Способ получения гибридного интерферона типа 1 2

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН 5/20 1)5 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР РЕТЕНИ ИЕ Н ПАТЕН 0-13 Бюп. Р 40Ингельгейм Ин рнацио(72) Рудольф ли, Петер Ме Эдгар фальки и Ингрид Мау (53) 577,2 ( ге относитсяии, в части гибридных Изобретение ческой инженер собу получения нов формулы икс ерфер иК- С 1 о 11 еРЬе - В.2)САС АТСТТС аВ 811 естное Вн 111 о М /И-ингде В 8111 означает соврестрикционное местерферонов;К - пептидная посМ -интерферонДНК-последоваэтого интерфеВя 111-местомК - пептидная посл2ность Я -интеруемая ДНК-по ледовательностьа, кодируемаятельностью ет-произ ванных пр мые для э рольные п рЕК 103, им(2.) 4202086/ (22) 09,03.86 (31) К 360783 (32) 10.03,86 (33) РЕ (46) 30. 10.90 (71) Берингер наль ГмбХ (РЕ Гауптманн, Петер Свндль, ГМнтер Адольфр, Герхард Бодо ер-Фоги (АТ) 88.8)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО ИНТЕРФЕРОНА ТИПА У, Оа(57) Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к способу получения гибридных интерферонов типа Ы, /К . Плазмидой р И%78 трансформируют штамм Е, со 1 НВ 101, отбирают штамм, продуцирующий интерферон, и путем последующей очистки получают интерферон формулы К п 11 еРЬе-К , где К, - пептидная последовательность 0 -интерферона;В. - пептидная последовательность 2Я,-иитерферона. 3 табл. остью этого интерферонаосле ВР 111-места разреза- пептидная последовательность Ю, -интерферона, кодируемая ДНК-последовательностью этого интерферонаперед В 8111-местом разрезпептидная последовательность М-интерферона, кодируемая ДНК-последователь. - .ностью этого интерферона после В 8111-места разреза; концевых мет- или М-формилодных или их И-гликозилиро-,изводных, а также необходи-,спресии репликонные и конт-:следовательности плазмидыеющие формулу1604164 5 ААТТСАСССТСАТСССТААААСАТТСТССАААААСАСССТТСАСТТТСССТТС 3 СТСССАСТАСССАТТТТСТААСАССТТТТТСТСССААСТСАААСССААС ПромоторСССААССАСТТААСТАСТАСАСААСТТСАССССААСССТААССАССТТТААССТСОСТТССТСААТТСАТСАТСТСТТСААСТССССТТСССАТТССТССАААТТССАПромотор/оператор + - -рНК"старт - рибоз, -+- линТАААСАТСТСТ ---АТТТСТАСАСАСТАС -реп - - ген -П р и м е р 1, Плазмиду рАТ 153 режут рестриктазами ВашН 1 и Рвй 1, Получаемые фрагменты разделяют в 1 -ном агаровом геле и выделяют большой фрагмент, содержащий начало репликацни лигируют его с полученным из плазмиды рагЕКЗЗ, расщепленной теми же рестриктазами, меньшим Фрагментом Т-ДНК-лигазой, Для осуществления репликации плазмщ бактерии Е.со 1 х штамма НВ 101 промывают раствором хло- ристого калия, полученные компетентные Е, со 1 х НВ 101 смешивают с лигированной ДНК и инкубируют при 0 С с нагревом до 42 С в течение 2 мин, Затем трансформированные бактерии наносят на содержащие ампициллин ЬВ-агаровые пластинки (ЬВ-среда + + 15 г/л агара). После инкубации при 37 С выбирают 12 иэ полученных .колоний и выделяют из них плаэмиды, Двойным перевариванием выбранных плазмид рестрикционными энзимами РвС 1-ВапН 1, РвС 1-Рчц 11 или ЕсоЯ 1-,ВашН 1 и последующим гелевым электрофорезом получаемых фрагментов подтверждается правильность конструкции этих плазмид, Полученную таким образом плазмиду обозначают рагрАТЕКЗЗ Эта плазмида, трансформированная в Е. со 1 д НВ 101, проявляет фенотип Ар" (устойчивый к ампициллину) и Тс" (устойчивый к тетрациклину). Плазмиду рагрАТЕКЗЗ расщепляют рестриктазами Н 1 пй 111 и ВашН 1. фрагменты разделяют в 1 -ном агаровом геле. Выделяют наибольший, имеющий около 3750 пар оснований (п,о,), фрагмент (фрагмент а), содержащий триптофановый промотор/операзйтор, начало репликации и ген Ар, илигируют с ДНК, кодирующей Я -интерферон. Эту ДНК получают путем разрезания кодирующей Я, -интерферон 25 плазмиды рИ%11 (или рИ%12) рестриктазами ВашН 1 и Н 1 пй 111 и последу 1 ощего разделения обоих фрагментов путемгелевого электрофореза, причем желаемый ген содержится в меньшем фрагменте с длиной около 800 п,о, Для осуществления репликации получаемых плаэмид растворомхлористого кальцияпромывают Е.со 1 ь НВ 101, смешивают их с реакционной смесью лигированной ДНК и после инкубации при 0 С плазмидную, ДНКпоглощают бактериями путем нагревадо 42 С в течение 2 мин. Трансформированные бактерии наносят на содержащие ампициллин ЬВ-агаровые пластин ки, После инкубации при 37 С выбирают 6 из полученных колоний и выделя. -ют из них плазмиды. Перевариваниемвыбранных плазмид рестрикционнымиэнзимами ЕсоК 1, Нпй 111, Исо 1 и Рвй 1 45 и последующим гелевым электрофорезом подтверждается правильностьконструкции этих плазмнд. Плазмицу,кодирующую Я -интерферон (С 1 п),обозначают как рКНИ 4, если в качестве исходной плазмиды используютрКБИ 2, кодирующуюЯ;интерферон (С 1 п)Эта плазмида, трансФормированнаяв Е. со 1 НВ 101, проявляет фенотип Ар" и ТсПри использовании в качестве исходной плазмиды рЖБ 11 аналогично получают плазмиду рИИ 13, кодирующуюЯ,-интерферон (С 1 ц). Получаемая такимобразом плазмида рИК 14 имеет в два,5 1604 раза большую степень экспресии для 1( -интерферона (С 1 ц), чем известная плазмида рИ%12. Плазмиду рагрАТЕВЗЗ и кодирующую Й-интерферон плазмиду рВНИ 4 режут В 8111 и БрЫ . Получаемые при этом фрагменты разделяют в 1 -ном агаровом геле, элюируют и очищают посредством осаждения этанолом, После растворения фрагментов в ТЕ- буфере получаемый из плазмидырагрАТЕВЗЗ большой фрагмент лигируют с получаемым из плазмиды рИ%4 меньшим фрагментом в присутствии Т-ДНК- лигазы. Для осуществления репликации получаемых плазмид раствором хлористого кальция промывают бактерии штамма Е. со 1 НВ 101, Компетентные Е. со 1 х НВ 101 смешивают с лигированной ДНК и после инкубации при ОфС плазмидную ДНК поглощают бактериями путем нагрева до 42 С в течение 2 мин, Затем трансформированные бактерии наносят на содержащие ампициллин ЬВ-агаровые пластинки (ЬВ- среда + 15 г/л агара). После инкубации при 37 С отбирают несколько колоний и выделяют из них плазмиды. Двойньщ перевариванием выбранных ,плазмид рестрикционными энзимами ВдП 1 и ЯрЫ и гелевым электрофорезом получаемых фрагментов подтверждается правильность конструкции этих плазмид, Плазмиду обозначают как рВН 72.Эта плазмида проявляет фенотип Ар" и Тс , кодирует О/Ю,-интерферон (01 ц) (Вя 1 П).Для получения кодирующей гибридный интерферон формулы (1) плазмиды, содержащей перед совместным местом разреза Вя 211 кодйрующую Я-интерферон последовательность ДНК, следует осуществлять две стадии, если в последовательности ДНК К-интерфе- рона имеются два места разреза ВЕП 1, как и в последовательности ДНК 1 в интерферон (Ар"), При этом на первой стадии получаемый из плазмиды рИ%14 путем разрезания Вя 111 и ЯрЫ большой фрагмент лигируют с получаемым из плазмиды рагрАЕВЗЗ путем переваривания с ВяП 1 и ЯрЫ фрагментом, который кодируетС-конецно -интерферона (Ар") вприсутствии Т -ДНК-лига 4 зы. Для осуществления репликации получаемых плазмид бактерии Е. со 11 НВ 101 трансформируют и культивируют с последующей проверкой конструкции этих 164 6плазмид. Выбирают получаемую таким .образом плазмщу и обозначают ее какрВН 77. Плазмиду рВН 77 разрезают Вя 111и 5 -концевой фосфат удаляют фосфата-.зой телячьего кишечника. Линеаризи.рованную плазмиду рВНИ 77 разделяют в1%-ном агаровом геле, выделяют и очищают посредством осаждения этанолом,после растворения в ТЕ-буфере лигируют с фрагментом с длиной 263 п.о.,полученным при переваривании рагрАТЕВЗЗ рестриктазами Вд 111 и ЯрЬ 1в присутствии Т-ДНК-лигазы, Бакте-,рии Е, со 1 НВ 101 трансформируюти культивируют с последующей проверкой правильности конструкции плазмидпутем разделения рестрикционнымиэндонуклеазами А 1 ц 1 и Нае 111. При 20 этом на основании идентичных концоввведение фрагмента с длиной 263 п.о.осуществляют в двух направлениях,Плазющу, в которую фрагмент ВЕ 111с длиной 263 п.о, введен в правиль ном для экспрессии положении, обозначают как рВН 78 г, а плазмиду с неправильным для экспрессии направле-нием - как рКН 78 й.Обе плазмиды, трансформированныев Е. со 1 д НВ 101, показывают фенотипАр и ТсДля осуществления репликацииили экспрессии новые плазмиды могутбыть внесены в бактериальный хозяин.35 При этом пригодны прокариоты, как,например, Е, со 11 К 12, штамм 294(зшг), ху 1-5, шг 1-1, зцр Е 44,ф ),бациллы, как например, Вас 11 цззцЬг.1 з и другие энтеробактерии, 45 как Ба 1 шопе 11 а йурЫшцгцш или БеггаСа шагсепзез, и различные псевдомонады. Для экспрессии новых гибридных интерферонов формулы (1) вЕ. со 1 трансформируют и культивируют, 50 например, плазмщу рВН 72, рВН 78 Е ирВН 78 г. После разрушения стенок клеток и удаления центрифугированиемобломков бактерии антивирусную активность экспримированных полипепти дов определяют в клеточной надосадочной жидкости. Клеточные надоса-,дочные жидкости, полученные из штамма Е. со 1 д, трансформированногорВН 72, и штамма Е, со 1 д, трансфор 7 1604164 8мированного рВН 78 К, не имеют антиви-,русных свойств. Получаемая из плазмиды рВН 78 г клеточная надосадочнаяжидкость, содержащая Я/К-интеРФерон (Вр 111), имеет в четыре разабольшую специфическую антивируснуюактивность на А 549-клетках, чем Минтерферон (Ар") .П р и м е р 2. 10 мкг рагрЕВЗЗв 200 мкл реакционного раствораразрезают 20 ед. ВашН 1 и 20 ед. Рз 1.Затем два образовавшихся фрагментаразделяют в 1 .-ном агаровом геле(1 агара в 1 хТВЕ-буфере, состоящемиз 10,8 г/л трис(оксиметил)аминометана (далее - трис), 5,5 г/л борнойкислоты, 0,93 г/л динатриевой солиэтилгндинитрилотетрауксусной кислоты ЭДТУК) и 0,5 мг/л бромида этидия, в качестве рабочего буфера используют 1 ТВЕ, электрофорез при5 В/см, ДНК-фрагменты делают видимыми путем облучения УФ-светом (254 нм)агарового геля. Содержащий 0 -интергферон (Ар ) меньший Фрагмент изолируют электрофорезом ДНК-полос на бумаге ЭЕ, бумагу промывают в 200 мМхлористом натрии 25 мМ трис рН 7,5,1 мМ ЭДТУК, элюацию ДНК осуществляют 30с помощью 1 М хлористого натрия,25 мМ трис рН 7,5, 1 мМ ЭДТУК и,добавляя 2,5 объема этанола, осаждают ДНК. После отделения центрифугированием ДНК высушивают и растворяют в пригодном объеме ТЕ-буфера, состоящего из 10 мМ трис рЯ 8,0 и 1 мМЭДТУК,10 мкг рАТ 153 в 200 мкл реакционнога раствора также разрезают 20 ед. 40ВашН 1 м 20 ед Рей 1, фрагментыразделяют, При этом больший, содержащий начало ренликации, фрагментвыделяют.По 0,5 мкг очищенных ДНК-фрагментов в 20 мкл реакционного раствора(66 мМ трис рН 7,5, 100 мМ хлористыйнатрий, 10 мМ хлористый магний, 5 мМдитиотрейтол, 1 мМ ЭДТУК, 1 мМ трифосфат аденозина лигируют 5 ед. ТДНК-лигазы. Затем к 150 мкл компетентных бактерий Е, со 1 НВ 101 добавляют 1 мкл продукта реакции лигирования в течение 30 мин при 0 С, инкубиоруют и путем инкубации в течение2 мин при 42 С трансформируют ДНК55(компетентные бактерии Е. со 1 х выращивают в ЬВ-среде (10 г/л триптона,5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л хлористого натрия, рН 7,5) до достижения оптической плотности ОП акоп , == 0,3 и центрифугируют. Бактерии повторно суспендируют в 0,5 объема ледяного раствора 50 мМ хлористого каль"ция иинкубируют в течение 30 мин. После повторного центрифугирования бактерии суспендируют в 50 мМ хлористомкальции 1/15 исходного объема. Суспензию бактерий наносят на ЬВ-агаровыепластинки (1 В-среда + 15 г/л агара)с 50 мкг/мл ампициллина. Через 16 чинкубации при 37 С выбирают 12 из образовавшихся колоний, из которых вмикромасштабе изолируют плазмиды.Правильность конструкции подтверждается двойным перевариванием рестрикционными энзимами Рз 1-ВашН 1, РзС 1 Рсщ 11 и ЕсоК 1-ВашН 1 с последующимэлектрофорезом в геле. Выбирают однуплазмиду, которую обозначают какрагрАТЕВЗЗ. Е. со 1 д, трансформированный рагрАТЕВЗЗ, дает Фенотип: резистентность к ампициллину и тетрациклину.10 мкг рагрАТЕВЗЗ в 150 мкл реакционного раствора подвергают двой-,ному перевариванию Нпй 111 .и ВашН 1Полученные три ДНК-фрагмента разделяют в 1 -ном агаровом геле и наибольший фрагмент, длина которого составляет приблизительно 3750 п.о., выделяют фрагмент. Этот Фрагмент имееттриптофановый.промотор/оператор (Беггаеа шагсезсепз), начало репликации и Ар -ген,10 мкг рВНУ 12 в 150 мкл реакционного раствора также подвергаютдвойномуперевариванию ВашН 1 иНпй 111. Образовавшиеся два фрагмента разделяют электрофорезом в геле,и меньший фрагмент (фрагмент б),длина которого составляет приблизительно 800 п.о. изолируют (он содержит Я, -интерферон (С 1 п) -ген,. 40 нг Фпагмента и приблизительно50 нг фрагмента б в 10 мкл реакционного раствора лигируют 5 ед. Т-ДНКлигазы, 200 мкл суспензии компетентных бактерий Е, со 1смешивают сраствором реакции лигирования, бактерии трансформируют внезапным нагревом до 42 С и наносят на ЬВ-агаровыепластинки, содержащие 50 мкл/мл ампициллина, Через 16 ч инкубации при37 С выбирают 6 колоний, из которыхв микромасштабе изолируют плазмиднуюДНК. После переваривания ДНК рестрик 9 16ционными эндонуклеазамн ЕСоК 1,НпйЕ 11, Бсо 1 или Рей 1 и последующего электрофореза в геле фрагментоввыяснилось, что одна из плазмид имеет желаемую структуру. Ее обозначают как рИ%14. Е. со 11 трансформируют рВНИ 14 и получают Фенотип Ар"и Тс,Для этого бактерии Е. со 1 хСЯВ. 603 (Р , гИг, 1 еиВ 6 ргоА 2,рИг, гесА 1, агяЕЗ, 1 М, цчгА 6,ага, 1 ас 71, яа 1 К 2, ху 1-5, ш 1-1,яуг А 98 (па 1 А 98), греЬЗ 1, гех, й,ецр Е 44), трансформированные плазмидами рКНИ 12 и рИ%14, выращиваютпри 37 С в экспрессионной среде(10 г/л фосфата аммония, 3,5 г/лгидрогенфосфата калия с рН 7,3,0,5 г/л хлористого натрия, 21 г/лгидролизгта казеина (гидролизован- ного кислотой, свободного от витаминов), 11 г/л глюкозы, 1 мМ сульфатамагния, О, 1 мМ хлористого кальция,1 мг/л тиамина в виде гидрохлорида,20 мг/л Ь-цистеина, 100 мг/л ампициллина) до достижения ОП 6 оо = О,б.10 мл этой культуры подают в открытую чашку Петри и УФ-лампой (15 Вт)установленной на расстоянии 50 см,облучают в течение 5 с и далее втечение 1 ч инкубируют. К культурам добавляют 100 мкг Э-циклосеринадля уничтожения способных к размножению бактерий. По истечении 16 ч инкубации при 37 С бактерии отделяютцентрифугированием. дважды промываютпо 5 мл солевого раствора Гершей(5,4 г/л хлористого натрия, 3,0 г/лхлористого калия, 1, 1 г/л хлористо, го аммония, 15 мг/л хлористого кальция В 2 НО, 0,2 г/л хлористого маг"ния в виде гексагидрата, 0,2 мг/лтреххлористого железа в виде гексагидрата, 87 мг/л дигидрогенфосфатакалия, 12, 1 г/л трис, рН 7,4) и инкубируют в 5 мл среды Гершей на100 мл солевого раствора Гершейиспользуют 2,0 мл 207-ной глюкозы,0,5 мл 27.-ного треонина, 1,0 мл 17-ного лейцина, 1,0 мл 27-ного пролина, 27-ного аргинина, О, 1 мл О, 17-ного тиамина в виде гидрохлорида,.20 мкг/мл ИАК-индоакрнловой кислоты.Добавлением 5 мг/мл 8-метионинаи дальнейшей инкубацией при 37 С втечение 1 ч новосинтезируемые протеины радиоактивно маркируют. Бактерииотделяют цечтрифугированием и в 04164 О200 мкл буфера (ДСН) - додецилсульфата натрия (6,6 мл Фосфата натрияс рН 68 р 2 мМ ЭДТУК, 27 ЛСН, 37 глицерина, 0,027 бромфенолового сине;го, 0,667 2-меркаптоэтанола) в течеоние 5 мин лигируют при 100 С. Пробызатем разделяют в 157-ном полиакриламидном геле (разделительный гель;157. акриламида, 0,47, бисакриламида,375 мМ трис, рН 8,8, 2 мМ ЭДТУК, 0,17.ДСН; собирательный гель: 67. акрилами-.да, 0,167 бисакриламида, 375 мМ трис,рН 6,8, 2 мМ ЭДТУК, 0,17. ДСН; электродный буФер: 3,0 г/л трис, 14,24 г/лглицерина, 0,335 г/л ЭДТУК, 0,5 г/л,ДСН; продолжительность электрофореза 16 ч при постоянном значении тока20 мА). Гель в течение 1 ч фиксируют20 в 20 Х-ном метаноле и 7,57-ной уксусной кислоте, в течение 30 мин инкубируют в 57-ном метаноле и 17.-ном глицерине с последуюшей сушкой. С помощьюусилительной фольги гель экспониру 25 ют при -80 С на рентгеновской пленке.Геновый продукт с резистентностью кампициллину (-лактамаза) в обоихслучаях одинаково маркируется.О 1-интерферон в случае рИ%14 болеечем в два раза сильнее маркированный, чем в случае рИ%12.П р и м е р 3. Экстракция С -интерферон (С 1 и) из бактерий,Штамм Е. со 11. НВ 101, трансформи 35роваыный рВНЫ 12/рИ%14, выращиваютв экспрессионной среде + 20 мкг/млИАК до ОНеоонщ = 20, Бактерии уничтожают добавлением серной кислотыдо значения рН 2 и инкубацией в теОчение 60 мин при 20 С. Бактерии отделяют центрифугированием и биомассу замораживают при -20 С до переработки, Бактерии повторно суспендируют в 10 объемах 17.-ной уксусной45кислоты. Добавляя 2 н, гипроокисинатрия, значение рН раствора доводятдо 10 и суспензию перемешивают в течение 2 ч при 0 С, Затея значение рНдобавлением 2 н. соляной кислоты до 50водят до 7,5 и остатки разрушенныхклеток отделяют центрифугнрованием(40 С, 10 ОООО об/мин, 30 мин), ИнтерФероновую активность в надосадочной жидкости (сыром экстракте) измеряют при помощи известного теста55,на человеческих клетках А 549 (клеточная линия рака легких человека), инфицированных вирусом энцефаломиокардита (ЭМК), с использованием в ка"11 16 честве стандарта м-интерферона (Ар"), При этом биомасса Е, Со 1 д, трансформированная рВНЮ 2, дает 100000 ед/г (среднее значение иэ трех независимых культур), а клон рВНУ 14 - 200000 ед./г биомассы (15 культур).П р и м е р 4. 10 мкг ратрАТЕВЗЗ и рВНУ 14, соответственно, в 130 мкл раствора подвергают двойному перевариванию Вк 111 и ЯрЫ. Образовавшиеся фрагменты разделяют на 0,83-ном агаровом геле, дезоксирибонуклеиновые кислоты элюируют и осаждают. Фрагменты растворяют в 20 мкл буфера ТЕ. Экспрессионную плазмиду для М/Я, - интерферона (В 8111) получают путем лигирования 1 мкл большого фрагмента из рагрАТЕВЗЗ с 5 мкл малого фрагмента из рВНИ 14 в 20 мкл среды в присутствии 5 ед. Т-ДНК-лигазы. После трансформации Е. со 1 х НВ 101 в микромасштабе выделяют плазмиды нескольких полученных резистентных к ампициллину клонов и правильность конструкции проверяют двойным перевариванием рестрикционными энэимами ВЕ 111/БрЫ. Выбирают одну из нлазмид и обозначают как рВН 72. Е. со 11, трансформированный этой плазмидой, имеет фенотип Ар; Тс4 мкл большого фрагмента из рВНЯ 14 и 5 мкл В 8111(2)-ЗрЫ-фрагмента из ратрАТЕВЗЗ, кодирующего С-конец М -интерферона (Аг"), в 20 мкл реакционного раствора лигируют 5 ед. Т-ДНК-лигазы. Образовавшейся плазмидой трансформируют Е, со 1 т НВ 101 и выбирают плазмиду желаемой конструкции. Эта промежуточная плазмида обозначается как рВН 77.С целью комплектования гена дляЦ/Ы-интерферона (В 8111), удаленныйпри разрезе рагрАТЕВЗЗс В 81 П фрагмент следует внести в рВН 77. Для этого 10 мкг рВН 77 разрезают с Вя 111в 50 мкл раствора, объем раствораудваивают с помощью 2 буфера СХР(С 1 Р - фосфатаза телячьего кишечника) . 2С 1 Р-буфер содержит 100 мМтрис, рН ,0, 2 мМ хлористый магнийФ0,2 мМ хлористый цинк, 5 -концевойфосфат добавлением 1 ед. С 1 Р удаляется (60 мин при 37 С) . Линеаризированную форму рВН 77 очищают электрофорезом в агаровом геле и элюацией ДНК с последующим осаждением. ДНК растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера и 1 мкл полученного раствора вместе с 5 мкл фрагмента с длиной 263 п.о. (ВЕ 111 04164 12/ЯрЫ, в 10 мкл реакционного раствора лигируют в присутствии 5 ед. Т -ДНК-лигазы. Е. со 1 д НВ 101 трансформируют и ДНК шести образовавшихсяколоний анализируют. Так как концыидентичны введение фрагмента с длиной 263 п.о. может происходить вдвух направлениях, плазмиды проверяют относительно правильности конструкции при помощи рестрикционных эндонуклеаз А 1 п 1 и Нае 111.Плазмида, в которую вставленВя 111-фрагмент в правильном для экспрессии положении, обозначается какрЮ%78 т, а другая с неправильным дляэкспрессии положением в . как рВН 78 Й.20 Е. со 1 д, трансформированный рВН 78 гили рВН 781, показывает фенотип .Ар",Тс . Трансформированный различнымиплазмидами штамм Е. со 1 д в 35 мл экспрессионной среды + 20 мкг/мкл ИАК 25 при 37 С выращивают до ОПоощ 0,6.Бактерии отделяют центрифугированием.Осадок бактерий суспендируют в 3,5 млраствора 50 мМ трис, рН 7,6, и 30 мМхлористого магния охлаждают льдом,обрабатывают ультразвуковым дизентегратором типа Сонипренпри максимальной мощности. Суспензию в течение 10 мин центрифугируют (10000 об/мин4 С) и надосадочную жидкость стерильно фильтруют. Антивирусную активностьраствора определяют с использованиемклеток А 549, инфицированных вирусомЭМК.Трансформированные рВН 72 М/ йсинтерфероном (ВЕП 1)бактерииЕ. со 1 х не проявляют антивируснойактивности, также как и трансформированный рВН 78 штамм Е. со 11, кодирующий первые 64 аминокислоты зрелого И -.интерферона и последующий се рин.По сравнению с этим результатомЙ/Ы"интерферон (ВЕ 111) проявляетв четыре раза большую специфичнуюантивирусную активность относитель но клеток А 549, чем М -интерферон(Арт), причем на 1 л культуры приОП брони = 1 клон рВН 78 т продуцирует приблизительно 30 10 ед интербферона.554164 14 40 45 50 55 13 160 1 х клона НВ 101/рВН 78 г в 1450 мл 13-ной уксусной кислоты, размешивают, . гомогенизируют в течение 2 мин при 10000 об/мин, добавляют полиамин Р до концентрации 0,253 и добавлением 5 н. гидроокиси натрия рН среды доводят до 10,0, При охлаждении льдом перемешивают в течение 2 ч и добавлением 5 н. соляной кислоты рН доводят до 7,5. Сырой продукт очищают центрифугированием (3000 об/мин, 60 мин, приблизительно 4 фС) .К сырому экстракту добавляют 430 г/л сульфата аммония и до полного осаждения оставляют стоять в течение 16 ч при 4-8 СОсадок отделяют центрифугированием ( 10000 об/мин, 60 мин, 4-8 С), растворяют в 145 мл 0,01 М хлорида натрия. Значение рН суспензии доводят до 7,5 добавленинием 5 н. гидроокиси натрия. При охлаждении льдом перемешивают в течение 3 ч и затем. раствор центрифугируют до прозрачности (10000 об/мин, 4 С, 60 мин) Диализуют в 0,01 М хлорида натрия до того, пока раствор интерферона не покажет осмолярность 370 осмоль/л.Двойная хроматография: для очистки хроматографией колонку из целлюлозы ПЕуравновешивают 0,025 М триссоляной кислотой + 0,2 М хлористым натрием, рН 7,5, и подключают к колонне емкостью 60 мл, которая содержит моноклональное антитело ЕВ 1-11 связанное с сефарозой 4 В. Колонка содержит 480 мг моноклонального анти-тела ЕВ 1-1 и уравновешена буфером при помощи триссоляной кислоты + + хлористый натрий, рН 7,5. Раствор интерферона пропускают через обе колонки, колонки промывают 0,025 М триссоляной кислотой + 0,2 моль хлористым натрием до того, пока в элюа.те измеряют только экстинкцию оптической плотности при 280 нм ниже О, 1. Затем отсоединяют содержащую 0 Е-целлюлозу колонку, а колонку, , содержащую антитело, промывают до ОП при 280 нм в элюате ниже 0,0 1, Адсорбированный интерферон элюируют О, 1 М лимонной кислотой в 253-ном этиленгликоле, собирают пик протеина. Кислый элюат колонки с антителом доводят до рН 4-5 добавлением 2 н. аммиака и получаемый осадок удаляют центрифугированием. Последней стадией очистки является хроматография на ионите моно-С. Колонку, содержащую 1 мл 5 10 15 20 25 30 35 ионита, уравновешивают при О, 1 М цйтратом натрия, рН 4,2, наносят ннтерферон и элюируют его градиентом рН (буфер А; О, 1 М цитрат натрия со значением рН 4,2; буфер Б: О, 1 М фосфат натрия со значением рН 8,0) . Интер" ферон И выходит при значении рН 7,0, пик интерферона собирают.П р и м е р б. Очистка С 0, -интерФерона.а) Экстракция и хроматография с использованием стеклянных частиц, имеющих поры величиной 120-240 меш.1794 г осажденных кислотой и замороженных при -20 С бактерий Е, со 1 клона рКНИ 14 при охлаждении льдом перемешивают в 7700 мл 1 Е-ной уксусной кислоте до полного распределения материала (около 30 мин) и при помощи 2 н. гидроокиси натрия доводят до рН 10. После перемешивания в течение 2 ч при охлаждении льдом суспензию доводят до рН 7,5 (2 н. соляной кислоты и центрифугируют в течение 1 ч при 10000 об/мин и 4 С, Прозрачную надо"осадочную жидкость в количестве 50 мл/ч пропускают через колонну, содержащую 500 мл стеклянных частиц, затем колонну тщательно промывают 0,025 М триссоляной кислотой + 1 М хлоридом натрия (рН 7,5). Адсорбированный интерФерон элюируют 50 мл/ч раствора 0,025 М триссоляной кислоты + О, 1 М КЯСИ в 503-ном этиленгликоле (рН 7,5), Затем пул интерферона подвергают диализу 0,025 М триссоляной кислотой ++ О, 1 М хлористым натрием, причем добавлением 103-ного полиэтиленгликоляс мол.массой 40000 одновременно достигается концентрация пула интерферона. Подвергнутый диализу концентратосветляют центрифугированием (1 ч,4 С, 15000 об/мин),б) Сродственная хроматография наантителе ОМГна сефарозном носителе.Очищенное моноклональное антителоОМГнаносят на сефароэ 4 В при помо"щи активированного брамистым цианомсефароза 4 В. При этом используют16 мг моноклонального антитела на1 г активированного сефароза 4 В, Дляразделения используют колонну с объемом 8 мл. Полученный согласно примеру ба концентрат колонны со стеклянныии частицами 4 мл/мин пропускаютчерез колонну с антителом и затемколонну промывают 0,025 М триссолянойкислотой + 0,1 М хлористым натрием, 1604164 16рН 7,5. до тех пор, пока в элюатебольше не содержится протеина (ОПпри 280 нм элюата идентична с плот-ностью промывного буфера). Затем связанный интерферон элюируют О, 1 М лимонной кислотой в 25%-ном этиленгликоле (2 мл/мин) и собирают пик протеина (ОП 80 и)в) Хроматография на ионите моно-С,Ионообменную колонну уравновешивают раствором О, 1 М фосфата калияв 25%-ном пропиленгликоле, рН 6,0Полученный согласно примеру бб элюатсодержащей антитело колонны подаютв количестве 0,5 мл/мин. Адсорбиро-.ванный интерферон элюируют при помощи в качестве градиента хлористогонатрия (буфер Ь О, 1 М фосфата калия + 1 М хларистый натрий, рН 6,0,в 25%-ном пропнленгликоле) . фракции(Опео ид) при применении 46% буфераБ содержит Я -интерферон.г) Жидкостная хроматография поддавлением с исгользованием обращенной Фазы.В качестве неподвижной Фазы служит колонна типа ВП-РП 18, 4250 мм,содержащая пористые частицы диаметрой 5 мкм и величиной пор 300 А. Вкачестве подвижной фазы служит градиент ацетонитрила в О, 17."ной трифторуксусной кислоте, Буфер А: О, 17-наятрифторуксусная кислота в воде; буфер Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле,Градиент 20-687. буфера В в тече-.ние 28 мин, Скорость подачи 1 мл/мин,Детекция ОП 2 . Через колонну пропускают 630 мкг полученногосогласно примеру бв протеина (пулинтерферона после хроматографии намоно-С) . Элюат в области 48-58% буфера Б анализируют, Интерферон элюиру"ют 24,5 мин с 63% буфера, Выход составляет 5-10 мкг, а удельная активность ) 10 ц ед/мг протеина.д) .Определение последовательностиЯ-концевых- аминокислот.Полученный согласно примеру ббпик Я, -интерферона сушат в центрифуге с последующим анализом. ПолуЧают следующую последовательностьаминокислот:ХХх-Азр,еи-Рго-С 1 п-Азп-Ххх-С 1 ц,ец 1,и-Яег 10 Эта последовательность подтверждает последовательность аминокислотпо кДНК (цистеин в положении 1 не 5может быть доказан без восстановле"ния и алкилирования протеина, а гистидин в положении 7 не может бытьоднозначно доказан.е) Очистка гибридного И,/М -интерферона (табл,1-3),Формула изобретения С пособ получения гибридного интерФерона типа И/М, заключающийсяв том, что плазмиду рагрАТЕВЗЗ обрабатывают рестриктазами Нпй 111 иашН 1, выделяют Фрагмент размером750 п.о., лигируют данный Фрагментс помощью Т-ДНК-лигазы и ВашН 1- Нпй 111-фрагмент размером 800 пор.оснований плазмиды рВНИ 11 или рВНИ 12,полученную рекомбинантную ДНК трансформируют в штамм Е. со 1 д НВ 101,выделяют плазмиду рВНЫ 13 или рВНЮ 4,лигируют В 8111-ЯрЫ-фрагменты плазмиды рИИ 13 или рВНУ 14 размером3,77 кВ с помощью Т-ДНК лигазы ифрагмент размером 1,18 кВ, кодирующий С-конец интерферона плазмидырагрАТЕВЗЗ, полученную рекомбинант ную ДНК трансформируют в штамм Е. со. 13. НВ 101, выделяют плазмиду рВН 77,обрабатывают плазмиду рВН 77 Вя 111,очищают линеаризованную форму плаз"миды рВН 77 и легируют ее с помощьюТ 4-ДНК-лигазы с Вц 111-БрЬ 1-Фрагментом длиной 0,26 кВ плазмиды рагрАТЕВ33, полученную рекомбинантную ДНКтрансформируют в штамм бактерий Е.со 1 101, выделяют плазмиду рВНУ 78 г 4 О трансформируют штамм. Е. со 1 д НВ 101плазмидой рВНИ 78 г, выращивают трансФормированный штамм, очистку белкапроводят путем осаждения с помощью10 мл 1%-ной уксусной кислоты, гомогенизации полиэтиленимином до концентрации 0,25%, доведением рН среды до10 с помощью 5 н, гидроокиси натрияс последующим снижением рН до 7,5с помощью 5 н, соляной кислоты и вне. сением в получаемый сырой экСтракт43% сульфата аммония, центрифугиро.- ванием диализом до осмолярности370 смоль/л, хроматографией на целлюлозе ЭЕ, затем на связаннойс моноклональным антителом ЕВ 1-1сефарозе 4 В, доведением рН элюатадо 4,5, центрифугированием, хроматографией на моно-С и элюацией прирН 7.604164 17 Таблица 1 Экстракция и хроматография с использованием стеклянных частиц (ХСЧ) с порами величиной 120-240 меш сИнтерферонед Продукт Объем,7700 19010 19100 9950 100 425 5310 28 4600 11500 1650 27300 45 10 24 410 Таблица 2 Сродственная хроматография на антителе ОМГна сефарозном носителе к Протеин Единиц мг7, 14 10 2,84 2,510 100 Подано 7Пул, содержащий Я -интерферон 2 4,2 10 43 3,04 10 О, 72 ФОпределение содержания интерферона осуществляют, измеряя антивирусную активность при помощи клеток А 549, инфицированных вирусом ЭМК, с использованием в качестве стандарта М -интерферона (Ар ) .указанное значение представляет собой среднее значение трех независимых опытов.Определение протеина осуществляют с использованием в качестве стандарта альбумина сыворотки. Сырой экстрактПул после . ХСЧПосле диа- лиза 1 1 Хроматография на ионите моно-С т Единиц Протеин,мг 1