Способ конструирования гибридной плазмиды, содержащей генетический код термостойкой альфа-амилазы

Номер патента: 1200853

Авторы: Джонатан, Сьюзен

ZIP архив

Текст

(54)(57) С РИДНОЙ ПЛА ЧЕСКИЙ КОД ЗЫ, включ ОС ЕРМ щий ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТОПИСАНИЕ ИЗК ПАТЕНТУ 3383349/30-1514.01,8222528715,01,81П23 12 85. Бюл, УСПС Интернэшнл ИнДжонатан Р. Миленл (118)575. 224 (088. 8)Европейский патен12 К 1/02,ропейский патент12 Р 21/02. ОНСТРУИРОВАВИЯ ГИБСОДЕРБАЩЕЙ ГЕНЕТИТОЙКОЙ АЛЬФА-АМИЛАидролиз донорной ДНК ЕТЕНИЙ РФщ ЙВ Фцэндонуклеазой для получения линейнойпоследовательности ДНК с кодирующимальфа-амилазу геном, гидролиз эндонуклеазой реципиентного вектора дляполучения второй линейной последовательности ДНК соединение линейныхпоследовательностей ДНК с помощьюДНК-лигаэы, причем в качестве донорной ДНК используют природные илигибридные плазмиды из штаммовВасШиз з 1 еаго 1 ЬегшоЫ 1 ив АТССУ 31195, 31196, 31197, 31198, 31199,31783, а в качестве реципиентноговектора используют плазмиду, выбранную из группы плазмид, включающих рВБ 322, рВВ 325, рУЬ 625, ирС 194, из эндонуклеаз используютэндонуклеазу Нпй 111, а иэ ДНК-лигаэ - ДНК-лигазу фага Т55 Изобретени относится к генетической инженерии, а именно к получениюмикроорганизмов, содержащих генетический код Фермента термостойкойальфа-амилазы,П р и м е р 1, Получение плазмид, содержагцих гены альфа-амилазы,стойких к антибиотику.Вся ДНК, содержащая гены альфаамцлазы выделяется цз клеток штам)ма Вас1" пя яеаготйеппорМ 1 цяАТСС У 31783 с помощью известногометода Бернса ц Томаса, В соответствии с предлагаемым способом клеткису це.гцп;:г.ся в смеси 50 мМ хлоргцдрата тоцс оксцметил)аминометана(триг -С 1 0,6 мМ этилендиаминтетрауксусцой кислоты (ЭДТК) и 257-ногорясв, ра сахарозы вместо стандартного соляного цитрата прц рН 8,0,Кроме того, клетки обрабатываютсялизоцимом (2 мг/мл) в течениечври О С перед лизисом. Плаэмида рВК322 ДНК фермент ограничения Н 1 пс 1ТП и ДНК-лцгаза фага Т 4 полученыиэ лабора"орцй Исследовательскогоцентра в Бетесде, Мэриленд Смесь 7,5 р г от всей ДНК штаммаВас. я 1,саго,1 егторЬз.1 ця Фермент ограничения Н 1.г.с 111 и 10 и г альбумица сывороткибыка в 100 р л раствора,который содержит 50 мМ 11 аС 1 б мМтрис -ПС при рН 7,5 и б мМ МяС 1,инкубирукп цри 37 С в течение30 миц, 2,2 д г ДНК-плазмиды рВК 322и 7 единиц (Е) Н.пй 111 вывариваютсяв 20 р л того же раствора в течениео1 ч ири 37 С, Анализ ДНК на агаровомгеле показывает, что процесс вываривания" закончен,Затем 6,75 р г обработанной ДНКВас, я 1 еаготЬегтпорМ 1 пя и 1,8 1 гобработанной ДНК рВК 322 смешиваютсяв 0,3 мл раствора, содержащего 6,6 мМтане -НС 1 (рН 7,6), б,б мМ МрС 3.10 мМ дитцотрейзола и 0,067 мМ трифо. -сфата адецозина(АТП) и комбинируются с использованием 0,28 единицДНК-лигазы фага Т,1. Анализ на агаровых гелях ДНК после лигации показывает, что лигация завершена и оставшихся линейных молекул ДНК рВ 322 необнаружено,П р и м е р 2. Трансформация плазмид, содержащих гены альфа-амилазы ц маркер, стойкий к воздействию антибиотика, в К, Соа.,5 0 15 20 25 30 35 40 45 50 Культура Е. со 1 Б, полученнаяв виде штамма РВС 399 из Центра видов плаэмид, Медицинский центр Университета в Стэнформе, Калифорния,выращивается в среде, содержащей г/лтриптон 10,0; экстракт дрожжей 5,0хлорид натрия 5,0 глюкоза 1,0.)Культура выращивается в пробиркеав течение ночи при 37 С. Затем онаразбавляется 9 частями такой же среды и инкубируется при 37 С еще в теочение 135 мин при энергичномперемешивании. Клетки собираютсяцентрифугированием и промываются0 М холодным раствором 11 аС 1, Собранные. клетки Е.со 1 обрабатываются перед трансформацией в соответствии с известной процедурой,предложенной Коэцом и дрПоловина ДНК, которую подвергают лигации (получена в примере 1))переносится в клетки Е, со 11 ББ 1,Клетки культивируются на пластинках,содержащих ту же среду, на которойвыращивались клетки Е,со 1 за темисключением, что среда содержит ампициллин с концентрацией 50 р г/мпВ результате получают только клеткиЕ,со 1 содержащие плазмиду рВК 3221,с генами, отвечающими за стойкостьк ампициллину),В качестве средства для определения числа клеток, содержащих рекомбинированную ДНК; клетки, стойкие кампициллину анализируются на стойкость к тетрациклину. Так как введение фрагмента ДНК в участок рассечения фермента Нпс 1 111 штамма рВК 322в общем случае дезактивирует генплазмиды, отвечающий за стойкостьк тетрациклину, величина чувствительности к тетрациклину дает число клеток, содержащих рекомбинированнуюДНК, имеющихся в популяции клеток,Трансформация дает 3,6 х 10 клеток,стойких к ампициллину, на миллиметри 3,0 х 1 О клеток, стойких к тетрациклину, на миллиметр. Следовательно,примерно 167 клеток чувствительнык тетрациклину, что указывает насодержание в них плазмид с рекомбинатной ДНК,П р и м е р 3, Выделение колоний Е.со 1 синтезирующих альфа-амилазу.Приготавливается среда того же состава, что использовавшаяся для выращивания Е.со за тем исключением, чта дабавлякл 15 г/л агараплюс ампициллин 1,50 р 1 г/мл). Эта среда помещается на 130 пласгинак Петрии на нее прививается разбавленнаятрансформированная культура Е.са 1,попученная в примере 2. Эти пластинки дают в среднем 113 колоний нагластину. Колонии выращивают до техпор, пока ани не достигают в диаметрепримерно 1-2 мм, а затем копируют на 1 Опластинах с крахмальной средой следующего состава, г/л: 11 а Н 04 6; КНРО3, Бв,С 1 0,5; 11 Н,1 С 1 1; экстракт дрожжей 1; пептон 10; агар 15; крахмалЛинтнера 10. 5После выращивания в течение 3 чна пластинки, покрытые средой, содержащей крахмал добавляется бакте)риофаг Т,1 - АТСС11303-В 4. Для высвобождения всех внутриклеточных 20ферментов используется примерно 1 х,х 10 Т 4 на каждую пластинку, Послевыращивания в течение ночи и лизирования на пластинки наносится 2,57 ный йодный раствор Люголя с целью 25обнаружения всех прозрачных зон, образовавшихся под действием активностиамилазы,Из примерно 15 000 содержащихсяколоний 18 колоний образуют прозрач 30ные зоны, что указывает на присутствие амилазы. Колонии, проявляющиеактивность амилазы, подвергают копированию на пластинках, и при этомвновь проявляется активность амилазы35однако только после добавления бактериофага Т 4 к лизированным клеткам,Этот факт указывает на то, что амилаза получена внутри клеток. Последующие эксперименты показали, чта Э-цик40лосерин является эффективным дляполучения лизированных клеток, еслиэтот препарат добавляется в среду сконцентрацией 600 г/мл,Штамм Е.со 1 ВВ 1 содержащий век 1 45тор плазмиды рВВ 322 с геном амилазы,известен как АТСС3189.П р и м е р 4. Трансформацияплазмид, содержащих гены альфа-амилазы и маркер, стойкий к антибиотикуф 50в штамме Е.со 1 С 600, АТСС23724,Выращивается культура Е.со 1 д С 600, АТСС "23724, клетки собираются и подготавливаются к трансформации в соответствии с примером 2, 55Выращивается пять различных клонов амилаэы, полученных как описано в примере 3, и рекомбинатные плазмиды ныделяютсл при помощи стандартной пропроцедуры осветления лизата Клевелл и Хелински. Частично очишенная ДНК плаэмилы суспендируется в смеси 10 мМ трос -НС 1 и 1,0 мМ ЭЛТК с рН 7,5 перед перенесением в клетки Е.со 11., обработанные СаС 1. Эту ДНК подвергают анализу, устанавливая, что она стерипьна. Таким образом, никаких колоний, синтезирующих амилазу, не мажет появляться из-за копирования клеток, введенных вместе с ДНК. Трансформированные клетки выращиваются на среде, содержащей ампициллин с тем, чтобы продолжали расти только клетки, содержащие плазмиды. При проверке колоний на активность амилазы устанавливают 100 Е-ную корреляцию между присутствием плазмид и активностью амилазы. Это указывает на та, что ДНК плазмиды трансформирует оба штамма Е.со 1 и превращает их в продуцентов амилазы. Таким образом, это не зависит от штамма, но требует для своего осуществления рекомбинатную плазмиду.Штамм Е,со 1 д С 600, содержащий вектор плазмиды рВВ 322 с геном амилазы, известен как АТСС31 788,П р и м е р 5. Термостойкость альфа-амилазы.Четыре амилазных клона, полученных как описано в примере 3, и одна контрольная культура Е.со 1 ВВ 1 выращиваются в 15 мл среды, описанной в примере 2. Клетки растворяются добавлением В-циклосерина, а затем остатки клеток удаляются,центрифугированием, В жидкость, расположенную на поверхности, добавляют ацетат натрия и хлорид кальция с тем, чтобы получить концентрацию в 50 мМ и 2,5 мМ соответственно, рН доводится до 6,0. Растворы фермента помещают в пробирки с завинчивающимися колпачками, соединенными с лентой из тефлона, Растворы анализируют на активность амилазы, а затем выдерживаютопри 90 С в течение 45 мин. Активность амилазы определяют скоростью гидролиза крахмала, которая проявляется в скорости снижения способности окрашивать йод, измеряемой спектрофотометрически в соответствии с известной процедурой Б,У, Смита и Дж,Г,Роу, Контрольный штамм Е,со 1 д не обладает активностью амилаэы, С целью получения стандартов термостой 2008 ьзКО СЦ 3 Ки РОЛЬЫЙ ЛИЭД Е с СО 1 1Пабсц.ттст Оя очищенные дмилазы изас,:с.ссгОСтегтттог,т 1.тз АТСС 1 31783.: и .1 В полученной от сирмыСигма Кемцкэл Ка Сент-Луис, ттссури, цод наименованием Сигма А 6380и термдмип - термос.тойкая альфаамилазу, по:учецндя из ЛабораторийНОВО Ицк У 3 тон, Канн,еэупьтатц испьш дний приведены в ТОдбп, 1.Амипд.зд, синтезированная клонами,стоять же термостойкая, как и ферметш, ицтезировдштый донором В, ВСе;тт".01 13 ;. Оцд с равнима пот"Зйк: и с: ныпускаемоц проныткии ццогьюермостойкой альфа-ами. Тдзой ". ердьпттоы ц превосходит по:ц:тс:Труется в промьипленных масштабах культурой В, 3 тЬС 11 з,Пцдролизатц, полученные в результате обработки крдхмдлам каждой издтилаз анализируются при помощитонкопойной хроматографии с тем,стобы установить количество сахаровс Тшзким молекулярным весом, Относии ел;цос количество сахаров с низкиммо:тек тлярным езесом, образовавшихсяВ результате воздействия амилаз,30сицтсзираваццых клонами Е, со 1,диалоги шо тем количествам сахаров,которые получены при воздействиицзвспых дльфсз-дмилдз, использовавшихся в качестве коцтрольньтх, 35Полученные результаты показывают, что гец термостойкого фермента, полученный из крайне термофильных организмов, хорошо копируется в мезофильном бактериальном хозяине ц дает40 термос.тойкий ферментный продукт, Таким образом, установлено, что ген из крайне термофильных бактерий можно копировать в мезофильных бактериях45 с использованием методов рекомбинатных ДПК, Кроме того, синтез активного термостойкого фермента осуществляется прц нормальных мезофильных те;втер атурах приблизительно 20-40 С),оП р и м е р 6 Вьщеление естественно встречающихся плазмид, содержащих гены альфа-амилазыВся ДНК выделяется иэ клеток Бас, ВСедгОСЕегтсют 11 в АТСС31783, как описана в примере 1. ДНК плазмиды отделяется от всей ДНКри помощи ультрацентрифугирования с использованием хларида цезия, этидцйбромида ии 3 В Е С . т т0 и П Р 0 П Е,с3 ЬТ3 С.Сж ЕО Й Е, Рэдттсзфсс, У. Всузр;Ттт и, Ес. Виноградом.Тат фаКт, ЧтС .Пс .Ттсй;Тдэцтдт, содержит т ец Етзт.1353- с.а.ь, ус.тдцов - лен следующ:м обрд.:.4 ПК и;дзмидц рассек дет ся прц поьсп;ц сдер ецдрестрикции 1.тпс :., кдк и В приме- РЕ , ".ТТОЕП, ПолсспаОЦ с С 1; 33 ЕДСЦИЯ этой ДНК в Е, с 01. дцд: Огц 5 цс Прцмерам 1-3, ЛТдстт 53 фсцотипд стойкости к тетраццк;шцу отсе.3 тт, что3, 37 клеток сутзст 3 цтетт тк терациксишу и, 5 сто 3 телпо, аци содержат тслоетироттаттцую ЕПК. ПпосеивапцеЕслеОк 0носис;тт 0 дк И 3 ПОсТт альфаамипазы показала, что О,с 2 Х цлц приМЕРНО ОДНа ИЗ ТСстК,тк ВОСТ.;И КПЕОК,содержащих клопсроТд:нуо сст,с цмеепген аясазы, Рдс:с.осение цттд.тепдцВ, ВС еаго "тегтпо,". т 11,с прц цо.ошН ПСт ддссцТТТЕППЬСс фазтиас ЫДНК, которысс разделяют с;я ц: Ттосемьлегко обтдр 3-житдеьх пстттстс ттц помаши электтафОРсз д цст д дРО ВО м Гетто,Ч Д СОДс КЛ О Ц И Р 0 В с ПТ Я К;сс С С Д Д с Т Т:т Д 3 Ы( 1/8) равна приблизц". е:и цо отгттддемой, если одна иэ восьми преобпадссЮщИХ ПОЛОС С Стдс )СитЕц дмцстдзы,Андлттз таких попас ц:Тд.тыдо ПакдзыС С.:ОСтс 335 Е это тат же дтпппе кукц ЦРЦ сДЦД:ЦТ:3 Е вает, что адпд тэ по:опримерто 3,6 Мд, т,е.размер, что и кпоТПтоВДПК, которые 03 учтеныплдзмидд примера 1Этот эксперимент цочто по крайней ьсерс оддмилазы распопожет тдвстречаощейся ппдз пцдемом штамме В, сСеагоС,т(;Тзццдст,И Ц Г Е Ц с Л Ь 1 3 с. е с.те ст 3 сццо В ИС:ПОЛЬЗУЕ;.г.3031 1 цв,П р и м е р 7, Получетие и вьтделецие штдммоц Е, с.о:., содерждтцетх различные гибрцпцце ппдзмиды. А. Культура производящих дмилазуЕ, со 11, выдепешая как оисапа впримере 3, АТСС .д 31 789, вт.рдттттвается в течение ночи в среде, исттопьзуемой в ттрюере 2, ДНК плдз.птдц усиливается при помаши изтзестцой процедуры Клевеллд Д,Б. с. Испои зотздццем170 Т Г ХтОРДМссвтСОтД ЦД МИЛЛЦМЕтР.Для усцтлеция испо;ьз уст ся следующаясреда, г/л: П т РО 46,0, КП РО 4 3 02 42 Р 4с 1 аС 1 0,5, сПС 1 1,0 кдзвицатесЕаминокислоты 5,0, глюкоза 2,0,СдС 2 НО 0,015,;р.,О 4 7 Н (т0,2 сс 6, витамин В0,001,10 5 20 30 25 Б. Гибридная плазмида, стойкая к хлорамфениколу и ампициллину, полученная в части А, используется в каДНК плазмиды затем выделяетсяпри помощи стандартного метода осветления лизата Клевелла и Хелински. Изолированные плазмиды подвергаются очистке при помощи этилийбромида СзС 1 методом примера 6, а затем при помощи экстрагированияизопропанолом и глубокого диализав 1 О мМ трис -НС 1 плюс 1 мМ ЭДТК срН 7,5,Культура Е,со 11 ВН 1,ВС 399,содержащая 3,9 Мд, плазмида рВР 325выращивается, а ДНК плазмиды усиливается, выделяется и подвергаетсяочистке указанным методом.ДНК двух полученных плазмид рассекаются ферментом рестрикции Н 1 ЬЙ111. Растворы рассеченных плазмидсмешиваются и подвергаются лигацииопри 0 С в течение 18 ч с использованием общей процедуры примераДНК после лигации переносится вЕ.со 1 х БВ 1 при помощи метода, описанного в примере 2. Клетки разбавляются и наносятся на агаровыепластинки, содержащие хлорамфениколс концентрацией 20 р г/мл, В результате этой процедуры получают клеткиЕ,со, содержащие только плазмидурВБ 325 с генами, отвечающими застойкость к хлорамфениколу), Колонии клеток, которые при этом получают, просеивают на активность амилазы при помощи метода, описанногов примере 3 для растворения клетокиспользуется 1)-циклосерин,Рекомбинактная ДНК плазмиды изтрех колоний, которые обладают активностью амилазы и проявляют стойкость к хлорамфениколу, экстрагируется осветлением лизата, описаннымв примере 4. Выделение рекомбинатных плазмид на агаровых гелях показало, что они имеют ожидаемый размер для комбинации плазмиды рВ 325плюс 3,6 Мд фрагмента, содержащегоген амилазы. Воздействие на плазмиду ферментом Нюй 111 дает 36 Мдфрагмента и линейную форму плазмидырВБ 325. Это говорит о том, что50ген амилазы может повторно копировать.ся на различных векторах, рВГ( 325,не теряя своей активности по синтезуамилазы. Полученный штамм Е.со 1известен как АТСС Р 31 792,55 честве донора фрагмента ДНК, который содержит ген альфа-амилазы, Этот фрагмент соединяется с 10 Мд плазмиды вектора ВрЖЬ 625 указанным в части А ме.одом, Плазмида рЬ 625 описана У,Гоебелем и др, Она может быть выделена из культуры штамма Е,со АТСС - 31787 при помощи процедуры выделения плазмиды, использованной в части А, Этот вектор наделяют стойкостью к антибиотикам, ампициллину и канамицину, Введение ДНК в рЬ 625 в область Н 1 пс 1 111 разрушает стойкость к канамицинуКлетки Е,со 1 ВВТ которые трансформированы введением рекомбинатной ДНК, выращиваются на агаровых пластинках, содержащих ампициллин. Те колонии, которые обладают стойкостью к ампициллину, но не обладают стойкостью к хлорамфениколу из-за присутствия рВВ 325, и проявляют, активность амилазы отбираются для анализа, ДНК плазмиды выделяются из колоний. Анализ на агаровых гелях перед и после воздействия фермента Нпй 1 Т 1 показал, что фрагмент ДНК, содержащий ген амилазы, копируется на плазмиде рЫЬ 625 и дает новую плазмиду. Штамм Е.соа, содержащий такую гибридную .,лазмиду известен как АТСС Р 31791.П р и м е р 8. Трансформация двух различных гибридных плазмид в одном штамме Е.со 1,Выращивается штамм Е,соа, синтезирующий амилазу, полученный в примере 7 Б; затем он подготавливается для трансформации при помощи процедуры примера 2 Очищенная плазмида полученная в примере 7 А, трансформируется в этих клетках, При выращивании полученных на агаровых пластинах содержащих хлорамфеникол, все колонии проявили активность амилазы. ДНК плазмщы выделяют из одной из колоний и анализируют на агаровых гелях. Установлено, что присутствуют обе гибридных плаэмиды, описанные в примере 7 А и Б, Этот эксперимент показывает, что культура Е,со может продолжать расти и содержать одновременно две различные гибридные плазмиды, содержащие гены альфаамилазы, Стабильность в течение продолжительности времени этой комбинации не определялась. Штамм Е.со 1, содержащий эти две гибридных плазмиды, известен как АТСС У 31790р ц .1 е э 9,рдцефаэмл 1 л вЗП 1,Э,Е ЭЖ ИХ ГЕ ВЬ 1 ЭЬФД и.1 И - па.зы и маркер, стоцких к;эцтиби 11 - ку 13 1 ьг 1 дм",1 е В, ц.1Л. еалучецис эссэсэра ЕЦк.Гибридная плдз мида, полученая в примере 711, используется в качестве донора Фрагмента,НК, который содержит гец альфа-амлазы. Оц экстрдгируетсяри помаци процедуры освет:ения лиза га Клеззеллд и Хелицс.кц, 11 НК этой плдзмиды рдссекдется Ферментом рестрикции НтЛ Е 1 алученцый продукт смешивается с: небольшим количе.твом бромида этидия и выделяется с использованием известного метода 1 О 15 Б, 11 олучение векторапереносчика)111 дмм Е, зь,тз.э.з, полученный из Генетического центра хранения бацилл Факультета микробиологии Университета штатд Огайо под названием штамм 30 У 1817, сопс ржащий 20 Мд плазмиды рС 19 гз, который содержит ген, выделяющийся стойкостью и хларамфениколу, наносится полосами на пластину, содержащую триптический соевьэз 1 агар Дифка, полученный из лабораторий Дифко, Детройт, Мичиган и 50 Эг/мл хлорамфеникола, Далее клетки прививаются на 150 мл бульона Пендссея (Дифко) в 1-литровой колбе и вырао щиваются н течение ночи при 37 С цри встряхивании, Клетки гранулируотся и вновь сусцендируются в 10 мл протопластного буфера 25 Е сахарозы, 0,1 М ЕЕаСЕ - 0,05 М трио НС 1 при рН 7,5 и 0,05 М ЭДТК при рН 8,13)/1 5 мг моцтежю белого лизоцимаСигма Кемикэл Компани" добавляется на 30 мин при 37 С, Затем энергично перемешиваются 13 мл 27-ного раст вора додецилсульфата натрия в 0,7 М ИдС 1, а затем 2,ч мл 5 М раствора ЕЕаСТ. Смесь охлаждается в ледяной воде и центрифугируется с: ускорением 2 000 х д в течение 20 мин, 55ДНК осаждается равным объемом изопропиловэго спирта. Твердый остаток выдерживается в ледяной воде 45 градиента сахара зы, пред ожс.иага Эл - Гью.ги и Хеллиц го м, 3, 6 Мд Фр агме цт, содержащий гец альфа-дмила: и, дважды экстрдгируется и-бутиловым спиртом, 20 осаждается равным объемам изопропилового спирта и суспецдирустся в смеси 10 мМ тр 11 С плнэс 1 мМ ЭЛТК с рНо 7,8, выдержэ 11,ется г 1 ри -20 С перед использованием, 25 веение б 0 ч затем сабир:етсяценз рифугиравдцием и сусцецдирусэсяв раствор, содержащий 0,0оясхлоргидрата и 0,001 . ЭЕТК црц р7,5, ДНК плазмиды выделяется црипомощи ул трацентрифугировация, с.использованием бромида этидия,е 1 сэдом Радлоффа и др, 2 ,з плдзмидыобрабатывается экстрдгировдцием изопрапиловым спиртом и глубоким диализом в 10 мМ трис плюс 1 мМ ЭДТК прирЕ 1 7,5,В. Получение :ибридцой плазмиды.2 Мд-вектор части Б рассекаетсяпри помощи фермента рестрикции э.пйи с:мешивдется с З,б Мд ФрагментаДНК части А, Концентрация вектораи лонорной ДНК 5 и 17,Ээ г/мл соответственно. ЕЕигация осуществляется кдки в примере 1. Отсутствие каких-либолинейных 3,6 Мд-Фрагьентоз послелигации этот факт устанавливаетсяпри помощи электрофореза на агдровомгеле ) указывает на то, что лигацияз авершен а,Г. Тр ансформация гибридной плдзмиды в В. дэзи. Е.э.в,Культура В. зэсэ;,т 3 э.з, ОТССз": 31735, которая не содержит генадмилазы, выращивается в течсние ночина пластинке, содержащей агар цд основе тритаза крови (Дифко) и 1 Е-Эзыйраствор растворимого крахьаэд. Наплдсзтинку добавляется 2 мл среды длявыр дщив дция следующего состава, l:О,б, цитрат натрия 2 Н О 0,1; МпОСг7" О 0,12; глюкоза 0,5; кдзеицовыеаминокислоты ( Дифко ) 0,02 Е,-трипто 1 дн 0,005.Примерно 0,1 мл суспензии клеток,полученной таким образом, добавляется в 10 мл той же среды в 250 мл колбе и инкубируется при 37 С энерогичном перемешивдции в течение 4 ч.уЗатем 1 мл культуры добавляется в9 мл предварительна нагретой средыодля трансформации при 37 С и инкубироцдние при встряхивании продолжаетсяв течение 90 мин. Среда для трансформации является той же, что и средадля роста, эа тем исключением, чтоона содержит 0,017.-ный раствор казеиновых аминокислот и 0,00057-ый ра.твор Е,-трип афана. В 0,25 мл культурыклеток с плотностью примерно 1 х 10 клеток/мл добавляется 5 ЕЭЕл раствора гибридной плазмиды части В, содержащей120080,12 г плаэмиды, Смесь энергично встряхивается при 37 С в течение 30 мин разбавляется равным объемом бульона Пенассея (Дифко) и встряхивается при 37 С еще в течение 90 мин.оПорция клеток в 0,1 мл наносится на пластинки, содержащие агар на основе ,триптонакрови (Дифко), 12-ный раствор растворимого крахмала и 20 1 г/мл хлорамфенила, В качестве контрольных 10 проб клетки В, яцЫ;11 я без плаэмиды и клетки В. яцЫ 1 я с вектором плаэмиды рС 194 наносятся на ту же среду.Ни одной колонии не было отмечено на пластинках, где клетки не содер жали добавляемые плазмиды, Три колонии отмечены на пластинках, где клетки содержали плазмиду рС 194, но ни одна из колоний не проявила активности амилазы, 20Одна колония отмечена на пластинках, на которые нанесены клетки, содержащие гибридную ллазмиду ДНК частиВ, Она дала прозрачную зону привоздействии паров йода,Это указываетна то, что клетки синтезируют внеклеточный фрагмент амилазы, Оказалось,что клетки требуют присутствия хлорамфеникола для стабильности, Эта культура известна под названием АТСС30Р 31786,Проба ДЕК колонии, содержащей амилазу, выделяется при помощи электрофореза на агаровом геле, Отмеченаполоса плазмиды в примерно 5,6 Мд, 35Это соответствует размеру гибриднойплазмиды из части В,Очищенную гибридную плазмидурассекают ферментом рестрикции Нпй111 и подвергают электрофорезу наагаровом геле, В результате получаютдва фрагмента примерно 2,0 и 3,6 Мд,Они соответствуют размерам донорнойДНК части А и ДНК вектора части Б,Р, Трансформация гибридной плаэ 45миды во втором штамме В. яцЫЫ я,Гидридная плазмида, содержащаяген амилазы, выделяется из клеток колонии, синтезирующей амилаэу, иэ части В, при помощи процедуры, котораяиспользовалась для выделения плазмирырС 194 в части Б, Выделенная гибриднаяплазмида трансформируется в другомамилаза-отрицательном штамме В, яцЬ 11 я штамм Р 1 А 289), полученномиэ Генетического центра хранениябацилл, факультета микробиологии,Университета штата Огайо, Трансфор 53 2мация осуществляется при помощи известного метода слияния фотопласта,предложенного С,1 ангом и С,Н,КоэномВ результате выращивания клеток на пластинках методом, описанным в часети Г, зафиксировано примерно 1 хО колоний/мл на пластинках, не содержащих хлорамфеникола, Зафиксированотакже примерно 1 хО колоний/мл на9пласт инк ах, содержащих хло р амфе никол, При помощи испытания крахмал -йод, установлено, что все эти колониисодержат амилазу. Такие, содержащиеамилазу В, яцЬь 11 я известны подназванием АТСС 9 31784,П р и м е р 10, Термостойкостьальфа-амилаэы, синтезированной штаммом В, яцЬ 11.я, содержащим гибриднуюпл аз миду,Клетки В. яцЫ 1 я, содержащиегибридную плазмиду, из примера 9 Д,АТСС Р 31784, выращиваются в 1 л среды в 2,8-литровой колбе Фернбаха сиспользованием среды следующего состава, 7.: кукурузный крахмал 9,0," кукурузный насыщенный ликер 6,0, аутозилат дрожжей (примекс, полученный из лабораторий Амбер Джуно Висконсин) 0,35; (1 Л 1.) ПРО, 1,0; КР РО40,05, кукурузное масло 1,0; термаьил0,05 Е/мл,Среда выдерживается в автоклаве в течение 30 мин при температуре 121 С, которая разрушает активность термамила, а затем охлаждается до комнатной температуры, Далее, в среду перед прививкой культуры клеток добавляется 0,01 мг хлорамфеникола на миллилитр, Бульон центрифугирует-. ся и термостойкость испытывается с использованием разбавленной пробы верхнего слоя жидкости и общей процедуры примера 5. Для сравнения измеряют также термостойкость амилазы культур В. я 1 еаго 1 ЬегшорМ 1 ця,В. яцЬ 11 я, а также известной амилазы - термамил в среде для инкубирования, содержащей 50 мМ ацетата натрия и 2,5 Ю 1 СаС 1 (это амилазы, использовавшиеся для сравнения в примере 5) .Результаты испытаний приведены в табл. 2. В этом испытании амилазы, синтезированная клоном В. яцЫ 1 я АТСС 11 31 84, обладает не меньшей термостойкостью, чем фермент, синтезиро13 1200853 14ванный культурой-донором В. я 1 еаго- альфа-амилазой, термамилом и превыСегщорМ 1 ыя, Она сравнима по термо- шает по термостойкости альфа-амиластойкости с известной термостойкой зу В. ячЫ 1 я,Таблица 1 ность тя мин при Е/млЕ.со 1 (контрольная) 71,4 0,21 0,15 Контрольная + термамил 0,34 87,2 0,39 Контрольная + Ы,-амилазаВ. яиЬ 1111 я (Сигма А 6380) 0,01 4 8 0,21 Контрольная + клон 0,45 0,38 84,4 0,22 0,18 81,8 Контрольная + клон 2 Контрольная + клон 3 0,29 0,36 81,0 0,35 83,3 Контрольная + клон 4 Таблица 2 Проба фермента ностья 45 ми оцент сохранивйся активности В, я 1 еаго 1 йегиорИ 1 ч яиЫ 1 я,2 О,Фермент В 31 78 ьту 1,07 Чибисоваиец Коррект Со ставител Техред А,Б дактор Н, Егор око сов акая 7880/6 Тираж 524 НИИПИ Государственного по делам изобретений 035, Москва, Ж, Рау

Смотреть

Заявка

3383349, 14.01.1982

СПС Интернэшнл Инк

ДЖОНАТАН Р. МИЛЕНЗ, СЬЮЗЕН МИККЕЛ

МПК / Метки

МПК: C12N 15/00

Метки: альфа-амилазы, генетический, гибридной, код, конструирования, плазмиды, содержащей, термостойкой

Опубликовано: 23.12.1985

Код ссылки

<a href="https://patents.su/8-1200853-sposob-konstruirovaniya-gibridnojj-plazmidy-soderzhashhejj-geneticheskijj-kod-termostojjkojj-alfa-amilazy.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ конструирования гибридной плазмиды, содержащей генетический код термостойкой альфа-амилазы</a>

Похожие патенты