Способ получения днк-полимеразы бактериофага т4 в клетках еsснеriснiа coli

3,. Необходиддо с Гь получеедия есоддцентрцроваццого фаголизата с использованием полпэтипенгликоля и последудощей точисткой от полиэтиленгликоля, чтоусложняет процесс,"4, Необходимость предварительногоэкспериментального определения оптиддальддого количества полимина Р дляфракпиоцирования экстракта в каждомконкретном случае вьдделения ДНК-полимеразы бактериофага Т 4, что также усддожняет процесс.Наиболее близким по техническойсущности и достигаемому результату является способ получения ДНК-полимеразы, инфицируемой бактериофагом Т 4 в клетках Е,со 11.Способ вкгдючает следующие операции.1. Получение фаголизата бактериофага Т 4 ат Р 82 на Е.со 11 СКи концентрирование его полиэтиленгликолем.2Получение биомассыклеток Е.со В. инфицированных бактериофагом Т 4.3. Вскрытие клеток перетиранием со стедсляпцыми шариками (или с алюмддддиевой пастой). Операции 1,2,3 - получение клеточного экстракта,4. Действие ца клеточный экстракт стрептомицицсульфатом - осаждение ДНК (вместе с целевым продуктом).5. Для извлечения целевого продукта используют полученный осадок. Его переводят в раствор, после чего удаляют нуклеицовые кислоты, для чего проводят автолиз. При этом частично удалядотся некоторые белки.6. Фракциоддддрование белков сульфатом аммония.7. Очистка целевого продукта путем колоночной хроматографии. сначала ионообменная хроматография белков на фосфоцеллюлозе, затем дополнительная очистка от остатков нуклеиновых кислот на ДЭАЭ-целлюлозе и гидроксилапатите.Основными недостатками этого способа, как и превддущих, является низкий выход целевого продукта (8%), а также сложность процесса, обусловленная предкде всего необходимостью проведения операции автолиза. Сложность и отрицательные последствия этой онерации общеизвестны. На стадии проведения автолиза происходит большая инактивация целевого продукта за счет высокой температуры (37 С) и действия протеаз (на что указывают сами авторы работы), а следовательно, и большие потери.Необходимость предварительногоэкспериментального определения нужного количества стрептомицинсульфата (операция 4) для осаждения целевого продукта совместно с ДНК в каждомконкретном. случае также усложняет процесс.Более второстепенные факторы, также приводящие к низкому выходу продуктаи усложнению процесса его получения, следующие;Ф1. Необходимость предварительногополучения концентрированного фаголизата с использованием полиэтиленгликоля;2. Иалый выход биомассы клетокЕ.со 11, инфицированных бактериофагомТ 4 (226 г из 100 л ростовой среды),ддесморя на использование богатойпитательной среды.25Целью настоящего изобретения яв-.ляется повышение выхода целевого продукта и упрощение способа.Поставленная цель достигаетсятем, что в способеполучения ДНК -полимеразы бактериофага Т 4 в клетках ЗО Е.со 11, включающем получение клеточного экстракта, осаждение ДНК стрептомицинсульфатом, фракционированиебелков сульфатом аммония и хроматогдрасжю, извлечение целевого продуктаосуществляют из супернатанта послеосаждения ДНК стрептомицинсульфатом. Сущность способа основана на том,что извлечение целевого продукта прощ водят из супернатанта (раствора) приосахдении стрептомицинсульфатом, а не из осадка, как в прототипе и вовсех известных способах. Экспериментальным путем авторами установлено, что в ра-.створе (супернатанте) присутствует в 3 раза меньше ДНК и в 10 раз больше целевого продукта. То есть осадок значительно больше загрязнен ДНК, чем супернатант. Важно также то, что рас- -О пределение целевого продукта междуосадком и супернатантом при осаждении стрептомицинсульфатом остается, как. было обнаружено, практически постоянным (85-963 целевого продукта остается в супернатанте) в широкям диапазоне концентраций стрептомицинсульфата.То есть не требуется строгого подбораконцентраций последнего, что необходимо в способе - прототипе.30 бсодержащего 3 г Ь-триптофана и 3 гцистеина. Через 120 мин инфицированную культуру охлаждают до 15 оС и со" бирают клеточную биомассу центрифугированием в проточной центрифуге со скоростью 60 л в час. Бактериальную пасту замораживают в жидком азоте без промывания. Из 165 л. культуры получают 540 г биомассы клеток Е.со 1 ь В, инфицированных бактериофагом Т 4 аш Р 82Для размножения бактериофага Т 4 аш Р 82 на клетках СКиспользуют среду, аналогичную среде для инфекции,клеток В 23. Клетки Е.со 1 СКвыращивают в л ростовой среды до концентрации 2109 клеток в 1 мл среды и заражают бактериофагом Т 4 аш Р 82 с множественностью 0,1 Фаговая частица на клетку при температурео37 С. Через б ч концентрация фаговых частиц составляет 5 х 10" в мл среды, что позволяет инфицировать 150 л культуры клеток Е.со 1 В 23 простым добав лением 15 л Фаголизата без предварительного концентрирования фаговых частиц.11. Получение клеточного экстракта.Для получения клеточного экстракта оттаивают 100 г клеточной пасты, доводят до 300 мл 0,05 м калийфосфатным буфером рН 7,0, с 10 мм - меркаптоэтанолом, Гомогенизуют в ножевом размельчителе тканей РТза 30 с при 8000 об/мин. Клетки разрушают в процессе Френча при давлении 500 кг/см, пропуская дважп;д. Добавляют еще 250 мл 0,05 калийфосфатного буфера с 10 мм меркаптоэталоном и осаждают обломки клеток центрифугированием (здесь и далее все центрифугирования проводят на центрифуге ЛС "Вес 1 сшап" США 30 мин при 10000 я при 4 С). Получают 550 мл экстракта.Далее все операции очистки целевого продукта проводят при 4 С.111. Осаждение ДНК стрептомицинсульфатом.К 550 мл клеточного экстракта добавляют за 30 мин при перемешивании а магнитной мешалке 100 мл 123 растора стрептомицинсульфата, который готовят непосредственно перед употеблением. Через 45 мин отделяют осаок центрифугированием. В супернатане остается около 952 ДНК-полимеразы актериофага Т 4.Благодаря такому осаждению ДНК трептомицинсульфатом отпала необхо 511470Вследствие вышеуказанных причинотпадает необходимость в проведенииавтолиза (упрощается процесс), а так"же значительно увеличивается выходцелевого продукта с более высокой5удельной активностью.Кроме того, предложение изменитьпоследовательность хроматографической очистки; сйачала очищать от нукФлеиновых кислот, затем от белкаобеспечивает повышение выхода целевого продукта. Это объясняется.тем,что удается максимально очиститься от. остатков нуклеиновых кислот, которыемешают ионообменной хроматографиибелков.Заявляемый способ включает следую, щие операции.1. Получение биомассы клеток Е.со 1 д В, инфицированных бактериофагом Т 4.2. Вскрытие клеток.Операции 1-2 - получение клеточного экстракта, 253. Действие на клеточный экстрактстрептомицинсульфатом - осаждениеДНК.Использование супернатанта для извлечения целевого продукта,4, Фракционирование белков суль 30Фатом аммония.5. Очистка целевого продукта "путем колоночной хроматографии: сначалаот остатков нуклеиновых кислот, потомот белков. 35Способ подтверждается следующимипримерами.1, Получение биомассы клеток Е,со 13. В, зараженных бактериофагомТ 4 аш Р 82. 40Для получения биомассы клеток Е.со 1 В, инфицированных бактерио: Фагом Т 4 аш Р 82 (мутант, сохранивший все функции, кроме,.способностилизировать клетки Е.со 1 х В), используют модифицированную среду М 9:.лабораторном Ферментере емкостью250 л до концентрации 1 х 10 клеток в р1 мл среды и заражают фагом Т 4 аш 55 дР 82 с множественностью 5 фаговыхтчастиц на клетку при температуре б,37 С, Перед внесением Фаговых частицв ферментер заливают 300 мл раствора, . с114димость в проведении автолиэа и удалось почти без потерь очистить ДНКполимераэу бактериофага Т 4 от значительной части ДНК.1 Ч. Фракционирование белков суль-,Фатом аммонияК фракции 111 добавляют при перемешивании эа 30 мин сульфат аммонияиз расчета: (Г 1 Н)801 1,гД =0,218 г/МЯъЧ 1 мл . Через 20 мнн отделяют осадокцентрифугированием и к супернатантудобавляют за 30 мин при перемешивании сульфат аммония из расчета;(ГЗН)80 121 = 0,078( г/мпДкЧ 1 мл. Через 45 мин отбирают осадок центрифугированием и ресуспендируют в 40 мл0,02 м калийфосфатного буфера рН 6,2с 2 мм ЗДТА и 10 мм Р-меркаптоэтанолом (буфер А) и диализуют 16 ч против5 л буфера А (а супернатант досали- "вают до 707. сульфатом аммония и используют для выделения ДНК - полимеразы 1).Ч. Хроматография на ДЭАЭ целлолоэе - от нуклеиновых кислот и некото рых белкова, Колонку с ДЗАЭ целлюлозой(6 см х 15 см) уравновешивают буйером А. Наносят отдиализованную фрак цию 1 Ч и смывают белок линейным градиентом от 0,02 до 0,3 м калийфосфатным буфером А (800 мл) со скоростью120 мл/ч. Собирают все активные фракции ДНК - полимеразы бактериофага Т 4,концентрируют высаливанием 707 сульФатом аммония, переводят в 15 мл0,05 м И-ацетатного буфера рН 5,8с 2 м ЗДТА и 10 мм ф-меркаптоэтанолом (буфер Б) и диализуют 12 ч против5 л буйера Б,б. Хроматографическая очистка отостатков нуклеиновых кислот на сефакрил С Колонку с сейакрилом С(9,5 см х 110 см) уравновешивают буфером Б и наносят отдиализованнуюФракцию Ча. Элюируют белки буфером Бсо скоростью 60 мл/ч. Активная йракция ДНК-полимераэы бактериофага Т 4выходит при элюции примерно 400 млбуфера Б, а остатки нуклеиновых кислот при этих условиях связываются с .. сефакрилом и смываются элюцией 0,1 мГ 1 аС 1. Собирают все активные ФракцииДНК-полимеразы бактериофага Т 4, диалиэуют эа 12 ч против 10 л буфера А(со сменой буфера через каждые 4 ч).На стадиях 111-Ча удалось значительно освободиться от остатков нук-7030 8леиновых кислот А 280 (А 260 меняетсяот 0,65 во фракции 1 Ч до 2,26 в Ч 1Фракции), сохранив почти без потерьактивность ДНК-полимеразы бактериофага Т 4.в. Ионообменная хроматография белков на карбоксиметилсефадекс Г Колонлу фс карбоксиметилсефадексомГ(4,5 см х 30 см) уравновешиваютбуфером А и наносят отдиализованнуюфракцию Чб. Со скоростью 120 мл/чэлюируют 800 мл линейного градиентабуфера Аот 0,02 до 0,25 м калийфосфатного буфера. фракции; содержаниеДНК-полимеразную активность, концентрируют диализом против 503 раствораполиэтиленгликоля (Г 1,В.20000) и диализуют 12 ч против 5 л 0,05 м трисНС 1 буфера рН 8,0 с 2 мм ЗДТА и 10 мм5-иеркаптоэтанолом (буфер В). Последиалиэа добавляли Г 1 аС 1 до 0,05 м.. на этой стадии является на 953 гомогенной (из данных по электрофорезу вполиакриламидном геле).г. Дополнительная гель"Фильтрацияна сефакрил С- очистка от белковКолонку после стадии Чб промываютЗ 0 и уравновешивают буфером В с 0,05 мГ 1 аС 1. фракцию Чв наносят и элюируютэтим же буфером со скоростью 60 мл/ч.Фракции с полимеразной активностьюбольые 200 единиц активности в мл5 концентрируют диализом против 507 раствора полиэтиленгликоля (И.В. 20000),диализуют к 507 глицерину с 0,05 мтрис-НС 1 буфером рН 7,5 с 0,1 м(МН) 80 и 10 мм 5 -меркаптоэтаноломЩ и хранят при -20 С,Электрофореэ в полиакриламидномгеле дает единственную полосу, соответствующую ДНК - полимеразе бакте риойага Т 4. Загрязнений остатками5 нуклеиновых кислот не обнаружено.Таким образом, заявляемый способпо отношению к прототипу обладаетследующими преимуществами:1. Повышаетсявыход целевого про- .щ дукта при сохранении его высокойудельной активности (64 Ж), В литера,туре и практике не известно ни одного.способа получения ДНК - полимеразыбактериофага Т 4 в клетке со столь высоким выходом.2. Упрощается процесс за счет устранения операции автолизаК дополнительным преимуществам ;Редактор Е.Гиринская Техред Л,Олийнык Корректор М.Самборская Заказ 2434 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Иосква, Ж, Раущская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 9 1147030 10чают в 1,3 раза больше биомассы кле- ния концентрированного фаголизата и ток Е.со 1 д, инфицируемых бактериофа- на отечественных реактивах,гом Т 4, без предварительного получе