Способ выделения оксидазы d-аминокислоты из trigonopsis vаriавilis

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1604163 АЗ 1)5 С 12 И 9/О МИТЕТТНЕЫТИЯМ ОСУДАРСТВЕННЫЙО ИЗОБРЕТЕНИЯМРИ ГКНТ СССР ИЗОБРЕТЕНИЯ ИСА АТЕНТУ 1, 86) Эстер сЬпо 1, 1981,1972.ИДАЗЪРБ 1 Б бл. к биотехИзобретение относится к биотехно- метку отрезлогии и касается выделения оксидазы белка.0-аминокислот, проявляющих активность На фиг,2 приведены результаты против цефалоспорина С, определения молекулярной массы оксиЦель изобретения - повышение чис- дазы В-аминокислот из ТгЦопорзз тоты целевого продукта. чагъаЪ 1 э. Электрофорез в геле сНа фиг,1 приведены результаты . додецилсульфатом натрия (ДСН) прово электрофореза очищенной оксидазы дят в 12%-ном полиакриламиде соглас Э-аминокислот в полиакриламидном но Ьаешш 11 Оасиге, 1970, 227, 680- геле, Электрофорез в геле 25 г чисто), Использованы следующие белкого белка в додецилсульфате натрия вые метки: А - альбумин (66000); показывает только одну полосу белка ОЧ - овальбумин (45000); Тг - трипс (темная меньшая полоса, видимая слева ноген (24000);- лизозим (14500)указывает границу двух "оконденсиро- На фиг.3 показана активность окванных" гелей). Добавляемую к гелям рашивания гелей по отношению к окают перед подкрашиванием(57) Изобретение относит 2нологии и касается выделения оксида= зы Э-аминокислот, проявляющих активность против цефалоспорина С. Цель изобретения - повышение чистоты целевого продукта. Фермент выделяют из Тгц,опорами.з чаг 1 аЪ 111 з способом, который проводят в 3 стадии, а именно: (а) подкисление и нагревание сырого клеточного экстракта с получением- осадка и супернатанта (всплывшей фракции); (б) обработку его сульфатом аммония в количестве, достаточном для образования второго осадка, содержащего оксидазу Р-аминокислот и (в)повторное суспендирование полученного на стадии (б) осадка и выделение изоэлектрическим осаждением. 6 з.п. ф-лы 3 ил., 1 та20 сидазе В-аминокислот. Показанныефракции взяты со стадии 111, Гелиинкубируют: а) с цефалоспорином С;б) с В-лейцином.Материалы.Пероксидаза (тип Н, из хренаобыкновенного), все аминокислоты,цефалоспорин С, динитрофенилгидразин и о-дианизин поставлены фирмойЯвша (Сан-Луи, США), акриламид иН,Н -метиленбисакриламид - фирмойМег 1-ЯсЬисЬагс 1 (Мюнхен, ФРГ), Б,Б,г 4И ,Б -тетраметилендиамин, перосульфатаммония и пластинки, покрытые0,25 мл силикагеля Р , - фирмойМег 1 (ФРГ), питательные среды - фирмой Мясо (Дейтройт, США); кислородный электрод - фирмой КапЕ Вгоняй егяВоЫяЬаш (Кембридж, Англия).Методики.Аналитическое изоэлектрическоеФокусирование проводят, используясистемы 1 КВ 1804-101, Используемыенесущие амфолиты имеют рН в интервале 3,5-9,5. Изоэлектрическое фокусирование проводят в соответствиис опытами фирмы 1 КВ на амфолиновыхпластинках с полиакриламидным гелем(ПА 1) (1 КВ - Ргоййгег АВ, Бромма 30Швеция, 1979). Железо определено спомощью атомной абсорбционной спектроскопии,Состояние культур,В исследованиях использованы дрожжи Тг 8 опоряя чагаЫ 1 я.Загружают большой объем культурв ферментатор емкостью 8 л. Питательная среда состоит из дрожжевого экстракта (1%), солодового экстракта(1,5%), в которые добавлено 0,2% В,Ь-метионина. Среду инкубируют 44 чпри 28 С. Исходную культуру помещают в косую среду, изготовленную изтой же среды с добавкой 2% агара. 45Клетки отделяют центрифугированиемпри 4000 в течение 30 мин, промывают и хранят в замороженном состояниидо использования. Средний выход клеток при различных ферментациях состав ляет 45-50 г клеточной пасты,Электрофорез,С аналитической целью проводятдисковый электрофорез в ПАГ так же,как в гелях с ДСН, при 8-10 С. Первоначально на трубку подают низкийток в 2 мА до момента миграции красителя в разделительный гель, послечего ток повышают до постоянного значения 4 мА на трубку. Диаметр и длина трубок соответственно 0,8 и 9,5 см, Для локализации белка гели окрашивают красителем Соошаяяде Вг 1.11 апг В 1 це 1 с.ферментативную активность на гелях обнаруживают согласно Нейгс 1 и ЯВСЬ, причем гели окрашивают детектированием образовавшейся перекиси водорода с использованием о-дианизидина, Гели инкубируют в 0,1 М натриФосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 5 мМ цефалоспорин С (или других аминокислот), пероксидазу (0,025%) и о-дианизидин (0,025%), Инкубирование проводят 30-60 мин до образования красновато-коричневого красителя.Для препаративного выделения фермента разработано специальное оборудование, Диаметр стеклянной трубки 2 см, ее длина 14 см, Гель (8% полиакриламида) получают согласно Нейгхс 1 и ЯппГЬ, используя в качестве буфера 0,19 М трисглицин (рН 8,3), Верхний гель полимеризован в присутствии персульфата аммония и тетраметиленэтилендиамина, а вместо рибофпавина ( количество катализатора взято согласно Ьаеппп 1 е. Электрофорез ведут 3-4 ч при 10 С, используя в пер-; вые 30 мин ток в 20 мА, а затем ток в 40 мА.Определение молекулярной массы.Молекулярную массу определяют по методике Нейгхс 1 и ЯшЬ, а электрофорез в геле с ДСН проводят согласно Ьаеппп 1. В первом случае используют метки для молекулярной массы при электрофорезе в гель неденатурированного полиакриламида (Ярпа), во втором случае - метки молекулярной массы в геле с ДСН. Определение белка . проводят согласно Ьоъту.Анализ активности оксидазы В-аминокислот.Путем определенияскорости потребления кислорода с помощью кислородного электрода фирмы ВапЕ проводят испытания оксидазы В-аминокислот при 50 С в течение 5-10 мин, в тече-. ние которых не происходит денатурирование фермента, Конечный объем испытуемой смеси составляет 2 мл, из которых 1,8 мл приходится на пирофосфатный буфер (20 м 1", рН 8), 0,1 мл - на цефалоспорин С (100 мМ) и соответствующее количество фермента, необходимое для получения правильной нают против буфера, содержащего 20 мМпирофосфат натрия (рН 8,3).Стадия 17. Изоэлектрическое осаждение.Образец со стадии 111 (10,3 мл)диализуют 12 ч против буфера, содержащего 25 мМ ацетат натрия (рН 5,1).Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием 30 мин при 12000В осадке обнаруживается следы ферментативной активности. Всплывший на поверхность продукт снова диализуют12 ч против буфера, содержащего15 0,1 М ацетат натрия (рН 4-6). Вооразовавшемся осадке обнаруживается большая часть активности оксидазы Э-аминокислот, Осадок растворяютв буфере, содержащем 20 мМ пирофосфат натрия (рН 8,3), и диализуют сут-.ки против того же буфера,Препаративный дисковый электрофорез в геле.Образец со стадии 17 используют251в препаративном электрофорезе в геле.Для электрофоретического испытанияиспользуют 5 мг белка со сгадин 17.Полосу, показывающую активность оксидазы аминокислот относительно цефалоспорина С, отрезают и гомогенизируют 5 мин в гемогенизаторе маркиРоег (1000 об/мин) в буфере, содержащем 20 мМ пирофосфат натрия(рН 8,3), затем полученную суспен 35 зию центрифугируют 20 мин при 1000 яГель промывают 3 раза равным коли-чеством буфера и всплывший на поверхность продукт концентрируют с помощью теплого; воздуха до конечного40 объема в 3 мл, которые используютдля дальнейших исследований.Степень очистки оксидазы Э-аминокислот из ТгдопорззчагаЬ 1 з, активность, измеренная относительно45 цефалоспорина С, содержание белка,определенное по методике 1.оигу, приведены в таблице., Предлагаемый способ упрощает очистку оксидазы П-аминокислот до однородного состояния, Препаративным электрофорезом в геле после изоэлектрического осаждения удаляют две дополнительные слабые полосы, наблюдае" мые при электрофорезе в геле. При этом удельная активность уменьшается с 5,8 Е/мг (см.таблицу) до 3, 8 Е/мг, Это можно объяснить частичным денатурированием, происходящим в ходе экст 5 1604163 6чальной скорости потребления кислорода; 1 единица (Е) соответствует поглощениюммоль кислорода в 1 мин в данных условиях. Время,от времени прове-ряют активность, измеряя колометрическим методом количество образовавшейся кетокислоты с использованием2,4-динитрофенилгидразина, а такжео-дианизидинпероксидазы при 30 С,П р и м е р. Очистка оксидазыЭ-аминокислот из Тгдроп орзчагаЬПьз. Все операции проводят при5 С,Стадия 1. Получение сырого экстракта,32 ч. замороженной клеточной пасты (-20 С) оттаивают и суспендируютв 1,5 ч. буфера, содержащего 20 мМпирофосфат натрия (рН 8,3). Клеточную суспензию смешивают с равнымобъемом сухого льда и размельчаютв миксере. Оксидаза Э-аминокислотизвлекается вместе с другими растворимыми белками. Разрушенные клеткицентрифугируют 30 мин при 12000 яСтадия 11. Тепловое осаждение.К подкисленному всплывшему на поверхность продукту со стадии 1(730 мл) для защиты фермента добавляют 25 мМ Р, 1 -метионина.Продуктнагревают до 50 С и оставляют приэтой температуре на водяной бане на10 мин, Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием 30 мин при1200 д, после чего отбрасывают.Всплывший на поверхность продукт диализуют в течение 1 сут против буфера, содержащего 20 мМ пирофосфат натрия (рН 8,3).Стадия 1 П. Осаждение сульфатомаммония.Образец сс стадии 11 концентрируют продуванием теплового воздуха надмешком для диализа (содержащим образец) с целью увеличения количествабелка на 1 . Добавлением 2 М уксус-.ной кислоты значение рН образца снижают до 6,3, после чего перемешивают 1,5 ч с твердым сульфатом аммония.Фракцию, подсоленную 30 . сульфатааммония, оставляют для образованияосадка, после чего центрифугируют30 мин при 12000 я. Осадок отбрасывают,а всплывший на поверхность продукт(после доведения рН до 6)смешивают ствердым сульфатом аммония (55%). Образовавшийся спустя 2 ч осадок центрифугируют 30 мин при 12000 е и диализу 1604163ракции, или потерей еще неидентифици- ки выделить из фермента флавины усперованных софакторов. ха не имели. Так, экстенсивный диаЭлектрофорез в геле полиакрилами- ,лиз против КВ в кислотном растворе да в додецилсульфате натрия дает 5 в щелочной среде результата не дал. единственную полосу (Фиг.1) для мо- Так жекак ни трипсинизацией, ни килекулярной массы примерно 43000 пячением или экстрагированием 85%- (фиг,2). Молекулярная масса белка ным раствором фенола не были полученысоставляет примерно 86000, флавины,Таким образом, оксидаза П-аминокислот в своей активной Форме сущест- Чистый фермент в 20 мМ пирофосфатвует в виде димера молекулярной мас-, ном буфере при РН 8,3 устойчив в замосы примерно 86000 и с.двумя субъеди-,в Роженном состоянии. Оттаивание и замораживание не ведет к потере активницами.оное окрашивание гелей пос ии При 8 С активность падаетферментное окрашивание геле посочень медленно, но при комнатной темле инкубирования соответственно сф спорином показы- пературе устойчивость относительноЭ-лейцином и цефалоспорином показ низка. Для увеличения тепловой устойвает только одну полосу на образце,чивости Фермент иммобилизую; различныполученном препаративным электрофоремя как менее 20 ми способами. Добавление 17,5 Е/млзом в геле, в то время как менеечистый препарат (стадия ) дает фермента, полученного после стадииоь после инкубиро- ТТТ ири 30 С в течение ЗО мин к сетри основные полосы после инку ирофарозе В, активированной СИВг, ввания с й-лейцином и только одну по"лосу с цефалоспорином С (фиг3). Это Оф 1 боратном буфере (РН 8,3) привоидит к постоянной активности в 7 Е/млуказывает на присутствие несколькихфоРмула изоб.от в ТГ опо я 1 я сефарозы.но только один из них проявляет ак-тивность против цефалоспорина1. Способ выделения оксидазы Э-амиВь еленная оксидаэа П-аминокислотФу е е10 нокислоты из Ргдопоряя, чаг 1 аЬ 1 дя,с активностью относительно цефалоспопредусматривающий получение сырогоина С обладает следующими свойствами.,рина С обладбесклеточного экстракта, ФракционироИзоэлектрическая точка фермента;вание сульфатом аммония до концентра-,п име но 4 6. Атомный абсорбционныйпримерно 4,6. , Р цции примерно 30 , отделение образоанализ доказывает, что фермент содервавшегося осадка, последующее фракжит 2 моль железа, что соответствует 35ционирование сульфатом аммония до дос 1 моль на субъединицуПосле диализатижения концентрации примерно 50%,п отив 10 мМ этилендиаминтетрауксусотделение второго образовавшегосяной кислоты и 1 мМ о-фенантролина соосадка, содержащего целевой продукт,ответственно активноснно активность остается неперевод его в растворимое состояниеизменнои. Обработка аРсе суспендированием в буфере, содержащемет активность до 46%ф ц ид пирофосфат натрия, о т л и ч а ю - оа ианидом -. и и их концентрации 0,5 мм.щ и й с я тем что целью по ышдля цефалоспоринаС фенил- чистоты целевого и.чнированию сульфатом аммония подверсоставляет соответственно 13, 10, 76,10,76 и 0,12, Образец, полученный пос- ную путем иодкисления бесклеточноголе препаративного электрофореза в ге- экстракта до РН 4-6, нагревания иле при концентрации 5 мг/мл, не даетудаления осадка, а после переведения. спектра, аналогичного спектрам зави- второго осадка в растворимое состоясимых от флавина ферментов, поскольку ние оксидазу П-аминокислот собираютоксидаза аминокислот, извлеченная из изоэлектрическим осаждением.почек свиньи, проявляющая активность 2. Способ по п.1, о т л и ч а юотносительно цефалоспорина С, зависи- щ и й с я тем, что подкисление ведутма от РАП (Р. Макяео, А. мошес, уксусной кислотой.1,С,Я. РегЫп, 1972 1 (РЗ), 2532), 3. Способ по п.1, о т л и ч а ю -55Добавление различных софакторов фла щ и й с я тем, что перед нагреваниемвина, таких как РМЮ или РА 0, не уве- добавляют 0,Ь-метионин до конечнойличивает удельную активность. Попыт- концентрации 25 мМ.1604163 4. Способ по п.1, о т л и ч а ю " щ и й с я тем, что перед Фракционированием сульфатом аммония осуществляют диализ супернатанта против буфе 5 ра с рН 8,3, содержащего 20 мМ пиро,фосфат натрия.5. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что перед диализом супернатант концентрируют испарением, 106. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что проводят дополнительную стадию очистки оксидазы РБелок, мг/мп Удельная акОчистка, выход, Х Стадии об- Общая акработки тивность,мг/мл тивностьЕ/мг 384 3,5 0,15 1 100308 5,6 1,О, 6,5 80 78 300 6,0 4,9 154 2,8 5,8 33 40 39 111111(рН 4,6) аминокислоты, полученной изоэлектрическим осаждением, элекрофорезом в геле.7. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что иэоэлекрическое осаждение ведут диализом против буфера с рН 5,1, содержащего 25 мИ ацетат натрия, с последующим удалением осадка и диализом раствора, полученного в результате указанной стадии диализа против буфера с рН 4,6, содержащего 100 мИ ацетат натрия.79 Подписноепо изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР -35, Раушская наб., д. 4/5