Способ выявления ингибиторов синтеза стеринов микробного происхождения

(Я)5 С 12 Р ЗЗ/00 Т ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР П ИГРАНИ Е ИЗС)Б К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ 1(72) Н. С, Егоров, Н. С. Ландау, Н.А. Баранова, В. Г. Крейер, С. Н. Выборных и Л, И, Буяк (56) М. Кцгоба апб А, Епбо "пЫЬЮоп оЮи чего сйоевшего зупйез 1 з Ьу 1 атту ас 1 бз" ВосЬев. Вормуз, АстаЛ 6, 1977, 70 - 81.чч. ЙоЫп, В.,азрег Тгапзв 1 зз 1 оп" е 1 ес 1 гоп в 1 сгозсоруапб 1 ввцпосутос 1)ев 1 са зсцбез оТ уеазс апа 1 уз 1 з о 1 НМО-СоА гебцс 1 азе очегргобцсс 1 оп Ьу е 1 ессгоп . в 1 сгозсору", Мей. СеП. В 1 о 1., 318 ап 01 едо , ей;, 1989, 473 - 512.Вецга й., МцгаКава 8., Епбо А. "Огоюгй 1 пЫЬШоп оЮ уеазй Ьу соврасбп (М 1:236) . апа 1 одцез, ТЬе оцгпа оУАПМЫобсз, 41 Ь 8, 1148 - 1150, 1988.(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ СИНТЕЗА СТЕРИНОВ МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и бидтехнологии и представляет собой способ быстрого и эфФективного скрининга микробных метаболитов, обладающих ингибирующим действием на образование стеринов животными и микробными клетками.Задача выявления продуцентов ингибиторов синтеза стеринов, в частности холестерина, имеет важное практическое значение в связи с Разработкой способа получения отечественных гиполипиденимических препаратов, применяемых для лечения атеросклероза,(57) Использование: микробиологическая и медицинская промышленность, биотехнология. Сущность изобретения, испытуемый микроорганизм-продуцент культивируют в жидкой питательной среде, культуральную жидкость фильтруют и фильтрат экстрагируют этилацетатом. Тест-культуру дрожжи ЙЬобогопПа дцбп 1 з ВКПМ Узасевают в жидкую среду, содержащую ловастатин или этилацетатный экстракт, и выращивают в условиях умеренной аэрации при 22 - 24 С. Выросшие дрожжи отделяют.и переносят в свежую питательную среду, содержащую 0,5 - 1,0 мкг/мл нистатина или амфотерицина. Наличие ингибиторов синтеза стеринов определяют по достоверному приросту биомассы дрожжей, Способ позволяет выявить в культуральной жидкости микроорганизма-продуцента ингибитор синтеза стеринов различной химической природы даже в присутствии других функциональных и фунгистатических веществ, 4 табл. 5 ил. Способ позволяет определить наличие в культуральной жидкости микроорганизмапродуцента ингибитор синтеза стеринов О различной химической природы даже в присутствии других фунгицидных и фунгистатических веществ, так как последние не а затрагивают синтез стеринов.Теоретической предпосылкой предлагаемого решения является способность полиеновых антибиотиков, в том числе нистатина и амфотерицина В, взаимодействовать со стерйнами клеточных мембран грибов и дрожжей, что приводит к наруше3 1813785 ю 4нию их проницаемости, потере клетками К+ Выявление ингибиторов синтеза стерйи их гибели, нов в культуральной жидкости микромицеВ связи с этим предлагаемый способ тов - предлагаемых продуцентов этихвыявления ингибиторов синтеза стериновсоединений включает в себя следующиепри наличии в культуральной жидкости мик процедуры. Микромицеты (АзрегдПцз зр.,роорганизмов нескольких веществ фунги- РепсШ 1 шпзр,иМисогзр.),предполагаемыестатического и фунгицидного действия .продуценты ингибиторов синтеза стеринов,основывается на выявлении устойчивости к выращивают на скошенном сусле-агаре вполиеновымантибиотикамучувствительно- течение 10 - 14 дней, затем мицелий сого к ингибиторам синтеза холестерина 10. спорами переносят в качалочные колбы соштамма дрожжей КЬоботогц 1 а гоЬга ВКПМ средой известного состава и выращивают вУпосле выращивания их в среде с ин- течение двух дней.гибиторами синтеза стеринов, возникаю- Полученный мицелий используют в кащей в результате предварительного честве посевного:материала и проводятвыращивания дрожжей с ингибиторами 15 культивирование микромицетов в качалочсинтеза стеринов микробного происхожде- ных колбах при 28 С в ферментационной,йия. . среде определенного состава в течение сеПри проведении модельных экспери-ми дней.ментов способ включает выращивание чув-Мицелий отделяют фильтрованием иствительных к ингибиторам дрожжей К 1. 20 гидрофобные вещества из подкисленной догцЬга ВКПМ Уна йзвестной среде, со- " рН 3-4 культуральной жидкости извлекаютдержащей глюкозу 0,5 О, "Уеаз 1 пЫгодеп,этилацетатом, упаривают и остаток испольЬазе" фирмы Дифко 0,67% с добавлением зуютдля определения. наличия ийгибиторовийгибитора синтеза стеринов - ловастатина синтеза стеринов, испдльзуют для этого вв концентрациях 0,5 - 1,0 мкг/мл (в контра качестве тест-организма В. гцЬга.ВКПМ Уле ловастатина нет), при рН 5,3 в условиях1337, в два этапа,умеренной аэрации на качалке йри 22 - .На первом этапе посевной материал24 ОС, Затем на.втором этапе выросшие дрожжейвыращиваютнаскошеннойсреде,клетки культивируютв свежей средетогокесодержащей 0,67 "В 1 годер аа 1 по асбсостава с добавлением нистатина или амфо Ьазе" фирмы "О 1 со", 0,56 глюкозы и 1,56терицина В в концентрации 0,5-1,0 мкг/мл. агар-агар, рН 5,3 при комнатной температуКультивирование осуществляют в тех же ус- ре(23-25 С)в течение 48 ч, Клетки отмываловиях, что и на первом этапе. Рост клетокютстерильнымфизиологическим раствором,дрожжей в присутствии полиеновых анти- -: и вносят вопьтныесреды из расчета М 10:биотиков оценивают по приросту оптиче кл/мл. Выращивание проводят глубиннымской плотности нафотоэлектрокалориметреспособом, на качалке при 25 ОС. В опытныепри 530 нм,:, .., , варианты вносят по 100,200 и 300 мкл этиКак видно из результатов, приведейных: - лацетатногоэкстракта из культуральнойв табл, 1, дрожжи, вйращеннйе в присутст- ":.жидкости микромицета. Ингибирование ровии ингибитора синтеза стеринов(ловаста ста дрожжей оценивают по оптическойтина), приобретают устойчивость к плотности при 530 нмпо сравнению с контполиеновым антибиотикам (нистатину и ам- ролем (рост дрожжей без испытуемого вефотерицину В, т. е. в их присутствии наблю-щества),дается достаточно интенсивный рост На втором этапе определяют степеньдрожжей в отличие от контроля и прототипа, 45 устойчивости дрожжей, выращенных в срегдеростпрактическиотсутствует. де с испытуемым веществом, к нистатинуПредлагаемый способ позволяет выя- так, как описано в примере 1.вить наличие ингибиторов синтеза стеринов .: Результаты табл,3 показывают, что возв культуральной жидкости продуцента даже можны три. варианта. 1. Когда микромицетв случае образования им нескольких соеди выделяет в среду ингибиторы синтеза стенений фунгистатического и фунгицидного ринов,определяемые поподавлениюростадействия, тест-организма на первом этапе и усилениюего роста на втором этапе (в присутствииТак, клетки, выросшие в присутствии по- нистатина). 2. Когда микромицет не образувастатина и нистатина одновременно, по ет ингибиторы синтеза стеринов, что видносле выращивания их на втором этапе, в по отсутствию подавления роста тест-оргабреде с одним нистатином приобретают ус- низма на первом этапе и отсутствию ростатойчивость к последнему. Как показывают на втором этапеданные табл. 2, рост наблюдается только у 3. Когда микромицет образует вещестопытных клеток, ва, ингибирующие рост тест-организма нвпервом этапе, но не являющиеся ингибиторами синтеза стеринов, что видно из отсутствия роста тест-организма на втором этапе в присутствии нистатина. (табл. 3),П р и м е р 1. Дрожжи ВЬ, гцЬга ВКПМ 5 У, выращенные на сусло-агаре, высевают в жидкую среду, содержащую глюкозу 0.5, "Уеазт п 1 сгооеп Ьазе" фирмы Дифко 0,67 ф, с добавлением ловастатина 0,5 мкг/мл(в контроле ловастатина нет), рН 5,3, 10 Культивирование проводят в пробирках объемом 20 мл с 3 мл среды на качалке (100 - 120 об/мин) при 23 С в течение 48 ч.Клетки стерильно отделяют от среды центрифугированием (3 тыс, об/мин) в течение 15 10 мин отмывают стерильным физиологическим раствором и переносят в свежую среду того же состава с добавлением нистатина 0,5 мкг/мл и через 30 ч культивирования оценивают рост клеток дрожжей при опти ческой плотности на фотоэлектроколориметре при 530 нм, Клетки, выращенные на среде с ловастатином, оказываются более устойчивыми к нистатину в концентрации 0,5 мкг/мл (фиг, 1)., 25П р и м е р 2, Дрожжи выращивают, как описано в примере 1, но с добавлением в среду на первом этапе 160 мкг/мл ловаста, тина (в контроле ловастатина нет), а на втором этапе - 1,0 мкг/мл нистатина. По сле 30, 50 и 58 ч культивирования дрожжей на втором этапе оценивают рост клеток по оптической плотности на фотоэлектроколориметре при 530 нм, Клетки, выращенные на среде с 1,0 мкг/мл ловастатина, из-эа 35 сниженного под его воздействием содержания эргостерина в мембранах клеток оказываются устойчивыми к 1,0 мкг/мл нистатина (фиг. 2).П р и м е р 3, Дрожжи выращивают, как 40 описано в примере 1, но с добавлением на втором этапе вместо нистатина амфотерицина 0,5 мкг/мл, после чего рост клеток через 60 ч культивирования оценивают по оптической плотности на фотоэлектроко лориметре при 530 нм. Клетки, выращенные с 1,0 мкг/мл ловастатина, устойчивы к амфотерицину в испытанной концентрации (фиг, 3).Пример 4.Дрожживыращивают,как 50 описано в примере 1, но с добавлением на первом этапе 1,0 мкг/мл ловастатина(в контроле ловастатина нет), а на .втором этапе 1,0 мкг/мл амфотерицина, после чего оценивают рост через 72 ч культивирования по 55 оптической плотности на фотозлектроколориметре при 530 нм, Клетки, выращенные на среде с добавлением 1,0 мкг/мл ловастатина, устойчивы к 1,0 мкг/мл амфотерицина (фиг, 4). П р и м е р 5. Дрожжи выращивают, как описано в примере 1, но с добавлением на первом этапе одновременно с ловастатином (0,5 мкг/мл) нистатина (0,1 мкг/мл), а на втором этапе с добавлением 2,0 мкг/мл нистатина, после чего оценивают рост клеток через 74 - 82 ч культивирования по оптической плотности на фотоэлектроколориметре при 530 нм. Дрожжи, выросшие на среде с ингибитором синтеза стеринов к антибиотикам, приобретают устойчивость к полиеновым антибиотикам, в данном случае, к нистатину (фиг. 5).П р и м е р 6. Дрожжи выращивают, как описано в примере 1, но с добавлением на первом этапе вмесго ловастатина по 200 и 300 мкл этилацетатного экстракта из культу- ральной жидкости АзрегцШоз зр.Ингибирование роста дрожжей оценивают по изменению оптической плотности при 530 нм на фотоэлектроколориметре по сравнению с контролеь 1 (рост дрожжей без добавления в среду испытуемого вещества).На втором этапе определяют степень устойчивости дрожжей, выращенных в среде с испытуемым веществом, к нистатину, как описано в примере 1. Результаты табл.4 показывают, что этилацетатный экстракт из культуральной жидкости Азрег 9111 цз зр. ингибирует рост дрожжей в количестве 200и 300 мкл и при этом дрожжи приобретают, устойчивость к нистатину, что указывает на наличие в этилацетатном экстракте гриба ингибитора биосинтеза стеринов (табл. 4) Формула изобретения Способ выявления ингибиторов синтеза. стеринов микробного происхождения, включающий выращивание тест-культуры дрожжей в жидкой питательной среде в присутствии ингибитора синтеза стеринов с последующим определением количества биомассы дрожжей, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения селективности способа, предварительно культивируют микроорганизм-продуцент ингибиторов синтеза стеринов, полученную культуральную жидкость фильтруют и фильтрат экстрагируют атил ацетатом, в качестве тест-культуры дрожжей используют штамм ВЬоботогиИа гоЬга ВКПМ У, выращивание осуществляют в условиях умеренной аэрации при 22 - 24 С, при этом в качестве ингибитора синтеза стеринов в питательную среду вводят этилацетатный экстракт, выросшие дрожжи отделяют, переносят в свежую питательную среду с добавлением нистатина или амфотерицина в концентрации 0,5 - 1,0 мкг/мл, проводят культивирование в тех же условиях и выявляют наличие1813785 ингибиторов синтеза стеринов в продуктах метаболизма микроорганизма-продуцента Таблица 1 Устойчивость к полиеновым антибиотикам дрожжей Вп. гцЬга ВКПМ У,выращенных в среде с ловастатином.абл антибиотикам дрожжей ВЬ. гцЬга ВКПМ У среде с ловастатином и нистатином. Устойчивость к полиеновы выращенных. по достоверному приросту биомассы дрожжей.101813785Таблица 3Рост дрожжей ВЬ, гоЬга ВКПМ Ув среде с этилацетатнцми экстрактами микромицетов и чувствительность дрожжей к нистатину. ица 4зрего оэ зр.Рост дрожжей ВЬ. гоЬга ВКП 4 Ув среде с этилацетатнцм экстрактдми изменение чувствительности дрожжей к нистатину.1813785 7 дч. 7 Ъ Авшие, Ф СЬ Фиг.Х Составитель Н. Егоров улакова Техред М,Моргентал: Корректор С. Юско Редакто дственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Прои Заказ 1812 Тираж Подписное 8 НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рэушская наб., 4/5