Способ отбора регуляторных мутантов фотосинтезирующих микроводорослей и штамм водоросли снlоrеllа sp-продуцент углеводов

СОЮЗ СОВЕТСКИХЮФМЗЮеесяижРЕСПУБЛИК 09) (И ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ ВУ МУ С 8 ИДЕТЕЛ КА 6 2 Бюл .изиолева гии рзстеции, А,11 йт нко СС 78 ельст 15/00 ви 12 Е М ханизмы эндоген нтеза и адаптив аста. В кц.: ФиМ., 1982.елки одноклеточ с нт.А ОтоносИзоб к с ел екции ть испольтоавтотротение относитсярослей и можетбиотехнологии А микровоэованоных био интез Цельюние эдх мутантов водоросл способно рата и п На фиг. 1 ссии карбо алогом глю ровець репактивцости ображец гидр аз нон эы; на фи сиц ее выс ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ПЮТ СССР(56) Авторское У 627163, кл. С Семененко В. ной регуляции ф ные свойства хл зиология фотоси Покровский А(54) СПОСОБ ОТБОРА РЕГУЛЯТОРНЫХТАНТОВ ФОТОСИНТЕЗИРУМ 11 ИХ МИКРОВОРОСЛЕЙ И 111 ТАММ ВОДОРОСЛИ .СН 1,ОКЕ 1.ЗР. - ПРОДУЦЕНТ УГЛЕВОДОВ(57) Изобретение относится к селции микроводорослей и может бытьпольэовано в биотехнологии фотоатрофных биосинтезов, в частностиполучению углеводов. Целью изобртения является повышение эфбе.;ти изобретения является повьппетивности отбора регуляторныхфотосинтезирующих микрой с повьппенной продуцирующейтью фотосинтетического аппалучение штамма, обладающегооким синтезом углеводов. 1)5 С 12 М 15/01, 1/1 .; А О 1 С 33/ОО, С 1 . Р 19/04 ти отбора регуляторных мутантов фотосинтезирующих микроводорослей с повышенной продуцирующей способностьюфотосинтетического аппарата и получение штамма, обладающего более высокимсинтезом углеводов. Способ заключается в том, что проводят последовательное проведение двух этапов селекциимикроводорослей и выращивание колонийна питательной среде с добавлениемнеутилиэируемого клеткой аналога глюкозы 2-дезокси-Л-глюкозы (2 дДГ) вколичестве, полностью подавляющсмрост исходной культуры, и культивирование всех полученных на 1-м этапереэистентных к селективному агентумутацтцых клонов на среде, содержащей глюкозу, в темноте. В результатеданного способа получен новый штаммводоросли СЛ 1 оге 11 а зр. С, депонированный в коллекции микроводорослей Института физиологии растенийим. К.А,Тимирязева. Полученный штаммсинтезируют до 607 углеводородов,2 с.п.ф-лы, 2 ил., 5 табл. Сверхпродукция фотосинтеза в данном случае является следствием нарушений регуляторного механизма, действующего по принципу отрицательной обратной связи, где роль эМектора выполняет один из конечных продуктов фотосинтеза - глюкоза.углеводов иэвестныи штаммом и штаммомСЫоге 11 а вр. СКЯ2 дДГя,езСпособ предусматривает последова- .тельное проведение двух этапов селек 5ции микроводорослей: выращивание колоний на питательной среде с добавлением неутилиэируемого клеткой аналогаглюкозы (2-деэокси -Д-глюкозы, 2 дДГ)в количестве, полностью подавляющемрост исходной культуры, и культивирование всех полученных на первом этапе резистентньм к селективному агентумутантных клонов на среде, содержащейглюкозу, в темноте. 15Известный из практики селекциимикроорганизмов прием отбора мутантовс нарушениями механизма регуляцииПродуктивности некоторых Ферментовглюкозой, состоящий в выращиваниикультур на питательной среде с 2 дДГ,обычно приводит к получению достаточно широкого спектра мутантных Зории нуждается в последующем длительномотборе клонов с целевьвчи свойствами. 25Учитывая то, что у фотосинтезирующих микроводорослей рост колонии на2 дЛГ может быть обусловлен в основном двумя причинаии - нарушением регуляции уровня фотосинтеза и мутациямипо белку - переносчику глюкозы, длямассового "отсева" второй группы мутантов (нерегуляторного характера)в предложенном способе клоны, реэиатентные к 2 дДГ, сразу переносят напитательную среду с глюкозой (1 Х),инкубируют их в течение 3-5 сут втемноте.Благодаря введению второго этапаселекции, представляющего собой до Остаточно простую и нетрудоемкую процедуру, удается добиться существенного роста эффективности отбора регуляторных мутантов с повышенным уров"нем продукции фотосинтезирующего аппарата, а имйнно, более 803 полученных предложенным способом клонов демонстрируют ту или иную степень сверхпродукции фотосинтеза.Иэ отобранных новым методом иутан Отов получают соответствующие мутантные штаммы хлореллы, в т.ч. и штаммСЬ 1 оге 11 а вр, " продуцент углеводов.Вновь полученному штамму присвоили номер СКВ 03-2 дДГ . 1 Вгамм депоЯеь55нирован в коллекции одноклеточныхводорослей Института Физиологии растений им. К.А,Тимирязева под ноиерои С. Морфологические признаки штамма, Темно-зеленые клетки с гладкой поверхностью, шаровидной формы, на агаризованной среде Тамийя, размер клеток равен 4,5-5 мкм. Клетка содержит небольшое ядро и крупный чашеобразный хлоропласт. Размножение вегетативное.физиологические признаки. Оптимальньии условиями для выращивания является среда Тамийя, в качестве источника углерода использует углекислый газ, бикарбонат, гаэовоздушную смесь, содержащую 1,5-2 углекислого газа, в качестве источника азота - мочевину, рост при 35-37 С.Отношение к освещенности. Требует круглосуточного освещения.При описанных условиях накопление биомассы составляет 3, 1 мг/мл, скорость роста составляет 28010 кл./ил, при этом получают биомассу следующего состава,: белок 50; углеводы 15,5; липиды 15.При культивировании штамма на среде Тамийя нли на среде Тамийя без источника азота при рН среды 6,3, температуре 42 С, круглосуточном освещеонии 40 Вт/и получают биомассу, содержащую 60 углеводов, Штамм устойчив к контаминации, агглютинации и автолиза не наблюдается, имеет маркерныйпризнак - рост на среде с 2 дДГ и глюкозой (в темноте).Штамм поддерживают на агаризованной среде Тамийя при 27-28 С, освещенности 4 эрг/си . Хранят при 1012 С, освещенности 0,4 эрг/см .П р и и е р 1. Суспенэию клеток СЫ.оге 11 а вр. К с концентрацией 2 х х 10 кл./мл наносят на агаризованную среду Тамийя с добавлением 0,25- 0,52 дДГ, которая полностью подавляет рост исходной культуры, и равномерно распределяют по поверхности шпателем. Такой же гаэоновый засев делают на контрольной чашке, те. без2 дДГ. Появившиеся на опьггной чашке колонии рассевают на агариэованную питательную среду Тамийя с глюкозой(1 Х) и помещают в темноту в териостатпри 36 С. Колонии, растущие в этихоусловиях в течение 3-5 сут, анализируют затем на способность к накоплению продуктов фотосинтеза.В данном случае иэ 11 реэнстентньм к 2 дДГ мутантов лишь 7 обладают способностью расти в темноте на среде с глюкозойе(65433 геой ижеерин Данные роста резистентных кдДГмутантов СЬ 1 оге 11 а нр, на разлпчцьхсредах приведены в табл. 1.П р и м е р 2. Для создая усло 5вий направленного синтеза уг;енодонС 11.оге 11 а вр,К полученные мутантыпомещают в сосуды для интецсинцоговыращивания на питательную среду Тамийя без азота. Барботиронание культур осуществляют газовоэдуццой смесьюс 27 СОчч, выращивание проводят при36 С. Освещение 5) Вт/м круглосуточное. Иачальная концентрация клеток н1 мл 111 х 10 15Содержание углеводов в исходнойкультуре и культурах мутацтон определяют методом Аенол-серная кисло)а.Через определенные интервал: времени отбирают 0,5-,1 мл успецэиц, Одобавляют 0,05 мл 87-ного растворафенола и 5 мл концец;риронаццой Н 8(,Оптическую плотность окрашенного раствора измеряют на Аотоэлектрок )лорметре с использованием Лильра с максимумом пропускация 490 цм,Количество углеводов рассчитываютпо градуировочной кривой, предварительно составленной по глюкозе. Полученный конечный продукт имеет следующий состав, 7.: водорастворимь)е сахара5; крахмал 80; гемицеллюпоэа 3; клетчатка 1-3.Сравнительная характеристика накопления углеводов в клетках исходного35и мутантных СЬ 1 оге 11 а СКБ 5 и С 1 оге 11 а СКБ 10, Ж 1 оге 11 а СКБ )3 /д"Г "езштаммов в условиях роста без аэотаприведена в табл. 2 и 3.П р и м е р 3. Другим Аакторо,вызывающим напранленный синтез углеводов, является экстремальная температура 43 С. Исходную культуру и мугаты выра)(ивают ца полной среде Тамияпри 36 С, при круглосуточцоь. освещении (50 Вт/м) и непрерывном барботировании газовоздушцой смесью с 27 СО,а затем переводят в условия экстремальной температуры 43 С, Содержаниеуглеводов определяют тем же мстодом, 50что и в примере 2. Результаты анализа представлены в табл. 4 и 5.П р и м е р 4. Одним из доказательств, указывающих цз то, чтс. Сп 1 оге 11 а нр.СКЯ 03 2 дДГ- регуляторный мутант с нарушенным механизмомнегативной метаболитной регуляции 1)отосинтеза на уровне экспрессии генома хлоропласта является отсутствиеч 7 6репр.ссии ац:.огс)м люк оэь (. д)Г)/ )1)ермотс, кодируемого н хл ропласт -цом гес)е - хлоропластцой карбоац -гидраэы.СЬ 1 оге 11). нр, К и мутат культивируют н .,слониях интенсивной культуры при постояцом освещении и непрерьвцом барботиронаци; гаэоноздушцой смесю с;.4 СО, Культуру вьра)ннают до лот,)ст -1)( и клеток н 1 мл, пдс: чего вносят стерильную . д 1 Г соцеграц) , 5. Лк гвость карбоангцдр( ч ) опр аделяьт электрометрическим етс)дг, по э:е)ню рД н процессе р) лк);) чрлтлни С . 1 оцтролем с)ул, (;еэиматцческая р еакция,1 ы, ццдс э цг. 1, при проникноне н клетк микрон одоросли 2 дДГ актиость хлоро ластой карбоацгидраэы ) .сходной )орм С)л 1 оге 11 а зр.К ропрсс цр,ется до 6 а у С 11.оге 1- 1 эр. СКЬ )3 2 дДГостается на высосо. уроннс, состянл 5 я 8. От исхс)дого значения.Так) образом, из приведенных примеров следует, что предложеццыи способ г .кцп о)еспечивает гораздо менее ) рудоемкийб) стрй, а следоватеэьцо, ц бие эЫ)ектнц,) чем н случае прототпа отбор регуляторных мутант )н с онс ццой продуцирующей способностью .эотостет)с)ского аппарата, отлчс)(хся грсэ.яде всего более высокмц нс)э)о)с)стями в плане накоп -лсця клстках уг:еводон.В част:ост, благодаря цсцольэонацю г:рслагас;с)го спс)соб получен штамм С 11 и ге 11з р, СЕБ )3 2 дД 1,рез прод, цент углеводов.Примеение эобретсця в биотехцолог ц ЛотоснтотроАьд биосицтезов поэно.цт пол) ать более н:сокие выходы про;уктон сотс)стеэа - полисахаридон (крахмл,) с единицы суспенэии, а также использовать данные мутанты для исследования молекулярных механизмов регуляции экспрессий генома хлоропласта и для конструирования нон,х продуцецтов ца основе методов формула изобретения 1, Способ отбора регуляторцых мутацтон Аотс)синтезирую)их ькроводорос - лейнключающии вьра(наше культур н присутствии селективцого агента 2-дезокси-Д-глюкозы н каццстрани,1654337 полностью подавляющей рост исходной культуры, о т л н ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения эдМективности отбора регуляторных мутантов5 с повыценной продуцирующей способностью фотосинтетического аппарата, поТ а б л и ц а 1 Сгеда Глюкоза (17) Тамийя + 2 дПГ(0,57) Тами йя вет Темнота Т а б л и ц а 2 Штамм Содержание углеводов, мг/мл,эа время инкубации, ч Прирост за44 ч О 22 44 СЬ 1 оге 11 а зр.КСЬ 1 оге 11 а вр.С 08 5СЬ 1 оге 11 а вр,С 08 10 0,145 0,142 О, 134 О,4 )4 О,442 ),437,), 661 Таблица 3 С, держание углеводовфмг/мл, за время инкубации, ч Прирост за 64 ч 1 0 16 64 О, 148 О, 3900,133 0,314 0,390 О,242 О,604 0,471 СЬ 1 оге 11 а вр. КСЬ 1 оге 11 а зр.С 08 03 2 дЛГв СЬ 1 оге 11 а вр. (2 дДГ )168 вр. С 08 ОЗ.вр. СТ вр, СТ зр. С 08 2вр. С 08-3вр, С 08-4вр. С 08-5зре СТ вр. СТ вр. С 08 10врС 08 УЧ СЬ 1 оге 11 а СЬ 1 оге 11 а СЫоге 11 а СЬ 1 оге 11 а СЬ 1 оге 11 а СЫоге 11 а СЬ 1 оге 11 а СЫоге 11 а СЬ 1 оге 11 а СЬ 1 оге 11 а СЫоге 11 а лученные резистентные к селективному агенту клоны подвергают вторичной селекции на питательной среде с глюкозой в темноте.2, Штамм водоросли СЬ 1 оге 1)а вр. КВИФР 9 С- прадуцент углеводов., 405 0,195 без юЬД 4 ыг. 1 П ксходная куфтуРф3 цутаит СЬ 1 оге 11 а зр. КСЬ 1 оге 11 а зр.СК 8 2СЬ 1 оге 11 а зр,СКЯ 3СЬ 1 оге 11 а зр.СКЯ 4 Число клетокВес сухой массы,мг/млВес клетки, мгКоличество углеводов, мг/10 кл. О, 149 О, 131 0,125 Оф 140 О, 2630,27 Л ),8 О О, 290 0,358 ), 35) ), 37) О, 385 Та блица 4 0,567 ,), 450 0,600 Таблица 5