использованием того же буфера.Стадия 5 хроматография на катионите.Колонку, содержащую катионит моно"ЯК 55 уравновешивают 5 объемами буФера ИЭС. После подаци экстракта наколонку несвязанные протеины промывают 5 объемами буфера ИЭС. Затемчйп-Д элюируют 20 объемами буфераИЭС с линейным градиентом от 0 до50 мй ВаС 1. Фракции, содержащие активность Ип-Д, объединяют и диали"зуют с использованием натриево-калиевого Фосфатного буФера (5 мй.,рН 7,0).Стадия 6; хроматография на гидроксилапатите.На уравновешенную Фосфатным бу"фером (5 мй, рН 7,0) колонку гидроксилапатита подают диализат стадии.5и чйп-Д элюируют 20 объемами нат"риево-калиевого фосфатного буфера срН 7,0 с линейным градиентом от 5до 300 мй указанных солей. За степенью очистки цйп-Д наблюдают припомощи электрофореза в полиакриламидном геле с использованием ДСН.В результате очистки получают21 мг (1, 16 .мг/клетки) чИпо-дисму"тазы.П р и м е р 16, Характеристикачйп-Д.Очищенную чйп-,я анализируют припомощи жидкостной;гельхроматографии под давлением, жидкостной хроматографии с обратной фазой поддавлением, гельэлектрофореза с исподьзованием ДСН, нативного гельэлектрофореза и изоэлектрицескогофокусирования и сравнивают с естественной цйп-Л,а). Жидкостная гельхроматографияпод давлением. Колонка: Уотерс Протеин Пак 1125,2 Ф(7,8 х 300 мм), диаметр частицгеля 10 мкй; элюент: 0,5 И Ва 8040,02 И БаНР 04, рй 7,0, 0,04 Твин20, 253 пропиленгликоля; скоростьподачи 0,5 мл/мин; детекция: погло-щение Уф, 214 нм. 22Естественная и получаемая предлагаемым способом чйп"Л показываетглавный пик тетрамера энзима примол. массе 70000 и 76000 соответственно, причем градуирование осуществляют с использованием четырех стандартных протеинов.б). Жидкостная хроматография собратной фазой под давлением.Колонка: Бакербонд ВП С 48 4 бхМ 250 мм, 5 мкм диаметра частиц, диа"метр пор: 30 нм; элюент А: О, 1 Ф-наятрифторуксусная кислота в воде;элюент Б; О,И"ная трифторуксуснаякислота в ацетонитриле;,градиент:203 Б в течение 2 мин, 20 - 683 Б втечение 24 мин, 68 Б в течение10 мин, 68 - 20 Б в течение 1 мин;скорость подачи 1.,6 мл/мин детекция: поглощение Уф, 214 нм и 280 нм.Естественная и получаемая предлагаемым способом чйп-ДП проявляют время удерживания около 21 мин (20,7 и20,9 мин, соответственно).в). Гельэлектрофорез с использованием ДСН.Разделительный гель - 153 акрил.амида; стекинг-гель " 4 У акриламида;окраска серебром; величина геля0,75 мм (8 х 10 см); режим: 60 мин,150 а,При подготовке проб для цйп-Дпробы смешивают с ДТТ в качестве восстановителя и кипятят. В геле ДСНобнаруживается мономер цйп-Я с мол.массой около 25000. В зависимостиот степени полноты реакции восстановления можно доказать также наличиететрамера с мол. массой около 90000.г). Нативный гельэлектрофорез.Разделительный гель - 7,5 Ф полиакриламидный гель, стекинг-гель - 2 Факриламида + сахароза; величина геля 0,75 мм (8 х 10 см); режим; 75 мин,150 В; окрашивание кумасси голубым.Получаемая после хроматографиина гидроксилапатите чйп-Д проявляетпосле электрофореза как после окрашивания кумассисиним (нанесенноеколичество цйп-,Д 0,3 мкг), так и после активирующего окрашивания о-дианизидином единую и находящуюся в томже положении полосу,д). Изоэлектрицеское Фокусирование.Пределы значения рН 3,5 - 9,51гелевые пластинки 1.КВ (1 ммх(9 х 10 см);электродные растворы; 1 й Фосфорная 5 О 5 20 25 30 35 40 45 50 5517416 ьХЬо 1. Рчи 11СтартЕВТ 917 9 ТССАСТАТАСААТСТТСАСССООССАСТОТСССССАССАССАСССАОСТСССТСССЕВТ 919 3. САТАТСТТАСААСТСССССССТСАСАСССССТСОТССТСССТССАСОСАССЕЬуэСТТТТССССТАТСТССССТССАСССАСААССАСТСТТТСССАСАСТТСССАТАССАСТАСССТССТСААААССССАТАСАССССАССТСССТСТТССТСАСАААСССТСТСААСССТАТССТСАТСССАССЛ кислота (анод), 1 М натриевый щелок (катод); температура охлаждения УзС объем проб 4,0 и 6,5 мкг соответственно 9 режим: пРеДваРительное ФокУ" сирование 500 Вч; фокусирование 3000 Вч в целом;, окраска: кумассиголубой, о"дианиэидин.В качестве изоэлектрической точки определяют р 1 щ 89 15.ОП р и м е р 17. Конструкция кДНК" генобанка из печеночной ткани человека.Аналогично примеру 1 иэ свежей печеночной ткани (приблизительйо 1 кг) выделяют РНК, получают:поли(А) РНК и синтезируют кДНК. Получение ф ВсО- генобанка осуществляют аналогично примеру 1.П р и м е р 18. Использование гена ИпО-дисмутаэы в качестве ДНК- зонда,1.Полная кДНК гена МпОв-дисмутазы (пример б) используется в качестве 5 радиоактивно маркированного ДНК- зонда, 5 мг плазмидной ДНК НЗОР 6 гидролизуют рестриктазами ВсоК 1 и ХЬо 1. После разделяют в 1 Ф-ном ага" роэйом геле из геля выделяют ДНК-фраг"30 мент с длиной 600 п.о., содержащий ген. Мп 09-дисмутаэы 9 его радиоактивно метят и используют в качестве ДНК-зонда.Реакционная смесь: 5 мкл 1 ОфНИКтрансляционного буфера; 1 О мкл ДНК"е Плазмиду НЗ 006 гидролизуют рестриктазами ХЬо 1 и ХЬа Х:и вставляют линкер с длиной 122 п.о. (ХЬоХ-человеческий.митохондриальный лидер ; хЬа х). Получает плаэмиду РКН 22-АВ переваривают ее рестриктазами ХЬо 1 и Есо КХ (по 5 ед. мкг ДЙК) и вставляют в рКН 1, Получают плазмиду рКН 23"А.Полученную таким образом экспрессионную кассету аналогично примеру 12 по сайтам ВЕ 111/НЫЙ 1 ХХ(после двойного переваривания плазмид и 1024Фрагмента; 15 мклК РОвйСТР/30000 С г (ммоль, водный раствор); 1 мкл 1 мМ ИМАТР; 1 мкл ТТР; 1 мкл 1 мМ 4 СТР;5 ед ДНК полимеразы 1; вода до, 50 мкл.10 ЯНИК трансляционный буфер со" держит 0,5 М трис-НС 1, РН 7,2;0,1 м ИЕЗО , 1 мМ дитиотреитола 9 500 мкг/мл альбумина из сыворот" ки крупного рогатого скота.Реакцию ведут в течение 1 ч при 14 фС и прекращают добавлением 5 мкл 250 мМ ЭДТУК. Несвязанную радиоактивность удаляют на колонке с биогелем Рб-ЭС. В качестве злюента используют буфер ТВ. Гибридизацию осуществляют согласно примеру 3.П р и м е р 19, Включение митохондривльной человеческой лидерной ДНК-последовательности МпО-дисмутаае зы перед геном ИпО-дисмутвзыСовместной гибридизацией двух . синтезированных олигонуклеотидов ,(ВВ 1 97 ЕВХ 919) получают ДНКФрагмент длиной 122 п.о. с ХЬо 1//ХЬа 1 выступающими концами. Этот фрагмент соответствует приведеннойв примере 6 Формуле ОП 1, с той раз-ницей, что между стартовым кодономАТС и кодойом для лизина ААС вклю"чают человеческую лидерную ДНК".последовательность.ДНК-последовательность, содержа-щая вставку с человеческим геномМпО-дисмутазы, имеет следующуюструктуру. евыделения зкспрессионной кассеты)вставляют векторы. Ир 39 рХРВ 207 ирЕА 8102 по сайтам Ваа Н 1 и НЫд 111,В табл,2 указаны соответствующиеплазмиды,Таблица 2 ю е ее е е ее в е, е в е е в е е е е в е ее е е е ее е е ее е е е е е е е в в е Вектор Получаемая пла амида еевевеевееее еввевеееевеееееееееееве рХЭВ 207 рКН 24 АВ1751610 26 ТСЕВ 1 167СТААЛТАСЛАТАТСААССТАСАЛАААССАТАСААТСААСТАСААСААССАТТТАТСТТАТАСТТССАТСТТТТТССТАТСТТАСТТСАТТСААСТАТТААСАСТТСАТААТТСАССТ 5 ЕВ 1 1160ХЬо 1Олигонуклеотидная пара й 2 (01.2) из ЕВ 1 1161/ЕВХ 1164 + ЕВ 1 1159/ЕВ 1 1168 ЕВ 1 161 ССТАТСАСАТАТЛААТАСАСТСССАСТАСССЛСТТТТТТСАСАСТСССТЛСССАТАСТСТАТАТТТАТСТСАСССТСАТСССТСЛЛААЛАСТСТСАСг 25дрожжевой штамм УЗЗОВ аналогич- ХЬо Х-сайта. Зрй ХХЬо Х-фрагмент, но примеру 1 О,трансформируют зкс- содержащий стыковое место между прессионной плазмидой РКН 24-АВ. промотором и геном, заменяют олигоЭкспрессию плазмиды РКН 24"АВ в нуклеотидными парами для того, чтобы5фю штамме МЗЗОЕ подтверждают, исполь- Удалить кодиРУюЩии Участок гена зуя методику примера 13. АРН 1 Х и вставить правильный переходДля подтверждения того, приводит к гену ИаО-дисмутазы. Конструируют ли введение дрожжевой митохондриаль различные олигонуклеотидные пары ной лидерной последовательности перед 10 ОХ 1 в 01-2 и ОХЭ аналогично примеру 11 геном ИлО"дисмутазы к тому что про- или 3 б, которые незначительно отлиУюф аю теин вводится в митохондрии, получают чаются длинои нуклеотиднои последодрожжевые митохондрии согласно при- вательности промоторной части. меру 14 и анализируют активность Согласно примеру 13 осуществляет мпО -дисмутазы в митохондриях а так" 5 Реакции гибридизации комплементарныхй Уде в цитоплазме, олигонуклеотидов:П р и м е р 20. НЕВ 1 116/БВХ 1164Конструкция экспрессионной кассеты И 2 ЕВ 1 1167/ЕВХ 1160 с промотором АРН 11 (спиртовой дегид- Нф 3 ЕВХ59/ЕВ 1 1168 рогеназы 11) . И 4 ЕВХ 1165/ЕВХ 1166В экспрессионной кассете РКН 1(пример бб) промотор АРНХ заменяют Синтезы ЕВХ 1164, ЕВХ 1167, ЕВ 1 1159, промотором ЛРН 11 по сайтам ХЬо 1/ ЕВ 1 1165 и лигирование олигонуклео/Ваа Н 1. Промотор АРН 11 выделяют из довплазмиды рай% 5 - АРН 11(В(Х, Плазмида 25 И+ И 2 = 01,1 РИ 1 5-АРН 11 В/Х содержит фрагмент+3 = ОХ.2 Ваш НХ/Н 1 пй 111, содержащий промотор г 1 + ,4 = ОХЗ ЛРН 11 и имеющий участок гена АРНХХ с тем, чтобы получить три олигонук п,о. ЕсоКХ-сайт рестрикции в леотидные пары 01,1, 01.2 и ОХЗ со начале кодирующего участка с помощье 30 следУющими ДНК-послеДовательноствми: линкера превращают в ХЬо 1-сайт рест. Олигонуклеотидная пара Ю (ОЫ) рикции, причем получают два Вав НХ- из ЕВХ 1161/ЕВ 1 1164 + ЕВ 1 167/ сайта, расположенные с обеих сторонЕВ 1 6рЬХ5 сССТАТСАСАТАТАААТАСАСТСССАСТАСССАСТТТТТТСАСАСТСССТАСССАТАСТСТАТАТТТАТСТСАСССТСАТСССТСААААААСТСТСАССЛЛАТАСТСТТЛСТАСТССТСТСТТСТТСТТТТТЛТСАСТТСТТСТТТСТТСТТТТАТСАСААТСАТСАССАСАСЛАСЛАСАААЛАТЛСТСААСЛАСАААЕВХ 3164 51711610 27 8АААТАСТСТТАСТАСТССТСТСТТСТТСТТТТТАТСАСТТСТТСТТТСТТСТТТТАТСАСААТСАТСАССАСАСААСААСАААААТАСССААСААСАААЕВ 1 1164 5 ТСЕВ 1 11595 СТАААТАСААТАТСААССТАСАААААССАТАСААТСААСТАСААСААССАТТТТАТСТТАТАСТТССАТСТТТТТССТАТСТТАСТТСАТТСААСТАТТААСТАТАТСАСТТСАТААТТСАТАТАСАССТ 5 ЕВ 1 1168ХЬо 1 Олигонуклеотидная пара Мф 3 (ОЬЗ)из ЕВ 1 1161/ЕВХ 1164 + ЕВ 1 1165//ЕВХ 116615ЕВХ 1161ССТАТСАСАТАТАААТАСАСТСССЛСТАСССАСТТТТТТСАСАСТСССТАСССАТАСТСТАТАТТТАТСТСАСССТСАТСССТСААААААСТСТСАССАААТАСТСТТАСТАСТССТСТСТТСТТСТТТТТАТСАСТТСТТСТТТСТТСТТТТАТСАСААТСАТСАССАСАСААСААСАААААТАСТСААСААСАААФЕВХ 1164 ЯАРН 11 - промоторнуе часть выде- Т а б л и ц а 3 ,ляют путем последовательного гидролиза рестриктазами перевариванияВектор + промотор Экспрессионная ХЬо 1 и Ваш Н 1 и вместо АРНХ-промо- плазмида тора вводят в экспрессионную кассетурКН 1. В результате использования трех р 1 РВ 207-АРНП-ОЬ 1 рЕ 040 различных олигонуклеотидных пар полу- рХРВ 207-АРНХХ-ОЬ 2 рЕ 041 чают три различные экспрессионные рХРВ 207-АЭН 11-ОЬЗ ,рЕ 042 кассеты:УЕР 13-АРНХХ-ОЬ 1 рЕ 043рКН 1 " АРНХХ-ОЬ 1 ТЕР 13-АРНХХ-ОЬ 2 рЕ 044. рКН 1 " АРН 11-ОЬ 2 35 УЕР 13-АРН 11-ОЬЗ рЕ 045рКН 2 А 111 3 Дрожжевой штамм УБЗОЕ трансфорКН 2 - АРН 11"ОЬЗмируют экспрессионнымвплазмидами,во все три АРН 11"экспрессонные кас" 13 исглелуют на эксп е си сеты. Снабженные геном ЙпО-дисму"тазы экспрессионные кассеты вырезают Конструкция экспс помощью ВЕ 1 11 и Нжй 111 и через ты с промотором тионеина/медисайты рестрикции Ваш Н 1 и НЫд 111 45 (СОР 1) .лигированием вводят в дрожжевыеПромотор СУР 1 анал ганалогично примерувекторы рХР 207 и УЕр 13 аналогично 20 путем замены АРН 11-промотора примеру 8.встраивают в рКН 1 по сайтам рестрикции Ваш Н 1 и ХЬо 1, ДрожжевойДрожжевые экспрессионные плазмиды 50 промотор СОР 1 лигируют с 8 олиго"с промотором АРН 11 приведены в нуклеотидами, синтезированными анатабл.3.ЕВ 11691логично примеру 3 б или 11.Ваш Н 15САТСССАТТАСССАСАТТТССССССТАТАССТССАТАТСТТСАТСТАТСТАТСТСТАТТТААААСАСТТТТСТАТТАТТТТТССТСАТАТАТСТСТАТАССТТТАТАСССАТСАТТТААТТАТТАСТТСАЕВ 1 16921711610 5СОСТССТСЛАОТААТААТТАААТСАТСССТАТАААССТАТАСАСАТАТАТОАСОААЛААТААТАСААААСТСТТТТЛААТАСЛСАТАСАТАСАТОААСАТАТССАССТАТАОСОСССАЛАТСТСССТЛЛТСС ЕВХ 16965ССАСССТТТАТТТСАООСТОАТАТСТТАСССТТСТТАСТАОТТАСАААААСАСАТТТТТССТСТСАСТСАСТСТСЛЛСАСЛТТСТТТТОСТОССАТТТСТТ ЕВ 1 170451СТАСЛЛСЛЛАТСССАССААААСЛАТСТСТТСЛСАОТСАСТСАСАОСАААААТСТСТТТТТСТААСТАСТААСЛАСССТАЛСАТАТСАСССТОАААТАААКВХ 1711ХЬа 1СТАСААССААЛААСАСССАТОССТСТТТТССССТСААСССТТССАССЛААЛЛЛСЛСТЛССЛЛСССЛЛТЛТССЛТТСТСЛСЛЛТСЛТЛТЛАААСАОЛАССЛААТЛАЕВ 1 1710СААССАСТТАТТТССТТСТСТТТТАТАТСЛТТСТСАСАЛТССАТЛТТССОТТССТАСТСТТТТТТССТССААСССТТСАССССЛАААСАСССАТСССТСТТТТТССТТХЬа 1ЕВХ 17165СТССТТСТСТТСТЛТСААТТССАТТЛТЛАТЛТСТТСТТСТТЛСТССААТАТСАТАТЛСЛЛСТСАТССЛААТЛСЛТАТТЛЛСАЛЛЛЛСЛЛАСТСТЛСЛАТСАЛТСЛЛТСЛАТСАТСХЬо 1 Вав НХСАТСС ЕВ 1 1631 ЕВ 1 1696 ХЬа 1 ЕВХ 171 ЕВ 1 71 б ЕВ 1 1692 ЕБ 1 1704 СТАС ЕВХ 1710 ЕБХ 1717 ЛСТС50 3) лигирование олигонуклеотидовс олигонуклеотидами1 и 2, согласно примеру 11; ДНК"фрагмент элюируют из 21-ного агарозного геля и по б 5 сайтам Ващ НХ - ХЬа 1 Ввовят в РЕЯ 02.. осуществляют:1) синтез олигонуклеотидов ЕВХ 1692, ЕВ 1 1704, ЕВХ 1710, КВ 1 17162) реакции гибридизации олигонуклеотидов1 ЕВХ 1691/ЕВХ 1692й 2 КВ 1 1696/КВ 1 1704У 3 ЕВ 1 171/КВ 1 710Иф 4 ЕВ 1 1716/КВХ 1717 ЕВ 1 1717ТССЛСЛТСАТТСАТТСЛТТСЛТТСТАСЛСТТТСТТТТТСТТАЛТАТСТАТТТССАТСАСТТСТАТАТСАТАТТССАСТЛЛСЛЛСЛЛСАТАТТЛТЛАТСС4,0Дпя достижения желаемого сочета-олигонуклеотидами ЕВ 1 169/,1692/ния СОР-промотора с отдельными /1696/1704/П 1/1710/1716 по схеме:/ХЬа 1,Нход 111 САР сайт,АССТТАСААССААТСТСТТСАСААЛАССТАСССТССААССТТААСССАТААТСТТССТТАСАСААСТСТТТТССАТСССАССТТССААТТСССТАТлидер Я-ИФТСССАССТСАСТАААСССАССАССАТССТСАТТТСССААТСССССТССТСТТССАСССТССАСТСАТТТСССТССТССТАССАСТАААСССТТАСССССАССАСА 31 171161 по сайтам ХЬа 1 - .Хйо 1 в рЕ 046. По" лучают плазмиду рЕОч 7. Теперь весь СБР 1-промотор можно лигировать. в рКН 1 по сайтам Ваш Н 1 и ХЬо 1. Получаемую экспрессионную кассету называют рЕ 018,Ген ИпОедисмутазы выделяют изплазмиды рЕ 022-А (пример 12) с помощью рестрикции энзимами ХЬо 1 иЕсо Р 1 и лигируют в экспрессионную кассету рЕ 048. Снабженную геном МпО-дисмута". зы экспрессионную кассету гидролизуют . рестриктазой Ва 111 и аналогично примеру 8 по сайтам Ваа .Н 1 и Нпк 1 111 вводят в дрожжевые векторы р 1 ЭВ 207 и уяр 13.Дрожжевые экспрессионные плазмиды с СПР 1-промотором приведены втабл.1.Таблицааа а аа еае аа ЕВектор Лидер ПлазмидаеарХПВ 207 дрожжеваярЕО 50МпО -дисму 25тазаТо же РЕО 51 получают фрагмент ДНК длиной 192 п.о,с выступающими концами Нхпд 111/ Дрожжевой штамм ИЯЗОа трансформируют аналогично примеру 13 экспрессионными плазмидами, указанными в табл., и продукты трансформации исследуют на экспрессию.П р и м е р .22. Экспрессия ИаО- дисмутазы в эукариотических клетках животного происхождения.а). Конструкция экспрессионных плазмид,Ген ИпО- дисмутазы с помощью синтетических олигонуклеотидов снаб" жают на конце 5 соответствующими контрольными и лидернь 1 ми последовательностями, Необходимыми конт" рольными последовательностями являются сайт САР и стартовый сигнал АТС. Для секреции в среде используют ли" дернув последовательность омегаинтерферона (В-Иф). Для внутрикле". точной продукции используют человеческую митохондриальную лидерную последовательность ИпО-дисмутазы.Путем сочетания четырех синтетических олигонуклеотидов ОЬ 39 ОЬ 40 О 1,41, 01 42, получаемых согласно примеру 3 б или 11:1-ув-старт Мп 0-дисмутазыХЬа 1СААССАСАСССТСССССАССТССССТАССАСТАСССТССТСТТССТСТСССАСССССТССАССССАТССТСАТСССАССАСАТСЭтот фрагмент ДНК представляет . аминокислот МпО-дисмутазы (от лисобой 5 -нетранслируемый участок зина до аланина).9-ИФ с,сайтом САР, стартовым сигна- Путем сочетания синтетических лом АТС,Я -Иф-лидерной последова- олигонуклеотизов ОЬ 39, ОЬ 40 указантельностью (21 аминокислота) и ко- ;. ных формул и синтетических олигонукдирующий участок первых тринадцати леотидов ОЬ 43 и ОЬ 44лОЬ 43:ТТСАСССССССАСТСТСССССАССАССАСССАССТСССТССССТТТТССССТАТСТССССТССАСССАСААССАСАСССТСССССАССТССССТАССАСТАСССТССТОЬ 4 Ч:5 сСТАСАССАСССТАСТССТАССССАССТСССССАСССТСТССТТСТСССТССАССССАСАТАССССЛАААССССАСССАССТСССТССТССТСССССАСАСТСССССССТСААСАТТСССВполучают ДНК-фрагмент длиной 196 п.о, /ХЬа 1.с выступающими концами Нхпй 111/НЫй 111 САР сайт.дАССТТАСААССЛАТСТСТТСАСААААССТАСССТССААССТТААСССАТААТСТТССТТАСАСЬАСТСТТТТССАТСССАССТТССААТТСССТАТстарт лидера МпО-дисмутазыТСССАССТСАСТАААСССАССАССАТССТСАТТТСССААТСТТСАСССССССААСССТССАСТСАТТТСССТССТССТАССАСТАААСССТТАСААСТСССССССТСТСТСССССАССАССАСССАССТСССТССССТТТТССССТАТСТССССТССАССАСАСССССТССТССТТССТССАСССАССССАЛААССССАТАСАССССАССТС.Ьув-старт протеина МаО-дисмутазыХЬа 1ССАСААССАСАСССТСССССАССТССССТЛССАСТАСССТССТСССТСТТССТСТСССАСССССТССАССССАТССТСАТСССАССАСАТСЭтот ДНК-фрагмент представляет собой часть нетранслированного 5- участка Я-Иф с сайтом САР и старто-. вым сигналом АТС, а также с митохондриальной,лидерной последова" тельностью МпО-дисмутазы человека (24 аминокйслоты) для внутриклеточ-. у ной продукции МпО-дисмутазы и кодирующего участка первых тринадцати аминокислот МпО дисмутазы. Олигонуклеотиды ОЬ 39, ОЬ 42 и ОЬ 44 фосфорилируют на 5-конце при помощи Т 4-полинуклеотидной киназы с тем, чтобы обеспечитьосуществление последующей реакции лигирования.Реакционная смесь: 2 мкл олигонуклеотида (100 пмоль); 1 мкл 10 хбу- . фер линкерной киназы; 3 мкл 10 мй АТР; 1 мкл Т 4-полинуклеотидной киназь, 1 О ед/мкл.35 17410 фбуфера линкерной киназы содержит 07 М трис-НС 1, рН 7,6, 0,1 И, МдС 1, 0,05 И дитиотреитола.Реакцию ведут 30 мин при 37 С,энзим инактивируют путем нагреваниядо 100 С,Олигонуклеотиды 01.40, ОЬ 41 и 01,43,образующие 5-концы готовых ДНК"Фрагментов, не фосфорилируют во из"бежание образования мультимерныхДНК-вставок при последующей реакциилигирования.Гибридизацию комплементарных оли"гонуклеотидов друг с другом осуществляют следующим образом.Олигонуклеотиды А и Б представ"ляют собой комплементарные олиго"нуклеотиды.Реагенты:Ю 1 1: А = ОЬ 39 Б = 01 40Р 2; А = 01 41 . Б = 01 423 ; А = 0143 Б = 0144Реакционная смесь: 1 мкл олигонуклеотида А (100 пмоль).; 1 мкл олигонуклеотида Б (100 пмоль).;.8 мклводы.Реакционные смеси Р 1 - 3 нагрева"ат при 100 С в течение 2 мин и медленно охлаждают в водяной бане докомнатной температуры.Получаемые результаты реакций 13-короткие двунитевые фрагменты ДНКлигируют друг с другом следующимобразом:ПидерЯ-ИФ: 5 мкл реакционнойсмеси У 1; 5 мкл реакционной смесиНф 2: 1,5 мкл/мл 10 мИ АТР 0 5 мкл/.0,5 мкл ДНК-лигазы (7 ед.).Реакции протекают в течение 15 чкОпри температуре 4 СДНК разделяют по размерам на2 Ж"ном агарозном.геле и .желаемыеДНК-фрагменты, длмной 192 и 196 п,о.элюируют из геля.Готовый ДНК-Фрагмент длиной. 192п.о, с лидером Я-ИФ для, секрецииМп 0-дисмутаэы в среду, Лигируют вН 006 по сайтам Нхпд 111 и ХЬа 1.Получают плазмиду НБОП 11. Плазмидугидролизуют .по сайтам Есо К 1 и обрабатывают фрагментом Кленова с обра"зованием тупых концов. Затем пере"вариваат Нжд 111 и большой ДНК." 1610 36фрагмент длиной приблизительно 700 по. выделяют иэ 1,5-ного агарозногогеля. ДНК-фрагмент лигируют в эукариотический вектор рБЧ 2 ВргдЫг, который получают из рВК 322 дЫг разрезанием Еэр 1 и Нпд, 111, заполнением Фрагментом Кленова и лигировани"ем в вектор рБЧ 28 рг по сайтам Есо К 1 -Ваш Н 1, заполненным фрагментом Кле"нова и обработанным щелочной фасфата"зой,Лигирование выделившегося большо"го ДНК-фрагмента, имеющего приблизительно 700 п.о. в вектор рБЧ 2 врМЬЕгосуществляют после предварительногогидролиза вектора с помощью Ара 1,заполнения сайта рестрикции фрагмен"том Кленова и дополнительного гидро 2 О лиза с .помощью Нхпд 111 Таким образом, ген дрг заменяют в векторе наген МпО-дисмутаэы. Смесь лигированияиспользуют для трансформации Е.со 1Н 8101, После рестрикционного анализаплазмидной ДНК положительных клоновполучают экспрессионную плаэмиду,которую обозначают как рБЧ 2 дЫг 8001.Аналогично ЛНК-фрагмент с митохондриальным лидером МпО-дисмутаэыЗО длиной 196 п,о, по сайтам Ндп 4 П 1- ХЪа 1 лигируют в Н 8016, Получают плазмиду НБОЮ 2. Ген с регуляторнымипоследовательностями, клонируют вэукариотический вектор рБЧ 2 рМЫгпо сайтам рестрикции Нхпд 1 И - Есо К 1после предварительного заполнения выс"тупающих концов Есо К 1 энзимом Кленова, Получаемуюэкспрессионную плаэми-.ду обозначают как рБЧ 2 дЫгБОЭ 2,Экспрессию рБЧ 2 дЫгБОШ ирБЧ 2 дЫг 8002 осуществляют в клеткахСНО с дефицитом дегидрофолатредуктазы,которые культивируют в 0-ИЕИ"среде(10 эмбриональной телячьей сыворот-.ки, гипоксантин, тимидин), Трансфф Фекцию клеток СНО экспрессионнымиплазмидами рБЧ 2 дЫгБОР 1/Р 2 осуществляют известным образом. За день дотрансфекции 710 клеток подают напитательные пластинки.Клетки обрабатывают продуктомосаждения фосфатом кальция, содержащим до 10 мкг плазмидной ДНК, при37 С в течение 4 ч. Затем среду отосасывают и заменяют селекционнойсредой Ю-ИЕИ, содержащей 10 эмбриональной телячей сыворотки, которуюкаждые два дня заменяют. Колониитрансформированных клеток появляютсяС С С 20 5 ТС 1 ТА ТТ ТС ТС 1 СТТАСТТТ, 3 Т,Т Т А .С А 5 ТС 1 СТ 1 АС ТТ ТСССА ТТТАТ 3 С Т С37 1416по истечении 12 - 16 дней. Надосадочную жидкость (среду) исследуютна наличие активности МпО-дисмутазыП р и м е р 23. Очистка МпО-дисмутазы.а) Разрушение клеток.Аналогично примеру 15 клеточнуюмассу промывают дистиллированнойводой и в концентрации 304 суспенди Оруют в 50 мИ трис"уксусной кислоты,рН 8,5. Клетки разрушают в мельни"це, содержащей стеклянные шарикидиаметром О,5 " 0,5 мм. Экстрактклеток центрифугируют (16000 об/мин,15 мин, С и осадок удаляют).б) Осаждение нагреванием и кислотой.Надосадочную жидкость со стадии"а" нагревают до 60 С, в ледянойбане охлаждают до 20 фС, добавлением1 И уксусной кислоты рН среды устанавливают до 5,5, центрифугируют при16000 об/мин и подвергают диализус помощью трис-уксусной кислоты 2(60 мИ, рН 5,5) .в) Катионообменная хроматография.Содержащий МпО-дисмутазу диали"зат со стадии "б" подают на колонкус СИ"сефарозой; уравновешенную 60 мИтрис-уксусной кислотой, рН 5,5,злюируют линейным градиентом (15объемов колонки) от 60 мИ трис-уксус,.ной кислоты до 0,12 И ацетата натрия,г) Гельпроникающая хроматография,фракции с активностью МпО-дисму 35тазы со.стадии "в" собирают и подаютна колонку, содержащуюсефакрил Б300 НК или суперозу 12, уравновешенную 0,1 И фосфатным буфером, рН=7,8. 10 . 38Элюцию проводят тем же буфером.Получают 20 мг (1,1 мг/г клетки) чИпО-дисмутазы. формула иэобретения Способ получения человеческой МпО"дисмутазы, заключающийся в том, что из плацентарной или печеночной ткани человека выделяют мРНК, получают поли(А)+РНК, синтезируют двуни" тевую кДНК, конструируют генЬанк кДНК, далее выделяют последователь" ность ДНК, кодирующую Мп О"дисмутазу, при помощи зондов. или последовательности кДНК гена МпОдисмутазы человека, последовательность ДНК достраивает до стартовогокодона или. стоп-кодона, непосредст;венно за стартовым кодоном генаразмещают митохондриальную лидерную гили сигнальную последовательностьДНК МпО-дисмутазы З,сетечвае иличеловека, затеи последовательность фДНК, кодирующуя.ИпО-дисмутазу, используют для конструирования вектораэкспрессии, состоящего из промоторов АЭН 1 или АВН 11,. пар олигонуклеотидов ЕВ 1 1161/ЕВ 1 1164 + ЕВ 1 1167/сии, состоящего из промоторов АОНХ.или СУР 1, сигнала инициирования, "стоп-кодона и терминатора АЭНХХ, помитохондриальной лидерной или . лученными векторами экспресии рЫ 8550 А, сигнальной последовательности. 8 яссЬа-или рЧ 8490 А, или рИ 8491 А, или ощусев сегечхвае или человека,рИ 8371 А, или рУ 8372 А или рУ 8333 А,40 1741610 ХЪо 1ЕВ 1 1161/ЕВ 1 1164 + ЕВ 1 1159/ЕВ 1 1168 формулыЕВ 1 1161ССТАТСАСАТЛТАААТАСАСТСССАСТАСССЛСТТТТТТСАСАСТСССТАСССАТАСТСТАТАТТТАТСТСАСССТСАТСССТСААААААСТСТСАССАЛАТАСТСТТАСТАСТССТСТСТТСТТСТТТТТАТСАСТТСТТСТТТСТТСТТТТАТСАСАЛТСЛТСЛССАСАСААСААСАААААТАСТСААСАЛСАААЕВ 1 1164 5 ТСЕВ 1 1159 5 СТАААТАСААТАТСААССТАСААЛААССАТАСААТСААСТАСААСААССАТТТТАТСТТАТЛСТТССАТСТТТТТССТАТСТТАСТТСАТТСЛАСТЛТААСТАТАТСАСТТСАТААТТСАТАТАСАССТ 5 ЕВ 1 1168ХЬо 1ЕВ 1 1161/ЕВ 1 1164 + ЕВ 1 1165/ЕВ 1 11 бб формулыЕВ 1 1161ССТАТСЛСАТАТЛААТАСАСТСССАСТАСССАСТТТТТТСАСАСТСССТАСССЛТЛСТСТАТАТТТАТСТСАСС:ТСЛТСССТСААЛЛАЛСТСТСАССААЛТАСТСТТАСТЛСТССТСТСТТСТТСТТТТТАТСАСТТСТТСТТТСТТСТТТТАТСЛСААТСАТСАССАСАСААСЛАСАААААТАСТСААСААСАААЕВ 1 1164 5 ТСЕВ 1 1165 СТЛААТАСАЛТАТСЛАССТАСААЛААССАТАСААТСААСТАСААСЛАССАТТАТСТТАТАСТТССАТСТТТТТССТАТСТТАСТТСАТТСЛАСТАТТАЛСТАТАТССТААТАСАСТТСАТАЛТТСАТАТАССАТТАТСАССТ 5 ЕВ 1. 1166ХЬо 11или рЕ 042, или рЕ 043, или рЕО 44, илирЕОЙ 5, или рЕО 50, или рЕО 51, которойтрансформируют втаммы БассЬагошусевсегечыхае, или плазмиду рБЧ 2 ЙЫгБОШили рБЧ 20 ЫгБОЭ 2, которой трансформируют штаммы культивируемых клеток,культивируют трансформированные клетки, выделяют и очищают целевой про,дукт путем,экстракции, осаждения ихроматографии. или СЧР 1, сигналаинициирования, митохондриальной лидерной или сигнальной последователь ф ности БассЬагоаусез сегечхвхае или человека, стоп"кодона и терминатора ЛВН 11, далее конструируют плазмиду .рУБ 550 Л, или рИБ 490 А, или рМБ 491 А, или рИБ 371 А, или рЧБ 372 Л, или рЯБ 373 Л, 4 или рЕ 021 - АВ,. или рЕ 025 - АС, или Е 026 - АЭ, или рЕ 040; или рЕОЬ 1,Составитель Т.Забойкина,Техред И.Моргентал Корректор Э.Лончакова Редактор Л.Пчолинская Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная, 4 Заказ 2094 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Рауаская иаб., д. 4/55 17416106или рЕ 024 - АЭ, или рЕ 025 - АС, или 9-буфер: 100 мИ трис, рН 75, 10 мИрЕОЙ " АР, или рЕ 040, или рЕО 41, МИС 1, 1 мМ этилендинитрилотетраукили рЕ 042, или рЕО 43, или рЕ 044, или сусной кислоты ЭДТУК);рЕ 045, или рЕ 050, или рЕ 051 трансфор" Б агар ЛБ: жидкая среда ЛБ, 15 г/л бак.мируат штаммы БассЬагошусез сегеч 1- тоагара;вае или плазмиду рБЧ 2 ЙЬгг 8091 или жидкая среда ЛБ: 10 г/л бактотриптор 872 йЫг, которой трансформируют на, 5 г/л дрожжевого экстракта,.штаммы культивируемых клеток, культи г/л ИаС 1, 10 М ХаОН до рН 7141вируют трансформированные клетки, 10 раствор лигирования: 66 мИ трис-НС 1,выделяют и очищают целевой продукт рН 7,6, 1 О мИ МЕС 1, 5 мИ ДТТ, 1 мМпутем экстракции, осаждения и хро" АТР, 1 ед. Т 4-ДНК-лигазы;матографии, раствор нейтрализации; 0,5 И трисПри осуществлении предлагаемого НС 1, РН 7,50 1,5 И МаС 1способа используют промотор АРНТ 1 я Ьуфер Ез 50 мМ КС 1, 50 мМ ИаС 1 50 мМ(рЕ 8103), регистрационный номер РБИ трис-НС 1, рН 8,0, 10 мИ МЕС 114013 (Фрагмент Ваш Н 1/ХЬо 1 с длиной раствор предварительной гиЬридизации:1500 п.о, (пар оснований) 1 5 к буфер ББС, 5 к раствор Денхардускоренный промотор АРН 1, регистра" та, 50 мМ натрий".Фосфатного буфера,ционный номер РБМ 4016 (рИБ 323 Е) 20 рН 6,8, 1 мМ ЯаРО, 100 мкИ АТР,(фрагмент Ваш Н 1 ХЬо 1 с длиной . О, 14 додецилсульфата натрияЕДСМ,ЗО 400 п,о.); 100 (50) мкг/мл денатурированной обтерминатор А 1 Н 11 (рСР 2), регистра-. работанной ультразвуком ДНК из спер.ционный номер НБМ 4014, (фрагмент мы лосося;; ХЬа. 1/НхшЕ 111 с длиной 336 п,о.); 25 АБАЗ регистрационный номер ЕБМ 4015;буФер Ваш Н 1: 150 мй КаС 1, б мМ Б.сегеч 1 зхае РВк 47:а,1 ец 2, Ьхз 3,трис-НС 1, рН 7,9, 6 мМ МвС 1, ггр 1 Юга 3;100 мкл/мл альбумина сыворотки круп" среда СЦ-УРА: 0,67 ь ВАЯВ(РхЕсо),ного рогатого скота (АСКРС); . 2 глюкозы, 2 Ф 50 к смеси аминокисбуФер Коре; 50 мМ трис-НС 1, рН 8,О, ЗОлот (г/л): гистидин 1; лейцин 6;10 мМ ИЗС 1, 50 мМ БаС 11 . . триптойан 2,5," лизин 4; аденин 1,2;раствор денатурации: 0,5 И ВаОН, . аргинин 2;.метионин 1, Фенилаланин1,5 М ЯаС 1; б; треонин 5 изояейцин 6;раствор Денхардта (50 х). 1 г.:поливи- буфер Бпи 1: 10 мИ трис-НС 1, рН 8,0,нилпирролидона с мол,массой 360000, 20 мМ КС 1, 10 мМ МЕС 1, 10 мИ .2-мер"1 г. Фиколла, 1 г АСКРС, Н О до каптоэтанола, 100 мкг/мл АСКРС;100 мл; буфер БрЬ 1: 10 мИ трис-НС 1, рН 7;5,,Е.сИ С 600: Р, вцР Е 44, ГЬ 11, 100 мМ ИаС 110 мИ МЕС 1, 10 мИ 2"гЬг 1, 1 ецВб. 1 ас 71, гоп А 2 ИАТСС меркаптоэтанола, 100 мкг/мл АСКРС;33724) 1 о ББС (20 к): 3,0 М ЯаС 1, 0,3 М .НазЕ.со 1 й. ХМ 101:зир Е, гЬда,(1 ас-.рго цитрата, рН 7,0;АВ), Р, гга Э 36, рго АВ, 1 ас 1 2, ББРЕ (20 к): З,б И МаС 1, 0,2 М ЯаНРО+ф 5, 20 мИ ЭДТУК, КаОН (10 н.) до рй 7,4;буфер Х: 100 мИ МаС 1; 50 мИ трис"НС 1, . буФер ТЕ: 10. мИ трис"ЙС 1, рй 8,0;.рН 7,5, 10 мИ ЙЕС 1, 1 мИ дитиотрие мМ ЭДТУК;тола (ДТТ); ..: " буфер ТЬа 1: 50 мМ трис-НС 1, рН 8,0,буфер г 10.мМ трис-.НС 1, .рй;7,5, ,: .10 мМ ИЕС 1,60 мИ ЕЕаС 1, 10 мИ МЕС 1,.1 мИ;:"ЗффР-:;: топ-агароза; жидкая среда ЛБ, О,Дкаптоэтанола, 100 .мкг/мл АСКО,.-;".:.-,.:, агарозы;раствор. гибридизации соотеетсТфЖ-БЕ раствор предварительной промывки:раствору предварительной гиЬйидййа-;.; 1 И ВаС,50 мМ трис-НС 1, рй 8,0,ции, но без ДНК из. спермы лосося,.,::,. 1 мМ ЗДТУК, О., 1 Ж ДСН.содержащий Фрагмент Кленова:реакцйрйв;:.:.: :П р и м е р 1,ный раствор 22 мкл ДНК/НО, 2, икл.,.",",. " Конструирование генобанка кДНК,10 буфера ЙТР.(0,5 И трис-НС 1 РИ; .-"8,";: Свежую человеческую плаценту под 7,2, 0,1 И МАМБО, 1 мМ ДТТ, 500 йкд/ввергают быстрому замораживанию в жид/мл АСКРС 1 по 1 мкл 2 мМ ИМАТР, сЫЙР, :ком азоте, растирают в порошок приаТТр, 2,5 ед, фрагмента Кленова . температуре ниже -80 С, экстрагируют. (0,5 мкл); . РНК из которой получают поли(А)+РНК,174161 Синтезируют ДНК, клонируют ее вЕсоКТ 10, используя Е,со 11 СЬОО.Титр кДНК фаговф ре 10 составляет1,2 к 10 о. бляшкообраэующих ед, мл, ачисло независимых клонов 110.П р и м е р 2. Амплификация генобанка Я 10.Штамм-реципиент Е.со 11 (например,С 600, Генотип Г , Е 44, вцр Е 44,Йп 111, йЬг 11 еи Вб, 1 ас 71акоп А 21 Лвы"ращивают.при 37"С в течение ночи всреде ЛБ, содержащей 0,2 мальтозй.Культуру центрифугируют и суспендируют в 10 мМ раствора сульфата маг" 15ния до.оптической .плотности 4,0 приЬ 00 нм. Полученные И ;клетки хранятпри 4 С, Клетки смешивают с суспенэией фагов (по 50000 бляшкообра"эующих единиц генобанка ДНК на пластину) и инкубируют в течение 20 минпри 37 ОС. Затем добавляют расплавленную и доведенную до 42 С топ"агарозу(содержащую 10 мМ сульфата магния),смешивают., выливают на предварительно 25нагретые ЛБ-агаровые пластинки (диа метром 13,5 см), содержащие 10 мМсульфата магния, и инкубируют в те"чение 6 - 12 ч при 37 С.П р и м е р 3. Первичный скрининг 30для идентификации рекомбинантныхФ-фагов,а). Обработка нитроцеллюлозныхФильтров.Пластинки по окончании .инкубацииохлаждают до 4 С. Нитроцеллюлозныефильтры кладут на поверхность пластинок. Через 1 мин после пропиткифильтры осторожно удаляют, кладутв раствор денатуратора и инкубируют 40в течение одной минуты при комнатнойтемпературе. Нейтрализацию осуществ",.ляют в растворе нейтрализатора в течение 5 мин при комнатной темпера"туре, затем инкубируют в течение 45)О с в буфере 288 РЕ при той жетемпературе. С пластины изготовляюткопии, Фильтры высушивают, ДНК фиксируют при 80 С,б). Получение ЭР-маркированныхзондов ДНК,50Синтез олигонуклеотидов проводятна синтезаторе 381 А. Олигонуклеотиды очищают электрофорезом в полиакриламидном геле (20 в 8 М мочеви"не) с последующим обессоливанием наСефадексе С. Синтезированные таким образом ДНК-зонды комплементарныпоследовательностям оснований РНК,0 8кодирующим аминокислоты 39 - 4 Ь(а) и 200 - 207(б): Они имеют следующие последовательности оснований: С С Са) 5 ТС 1 ТА ТТ ТС ТС 1 СТ ХАС 1 ТТ 3 Т Т ТА С Аб) 5 ТС 1 СТ ТАС ТТ ТС ССА ТТ 1 АТ С Т Св). Гибридизация ап вЫц.С целью удаления с нитроцеллюлоэы остатков агароэы и бактерий Фильтры инкубируют в растворе предварительной промывки при 65 С в течениеонескольких часов при перемешивании.Фильтры инкубируют в течение 1о,12 ч при температуре 37 С в раство"ре предварительной гибридизации,который подвергают предварительнойвакуумной дегазации.Используемые для гибридизации ра"диоактивно меченные ДНК-зонды (около1107 срм/мкг) добавляют к нагретомудо 37 С и дегаэированному растворугибридизации. Для поддержания на вы"соком уровне концентрации ДНК в раст"воре гибридизации используют мини"мальное количество жидкости. Гибридизацию осуществляют в течение 1218 ч при 37 С.Нитроцеллюлозные Фильтры трираза промывают в Ьуфере 6 БЯС и0,05 Ж ДСН (4 С), два раза в течение30 мин при 4 С, а также в свежеприготовленном растворе, содержащем 3 Ихлорида тетраметиламмония, 50 мМтрис-НС 1, рН 8,22 мМ ЭДТУК и 0,051ДСН следующим образом: три раза прикомнатной температуре, два раза втечение 30 мин при комнатной температуре и три раза в течение 30 минпри 49 чС, после чего сушат на возду"хе. Рентгеновскую пленку, экспонируютов течение 2 - 8 дней при - 70 С.П.р и м е р 4. Очистка бляшек.После проявления авторадиограммиз агаровой пластинки выделяют теучастки, которые дают положительныйсигнал гибридизации на обоих нитро"целлюлозных Фильтрах. Для этого желаемое местоудаляют из агара и пе"реводят в 0,3 " 0,6 мл Я "буфера. Добавляют по одной капле хлороформа,фагам дают диффундировать из агара втечение ночи при 4 С и каждую отдель-,.оную Фаговую суспензию в виде несколь",ких раэбавлений наносят на пластинки.917416Пластинки, имеющие 300 - 1000 бляшек,снова используют для изготовления ко"пии нитроцеллюлозного фильтра, который подвергают гибридизации с использованием обоих ДНК-зондов. Этот процесс повторяют до тех пор, пока всебляшки одной пластинки не дадут положительный сигнал гибридизации.П р, и м е р 5, Анализ полученныхфаговых клонов.а). Титрование 9 -Фагов,Суспензии фагов разбавляют % -буфером в соотношении 1;10, смешиваюти наносят на пластинки. После инкуобации при 37 С определяют титр вбляшкообразующих единицах. Для очи-"щенных Фаговых суспензий титр сос"тавляют 2,2 - 8,6 ЧОф ед. мл,б), Получение Ф -Фаговой ДНК..После выделения и титрования гомогенных фаговых клонов их наносятплотностью 2 х 10 единиц (13,5 смчашки Петри с культуральной средойследующего состава: 1,5 Ф агарозы, 2510 г/л триптофана, 5 г/л дрожжевогоэкстракта, 5 г/л ИаС 1, 10 мИ И 804, и0,21 глюкозы) вместе с 200 мкл ИВ-.клеток Е.со 1 х С 600 (оптическая плот"ность 4 при 600 ни), инкубируют в ЗОтечение 5 ч при 37 С и затем охлаж"дают до 4 С, Злюцию Фагов осуществляют переслаиванием пластинок 8 мл-буфера и несколькими каплями хлороформа при слабом качании при 4 С в 1010 полнения гена конструируют и синтезируют с учетом выбора дрожжевого ко-.дона 2 пары олигонуклеотидов (Фрагмент ХЬо 1/ХЬа 1) согласно формуле(ОР 1): 35. течение ночи, Очищенную центрифугированиеи надосадочную жидкость удаляют и фаги .центрифугируют при 5000об/мин, в течение 30 мин при комнатной температуре. После добавления 4 О500 мкл Я-буфера и инкубации с рибо"нуклеазой А. (10 мкг/мл) и дезоксирибойуклеазой (1 мкг/мл) в течение 30 минпри 37 С и концентрацию соли повь-,юшают добавлением 25 мкл 0,5 И ЭДТУК, 4512 мкл 1 И трис-НС 1, рН 8;0 и 6,5 мкл201 ДСН и инкубируют при 70 С в течение 15 мин. После экстракции Фенолом и двукратной экстракции смесьюхлороформа и изоамилового спирта(24:1) ДНК осаждают добавлением 0,1объема 3 И ацетата натрия с рН 5,2.и2 объемов спирта, центрифугируют,промывают 701-ным спиртом, сушатрастворяют в 50 мкг буфере ТЕ.в), Рестрикционный анализ,По 2 мкл раствора ДНК инкубируютс 5 ед, ЕсоК 1 в буфере Х в течение2 ч при 37 С, полученные Фрагментыо разделяют в 1 Ф-нои агарозном геле.фрагменты длиной 500 - 1000 п.о. элюируют из геля и подвергают анализу.г). Анализ последовательностей.100 нг Фрагментов встраивают всоответственно приготовленную ФормудзДНК (репликативная фориа, 50 нг)вектора путем инкубации в течение2 - 12 ч при ВС в Я мкл растворалигирования. Рекоибинантной конструкцией с обозначениями В 83, В 85,В 88, В 89, В 812, В 813ВЗХ 111 транс"формируют компетентные клетки Е.со 1(штамм 1 И 101).Выделяют однонитевую ДНК рекомбинантных Фагов и проводят анализпоследовательностей по Сангеру прииспользовании вычислительных прог"рами о 1Выделейный клон о (В 88) содержиткодирующую последовательностьаминокислоты 22 зрелого энзима,П р и м е р 6. Конструкция экспрессионной кассеты.Для экспрессии человеческой ИпОвдисмутазы (чИп-Д) в дрожжах используют промотор АЙН 1 первоначальнойдлиной около 1500 п,о., укороченныйпромотор АЭНТ длиной около 400 п.о,и АВН 11 терминатор,а). Пополнение, гена.Так как у выделенного клона 8 кДНКна И-конце отсутствует участок, соответствующий 21 аминокислота, .для по" 5 ТССАСТЛТАСААТСАЛССАСТСТТТСССАСАСТТС Э СЛТЛТСТТЛСТТССТСАСАЛЛСССТСТСААС ХЬо Т ССЛТЛССАСТАСССТССТССТАТССТСАТСССАССАСАТСХЬа 1и (Фрагмент ХЬа 1/Ясо 1 согласноФормуле (ОП 2);5 СТЛСЛЛССАСАСАТСААТССТСАЛАТСАТССАА3 ТТССТСТСТЛСТТСССАСТТТАСТАССТТХЬа 1ТТССЛССЛСТСТААССАСААССТССТСЛСАТТССТССТАСВсо 1 ОП 1 вставляют через ХЬо 1/ХЬа 1в плазииду 717 (полученную из рОС 18после рестрикции Нкпс П и введения1012плазмиду РКН 1,.соответственно РКН 2через ХЬо 1/Есо КЕ.В плазмиду РЕЗ 103, содержащуюпромотор АОНТ в качестве ФрагментаВаш 1/ ХЬо 1 длиной 1500 п.о. вРЕЗ 102 (РЕЗ 102 представляет собойпроизводное рМ 18, которое в местеразреза НЫс 11 содержит линкерХЬо 1, вводят линкер ВЕ 1 П послерестрикции Яша Е (1 мкг плазмидыподвергают перевариванию 5 ед.Яша 1 в буфере Бша 1 в течение 2 чпри 37 С), очистки и выделения. Полученную таким оЬразом плазмидупревращают в плазмиду Р 15 Юрестрикцией инкубацией с фрагментом Кленова и повторным лигированием,После переваривания ХЬо 1 и Нхпй111 в буфере. Коре в плазмиду рЕЗ 103вставляют синтезированный линкерХЬо 1, Есо К 1, ХЬа Е, НЫЙ 111, Этотлинкер имеет следующую последова"тельность;ТССАССААТТСТСТАСААССТТААСАСАТСТТТССА.В плаэмиду р 150/1 (после переваривания ХЬа 1/Ндпд ЕТ 1 в буфере Коре)вставляют терминатор АЭН 11, получаяплазмиду 150/2. Терминатор А 0 Н 11 получают следующим образом. ИлазмидурИИ 5 АОНП переваривают снацалаНдпд П 1, затем Брп 1 и фрагментдлиной 605 п,о. клонируют в векторУ 18 и в место разреза Н 1 пс 11 вставляют линкер ХЬа 1 (СТСТАСАС). Фрагмент ХЬа 1/ЯрЬ Е длиной 335 п.о.вводят в рОС 18 (рС 02).Вектор У 18 получают за счет того,что в р 0 С 18 вводят линкер Н 1 пй 1 Ппо сайту Ява 1, Место мультиклониро"вания в У 18 содержит Есо К 1, БэС 1,Крп 1. Н 1 пй 111, Вав НТ, ХЬа 1, За 11 Т,РэС, ЯрЬТ, После переваривания ХЬа 1и Нхпо 111 терминатор АРНЕЕ выде.ляют. Таким образом, эа исключениемвводимого через ХЬо 1 Есо К 1 генаплаэмида р 150/2 содержит необходимыедля экспрессии гена промотор длинойоколо 1500 п.о., линкер ХЬо 1 длиной7 п.о. линкер Есо КТ длиной. 6 п.о.,линкер ХЬа 1 длиной 7 п.о., терминатор длиной 329 п.о. Эти единицы вставляют через Ваш НТ/ЯЫЙ ТП в векторр 15 М 2. В получаемой плаэмиде рКН 1заменяют промотор АОНТ на укороченныйпромотор АРНЕСС иэ фрагмента Ваш Н 1//ХЬо 1 (длиной 112 п.о.) плазмидырКН 2. 17116линкеров ХЬо Е ИССТССАСС) и рестрикции Ява 1 полученной плаэмидырЕ 8102 с последующим выделением линкеров Юсо 1 ИСССАТССС), а ОП 2 черезХЬа 1/Нсо 1 следующим образом,По 4 мкг ДНК У 17 переваривают10 ед. ХЬа 1 и Ясо,1 или ХЬо 1 иХЬа 1 в течение 2 ч при 37 С и очи"щают путем гельэлектрофореза (О 7 10агарозы). По 5 мкл синтезированныхнитей ОП 1 и ОП 2 (каждый раз 10 рМ//мкл) перемешивают, инкуЬируют втечение 10 мин при температуре 65 Си медленно охлаждают до комнатной 15температуры, По 1/10 полученногообъема подвергают лигированию с 50 нгразрезанного ХНо 1 и ХЬа 1 вектора(в случае ОП 1) или разрезанногоХЬа Е и Исо 1 вектора (в случае ОП 2). 20После двойного перевариванияБса 1 и ХЬа 1 в буфере Коре в течение2 ч при 37 С, очистки и выделенияоразрезанных векторов путем гельэлект"рофореэа НБОВ 2 и НБОВЗ подвергают 25лигированию (клонирование олигонук"леотидных пар ОП 1 и ОП 2) с получением. плазмиды НБОВУ, которую гидролиэуютрестриктаэой Нсо 1, инкубируют сфраГментом Кленова и гидролиэуют ЗОрестриктазой Есо К 1, При этом 5 мкгДНК инкубируют с 18 ед. Мсо 1 в те"чение нескольких часов в 50 мкл бу"фера Х при 37 С, разрезанную ДНК очи"шают гельэлектрофореэом и половинуинкубируют с фрагментом Кленова.ДНК очищают гельэлектрофореэом,выделяют и гидролизуют 7,5 ед. Есо КЕв 20.мкл буфера Х, еще раэ очищаюти выделяют. Плаэмидой В 88, содержа,щей выделенный клон 8 кДНК, трансфор"мируют компетентные клетки Е,со 1.(штам 18101) и получают плаэмиду.1 О мкг плаэмиды переваривают с25 единицами ТЬа 1 в 10 мкл буфера 4 БТЬа 1 в течение 8 ч при 60 С, фраг"мент длиной 759 п.о, гидролизуют спомощью Есо К 1 с последующей очисткойгельэлектрофорезом, Фрагмент ТЬа 1//Есо К 1 оЬъединяют с плаэмидойНБ 004, получая НБОР 6 ПлазмидаНБО 06 содержит полную кДНК для чМп Д,включая Ией, При этом сохраняетсярамка считывания.б) . Конструкция экспрессионнойкассеты.Плаэмиду Н 8006" переваривают сХЬо 1 и Есо К 1 в буфере Коре, выдебеет фрагмент ХЬо 1 и вводят в14 5 10 1 15 20 35 4045509 ТаблицаВектор В,обе плаэмиды вставляют по сайтам ХЬо 1/Есо КХ полный ген кДНК,вырезанный иэ НБО 06. Получаемые плазмиды НБ 007/1 и НБОР 7/2 отличаютсядруг от друга только различными промоторами АРНХ и АОНХК. После двойного переваривания В 8111/Нпд 111и выделения экспрессионных фрагментов изготовленные экспрессионныекассеты вставляют в соответственноподготовленные дрожжевые трансфор"мационные векторы УЕр 13 (АТСС 37 115)рХРВ 207 (РБМ 3181) рЕАБ 102 У 1 р 5(АТСС 370 Ь 2) через места разреза.Вав НХ иН 1 пд 111,П р и м е р 7, Получение пригод".ного для экспрессии дрожжевого мутанта Ип=Д,Ген дрожжевого мутанта Ип=,1 содержится в качестве Фрагмента Ваш Н 1 ввекторе Р 1,41. После рестрикцииВав Н 1 фрагмент длиной 2045 п.о. очищают гельэлектрофорезом выделяюти субклонируют по сайту Вав Н 1 в вектор ЧО,Вектор ЧО получают за счет того,что 1 мкг рЧС 18 гидролизуют рестрик.-.таэой Нпд 1 Х 1, фрагмент выделяютиз геля, выступающие концы пополняют,.полимеразой Кленова и лигируют Т 4"ДНКлигазой,Полученную плаэмиду БОРУ превращают в БОРОЗ путем гидролиза рестриктазой Укч и встраиванием линкераНжд 111 (СААССТТС) . В место разрезавставляют ген ОКЛ 3, полученный изрОКАЗ. БОГАЗ переваривают с Н 1 пд 111идефосфорилируют в следующих условиях. К 40 мкл реакционной смеси до"бавляют 40 мкл Н 1 О, 10 мкл 1 мИ ЭДТУК5 мкл трис-НС 1, рН 9,5, 1 мкл 100 мИспермидина и 1 мкл (1 мг/мл НО) щелочной Фосфатаэы кишечника теленка(ФТК) и инкубируют при 36 С, По ис"течении 15 мин еще раэ добавляютмкл ФТК и инкубируют в течение15 мин. Дефосфорилированный векторочищают электрофореэом в агаровомгеле. 2 мкг плаэмиды рВАЗ режутНдпд 111 и фрагмент длиной 1,2 т.пао.содержащий дрожжевой ген ЛАЗ, выделяют и вставляют в подготовленныйвектор.Получаемые таким образом ппазмидыБОЖ 7 и БОЙЦЫ содержат ген ОКАЗ вдрожжевом гене Ип-Д,и различаютсяориентацией гена 1 КА относительно,гайа Ма-Л Ориентацию гена ИАЗ относительно гена Ип-Д можно уста на вливат ь, так как ген 1 ЕАЗ содержит асимметричное место Рзс 1.Плазмидой БОРТ 7 и БОРУ 8 трансформируют штамм РВУ 747 (генотип а, 1 еи 2, Ьы 3, сгр 1, цгаЗ) следующим образом, 2 мкг БОРУ 7 и БОРУ 8 режут 50 ед, Вав НХ в 200 мкл буфера Вав НХ (150 мМ ЯаС 1, 6 мМ трис-НС 1, рй 7,9, 6 мИ МцС 1,. 1 мМ ДТТ) и всю смесь (без отделенйя части р 1 С) экстрагируют фенолом и осаждают этанолом, ДНК растворяют в воде и используют для трансформации дрожжей.Трансформанты выращивают в средео БС-ЮВА в течение ночи при 28 С. Клетки отделяют центрифугированием, разрушают и исследует на содержание в. них Ип-Д: При этом для определения Ип-Д, с одной стороны, и Си/Еп=Д, с другой стороны, работают по известным методикам с использованием гельэлектрофореза путем разделения протеинов с, последующим окрашиваниемнитросиним тетразолием. Повыситьчувствительность можно путем окрашивания. дианизидином. Для обеспечеЗО ния дальнейшего анализа применяют спектрометрический .метод с использо"ванием щелочного диметилсульфоксидав качестве выделяющей кислород сис" темы и цитохрома С в качестве восстановителя. Мп -Д и Си/Еп-Д можноразличать путем добавления КЮ Штаммы БОРУ/72, БОРУ 7/6, БОРХ 7/8 и.Иэ плаэмид НБО 07/1 и НБО 07/2 вырезают фрагменты Вв 111, Ньпд 111.Плазмиды УЕр 13, р 10 В и рЕАБ 102 также гидролиэуют Нпд 111 и Вав Н 1.По 50 мкг векторной ДНК и 200 мкгвставки лигируют и трансформируют вштамм Е. со 1 НВ 101.,В табл.1 приведено обозначениесоответствующих плазмид. Вставка НБО 07/ 1 1 НБО 07/2 ар 3 раБ 550 А рЧЧ 371 А рХРВ 207 р 1 Б 490 А рУБ 372 А рЕАБ 102 рЧЧ 491 А рНБ 37 ЗА1П р и м е р И . Синтез линкера.Изготавливают шесть различныхолигонуклеотидов ЕВ 1656, ЕВ 1636, 28 ЕВ 1643, ЕВ 1643, ЕВ 1646, ЕВ 1660 иЕВ 1638 со следующей последовательностью и длиной ЕВт, 656 ф,5 Ф 3ТССАСТАТАСААТСТТССССААААСАССТССАССТААТТТА, 5 ЗфААГЖАСТСТТТСССАГАСТТСССАТАССАСТАСССТССТЕВ 1 638,: 39 п.о.Ф3СТАСАССАСССТАСТССТАТСССААСТСТСССАААС 36 п.о. 15 17416П р и м а р 9 Получение пригодного для трансформации дрожжевого штамма (Ю 830"58)Получают дрожжевой штамм, который, кроме. описанных для штамма 8067/2 генетических маркеров, дополнительно содержит мутацию в одной из лизосомальных основных протеаз и, таким образом, при разрушении дрожжевых клеток выделяет меньше протеза.Для этого дефицитный .Мп-Д штамм 8 ОПУ 7/2 скрещивают с дефицитным по протеазам штаммом 77820 25 (а, 1 ец 2, ЫзЗ, ср 1, таЗ, рер 4), Штамм 15 77830-58 можно трансформировать, он отвечает соответствующим требованиям.Такие скрещивания можно с успехом осуществлять с другими известными дрожжевыми штаммами, например, с 20 20 В.П р и м е р 1 О. Трансформация дрожжей и экспрессияв дрожжах.Штамм БОИ/2 трансформируют плазмидами рИ 8371 А, рЯ 8372 Аи рЮ 8373 А. Трансформанты исследуют на экспрес" ию. Трансформанты выращивают в жид 101 Ькой среде 8 Сец при встряхивании.100 мкл культуры инокулируют в 4 млУР 5 ХЭ (1 дрожжевого экстракта,2 Ф пептона, 5 Ф глюкозы) и выращиваютв течение ночи, клетки отделяют ирасщепляют согласпо примеру 7. Наактивирующий гель наносят такое ко"личество сырой жидкости клеток, которое соответствует 1 мл культуры.Опыт по определению активности проводят по примеру 7.Дрожжевой штамм 77830-58 (1 еи 2,МвЗ, Стр 1, рер 4. зод 1) также транс- .формируют плазмидами рМ 8550 А, рИ 8490 А.р 77491 А,Измеренное в дрожжах в этих ус"ловиях количество Ип-Д соответствуетпримерно 0,5 мг/л культуры, Олигонуклеотиды ЕВ 1636, ЕВ 1643,ЕВ 1646 щ ЕВ 1660 фосфорилируют с5 -концов в следующих условиях.Исходная реакционная смесь Н 1содержит 2 мкл ЕВ 1 636 (100 пмоль),1 амкл 10 хлинкерного буфера киназы,3 мкл 10 мМ АТР, 1 мкл Т 4"полинуклеотидкиназы (10 ед./мкл), 3 мкл воды.Исходная Реакционная смесь И 2аналогична смеси И 1, но с 2 мкл (100 пмоль ЕВ 1 660Исходная реакционная смесь У 3 содержит 2 мкл олигонуклеотида ЕВ 1 6435Рчц 11 ХЬо 15 СтартТССАСТАТАСААТСТТССССААААСАССТССАССТААСАТАТСТТАСААССССТТТТСТССАССТССАТТ 20 ТТТААССААСААСССТССТТТСТСАТТССТС АААТТССТТСТТСССАССАААСАСТААССАС25 ЛизинТССАССАСАССААССАСААССААССАСТСТТТ АССТССТСТССТТССТСТТССТТССТСАСААА 1СССАСАСТТСССАТАССАСТАСССТССТ 3 СССТСТСААСССТАТССТСАТСССАССАХЪа 1 30не фосфорилируют, чтобы избежать образования мультимерных вставок ДНК на последующей стадии реакции лигирования. 35Линкер конструируют иэ отдельных олигонуклеотидов по схеме:5 ЕВ 1656 Р ЕВ 1643 Р ЕВ 1660 3 3 ЕВ 1636 Р ЕВ 1646 Р ЕВ 1638 5К реакционной смеси Ю 1 добавляЮт 2 мкл (100 пмоль) ЕВХ 656, а к реакционной смеси й 2 - 2 мкл ЕВ 1 638 (100 пмоль) и проводят реакцию гиб ридизации олигонуклеотидов друг с другом.В исходной Реакционной смеси Р 3 содержатся уже 2 комплементарных . олигонуклеотида (ЕВ 1 643, ЕВ 1 646).3 смеси нагревают в течение 2 мин при 100 С и медленно охлаждаютРПолучаемые в реакциях Р 1 " 3короткие двухнитевые Фрагменты ДНКлиГируют друГ с другом следующим 55образом: 1 О мкл смеси У (ЕВХ 636 + ЕВ 1 656); 10 мкл смеси К 2 (ЕВ 1 660 +ЕВ 1 638) 1 О мкл смеси Ь 3 (ЕВ 1 643 +ЕВ 1 646) 3 мкл О МИ АТР 1,мкл/мкл) 1 мкл ВОДЫ)10 длинкерный буфер кинаэы состоитиз 0,7 И трис"НС 1, РН 7,6, О, ИИ 8 С 1, 0,05 И ДТТ.Реакцию осуществляют в течение30 мин при 37 аС,.Затем Т 4-полинуклеотидкиназу инактивируют путем нагревадо 10 ФС.Олигонуклеотиды ЕВХ 656 и ЕВХ 638,которые образуют 5 -концы готовойвставки ДНК длиной 128 п.о. лигазы ДНК (7 ед./мкл). Реакцию осуществляют втечение 15 ч при 4 С.ДНК разделяют в 1 Ф"ном агароеномгеле и фрагмент ДНК длиной 128 п.о,выделяют. из геля путем .элюции.П р и м е р 12, Конструкция экспрессионных векторов.Плазмиду Н 8006 переваривают рестриктазами ХЬо Х и ХЬа 1 и вставляют в нее линкер длиной 128 п.о. (ХЬо 1- митохондриальный лидер - ХЬа 1) иэ" вестным методом (РЕ 022-А) Ген чИЛ-Д, снабженный митохондриальной дрожжевой лидерной последовательностью ДНК, подвергают двойному перевариванию ХЬо Х и Есо КХ и через ХЬо 1 Есо КХ вставляют в РКН 1 (РЕ 023"А).Изготовленную таким образом экс" прессионную кассету вставляют аналогично примеру 8 через ВЕ 11/НЫд 111 в дрожжевые трансформационные векторы. УЕр 3, рХРВ 207 и рЕА 3102 по сайтам Вап НХ и НпХ 111.П р и м е р 13. Трансформация дрожжей и экспрессия в дрожжах,Дрожжевой штамм ЫЗЗО(пример 9) трансформируют полученными плаэмида" .Ми и трансформанты исследуют на ихэкспрессию (пример 10).Штамм У 330-58 выращивают в культуре следующего состава, г/л: дрожжевой экстракт 6,7; глюкоза 10; аргинин 0,16; лизин 0,25; триптофан 0,06 метионин 0,08; цыстеин 0,03; гистидин 0,10; тирозин О,б; фенияаланин О, 17; треонин 0,16; изолейцина 0,18; валин 0,21; глутаминовая кислота 0,40; глицин 0,21; цистеин 0,02; аланин О,5; аспарагиновая кислота 0,20; пролин 0,20; серин О,5; аспарагин 0,10; глутамин 0,20; аденин 0,025; урацил О;050. Процесс выращивания осуществляют при аэрации до достижения оптической плотности 0,0 при 546 нм с испбльзованием магнитной мешалкиОсновную культуру состава: 8,0 г/ /л (Н),О 4; 2,56 г/л (НН)НРО;1,6 г/л КС 1; 0,60 г/л МдЪО 7 НО;0,56 г/л СаС 1 ф 2 НО; 0,04 мг/л биотина; 80 мг/л м-инозита; 40 мг/л Сапантотената; 8 мг/л тиамина;2 мг/л пиридоксина; 3,1 мг/л СоБО 4 ю 5 НО; 19 мг/л ГеС 1 з 6 НО; 12 мг/л ЕаЯОУНТ; 14 мг/л ИпВО ОНО; 5 мг/ /л НэО;мг/л КХ; 2 мг/л МасМЗБО Х 2 НО;г/л дрожжевого экстракта 0,2 г/л урацила; 0,1 г/л аденина;