Способ получения полидезоксинуклеотидов

(1)Я. Кл. С 07 Н 1916 Ф :А 01 К 49/00 Гееудереткнай квинтет ссйр ее делен нзебретеней н етнрцтна(72) Авторы изобретения нститут цитологии и генетики Сибирского отАН СССР) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДО Изобретениеованному способинуклеотидов,генетике. осится к усовершенстполучения полидезокпользуемых в биохими Н.в- Г= 0Ог ф Известен способ получения полидезоксннуклеотндов путем конденсации в пиридине нуклеозидного (нуклеозид-Ы- хлорфенил-О-цианэтилфосфата) и нукле 1 отидного (5 -О-диметокситритил-0 хлорфенилфосфата нуклеотида) компонентов в присутствии арилсульфотетразолидов (например, толуолсульфотетразолида) ,и обработки продукта реакции кислотой (о - голуолсульфокислотой) или трвэтиламином или последовательной обработки кислотой и триэтиламином. Выход . поли. дезоксинуклеотидов в расчете на исходный мономер составляет лв 3%, Выделение промежуточных и целевого продуктов осуществляют хроматографией Ш .Недостатками известного: способа п лучения являются низкий выход целевого продукта и необходимость вьщеления промежуточных и целевого продуктовхроматографией, что усложняет процесс,Цель изобретения - увеличение выхода целевого продукта и упрощениепроцесса.е Поставленная цель достигается тем,что согласю способу получения полидезоксинуклеотидов путем конденсации внирндине нуклеозидного и нуклеотидногокомпонентов в присутствии арилсульфо Отетразолидов и обработки продукта коюденсацин кислотой или триэтиламиномили последовательной обработки кислотой н триэтиламином с последующим выделением целевого продукта в качестве 5нуклеозидного и нуклеотидного комюнентов в реакции конденсации используют2-дезоксинуклеотиды общей формулыВ,ОСй 0 Вгде В - остаток тимина, йч - анизоилцитозина,- бензоиладенина, 86 аиэобутир илгу анина;й, - Н, при - диметокситритил;К - Н, 2-цианэтил, 5до. обработки продукта конденсации кислотой или триэтиламином продукт конденсации выделяют экстракцией хлороформом или смесью хлороформ-метанол (7:3)с последующим снятием тиометильной эа ощиты концентрированным аммиаком при(153 мг, 0,2 ммоль) и Р -изобутирилдеэоксйгуаноэин-О-цианэтнл- .метилтиофосфат (128 мг, 0,2 ммоль)растворяют и сухом пиридине (20 мл)и упаривают в вакууме на ротациоищтиспарителе до 2 мл, Добавляют 100,8 мг д(0,4 ммоль) мезитиленсульфотетразилидаи оставлявг при 20 С на 1 ч. К реакционной пиесе прибеиппют 20 ып смесиюютонитрип-триетипеиин (1: 1 и ) ичпегревпют 10 иип при 50 еС. уперииеютв вакууме досуха, остаток растворяютв хлороформе (20 мл), хлороформныйраствор промывают водой (10 мл ХЗ),затем фильтруют через безводный сульфат натрия и упаривают досуха. Получают вещество 1. Вещество гомогеннопри тонкослойной хроматографии в составе хлороформ: метанол (9 1"/) (система А).Измеренная суммарная плотность вещества 1 (ХОбо ) при 260 нм 685046оптических единиц (о. ед,), количествовещества Х РМ = =ф= 0,190 (ммоль). Количество вещества1 цо поглощению диметокситритильнойО, 195 ( ммоль у.Отношение количества вещества 1,измеренного по поглощенню.при 260 нм уи 500 нм М =, Й = - :-5- = 0,970.190Кбф,Эта характеристика (М), определяющаяколичество полученного вещества двумянезависимыми измерениями (ЕВ 6 о и;,1500 ) и в пределе равная 1, докаэывает состав динуклеотида 3;.Выход вещества 1 246 мг; 0,19 ммоль;.97%. 3 928964 4П р и м е р 2. Й 6-Бензоиладенозил-(3 - 5 -метилтио -) 5 )-тимидин)- 3 -0-2-циакэтил- . -метилтиофосфат (Ц), 5 -Диметокситритил- М -бензоилдезов ксиаденозин--метилтиофосфат (168 мг, 0,2 ммоль) и тимидин-Ф-2- цианэтил- Ь -метилтиофосфат (84 мг, 0,2 ммоль) растворяют в сухом пиридине (20 мл) и упаривают в вакууме до 1 мл. Добавляют мезитилен сульфотетразолид (100, 8 мг, 0,4 ммоль) и выдерживаюто при 20 С в течение 1 ч. Упаривают с толуолом (20 мл2( досуха и растворяют в хлороформе (20 мл). К охлажденному до 0 С раствору приливают охлажденный до О С 2%-ный раствор толуолсульфокислоты (20 мл) в смеси метанол-хлороформ (3:7). Через 2 мин нейтрализуют,5%- .ным водным раствором бикарбоната натрия, водный слой отделяют, органический слой промывают водой (10 мл х 2), фкпьтруют через безводный сульфат натрия и упаривают досуха. Получают соединение И (3840 о.е., 222 мг, 0,191 ммольи 98%);601960, Вещество гомогенно при тоикослойной хроматографии в системе А, Это подтверждает состав соединения П,П ф и м е р 3. 5 -ДиметокситритилМ -изобутирил-деэоксигуанилил-( М -3 -а метилтио - р д )- К -иэобутирющеэоксингуанииил-(3 -Ь-метилтио -р 5 )- М5 бенэоилдеэоксиаденоэил-(3 -5 -метилтио )-тимидин 1"М -О-цианэтил- - метилтиофосфат (Ш).Соединение 1 (6850 о.ед., 0,19 ммоль) и соединение (11) (3840 о.ед.; 0,19 ммоль) растворяют в сухом пиридине (30 мл) и упаривают в. вакууме до 2 мл. Добавляют меэитиленсульфатетраэолид ( 100,8 мг, 0,4 ммоль). и выдерживают 1 ч. при 20 С Добавляют воду (0,2 мл), выдерживают1 мин и растворяют в хлороформе (20 мл). Хлороформный раствор промывают водой (10 мл х 3), фильтруют через безводный сульфат натрия, упаривают в вакууме, затем снова упаривают с толуолом (20 мл), Сухой остаток растворяют в хлороформе (10 мл) и наносят на колонку с силикагелем (Ч = 30 мл). Элюируют в градиенте концентрации метано,ла в хлороформе (300 мл хлороформа в резервуаре и 300 мл 5%-ного-метанола в хлороформе в смесителе) Получают соединение Ш (9350 о.ед. 380 мг, 0,18 ммоль, 90%), 6 в = 5500, Вещество гомогенно при тоикослойной хроматографии на силикагеле в системе А. Отношение количеств вещества 1 И, изме5 9289ренных при 260 нм и 500 нм, М = 0,98,Это подтверждает состВав соединения Ш.П р и м е р 4. й -Бензоилдезоксиаденозил-(3 - Ь-.метилтио)-3-дибензоилдеэоксиаденозин ( 1 У). 5Конденсация 5 -0-диметокситритил 1МВ -бенэоил-дезоксиаденоэин--метилтиофосфата (78,4 мг, 0,1 ммоль) сЦб, 3 -дибенэоилдезоксиаденоэином(44,7 мг, 0,1 ммоль) и обработка реакционной смеси в условиях примера 2 дает вещество ОГ (2130 о.ед., 101 мг,0,96 ммоль, 96 Ъ) Вещество 1 Ч гомогенно при тонкослойной хроматографиина силикагеле в.системе А. 15арабо2220 о.ед. Это доказывает,состав соединения 1TП р н м е р 5. 5-0-Диметокситритилтимидилил-(3 - -метилтио -Ф 51)-Йизобутирилдезоксигуанозин"З - Ъ-метил Отиофосфат ОП.Конденсация5 -0-диметокситритилтимидин-З-метилтиафосфата (66,1 мг,О, 1 ммоль) с М -иэобутирилдезоксигуаноэин-0,2-цианэтил-метилтиофоафатом (63,8 мг, 0,1 ммоль) и обработка реакционной смеси в условиях примера 2 дает вещество м" (2560 о.ед. 104 мг 0,94 ммоль,94%). Веществомгомогенно при тонкослойной хромато Ографин на силикагеле в системе А. ОЬношение количеств вещества Ч, измеренных при 260 нм и 500 нм, М =0,97.аво 2720. Это подтверждает составсоединвния М . 35П р и м е р 6. 5-0-Диметокситри-тил-тимидилил-(3 - Ь -метилтио.+5 ) нЮ -изобутирилдизоксигуанилил-(3"-5:метилтио - 5 )- И -бензоилдезоксиаденозил-(3 - 6-метилтно-+8 )- Й, 3 - щдибензоилдезоксиаденозин (У 1).Конденсация соединения 17 (2130 о.ед., 0,096 ммоль) и соединения (7)(2560 о.ед., 0,094 ммоль) и обработкареакционной смеси в условиях прнмера3 дает соединение 71 (458 О о.ед.,0,086 ммоль, 92%). Соединение 71 гомогенно при тоикослойной хроматографиина силикагеле в системе А, Отношениеколичеств вещества Г 1, найденных при260 нм и 500 нм, М 0,98.гВВ = 4940, Это подтверждает состав соединения Ч 1,П р и м е р 7, 5 -цнметокситрнтил-.й -иэобутирилдезоксигуащлилф -- .55метилтио - 5 )- Я 2-иэобутирилдеэокси,ф) Вгуанилил-(3 - 5-метилтио -; 8 )- И1бензоилдезсксиаденозил-(3 - 3 -метилтиоф 8 )-тимидпл-(3 - ф-метвлтио)-йгД Ъ. 6яэобутирилдезоксигуанилил-(З --метилтио -5 )- й -изобутирилдезоксигуани 2.лил-(3 - -метилтио8 )- Й -бензоилдезоксиаденозил-(3 - Ь -метилтио -ю 8 )- тимидин 1-3 -0-2 цианэтил- Й-метилтиофосфат (МЦ.Вещество Ш (4678 о.ед., 0,09 ммоль) обрабатывают 10 мл смеси ацетонитрилтриэтиламин (1: Р/ч ) и нагревают 10 мин при 50 РС. Упирают в вакууме досуха, остаток растворяют в хлороформе (10 мл), хлороформный раствор промывают водой (5 мл 3) затем фильг руют через безводнь.й сульфат натрия и упаривают досуха. Получают 58 -диметокситритил-й -изобутнрилдезокси 2гуанилил-(3 - 3-метиотио -5 )- И изобутирилдезоксигуанилил-(3 - 3-метилтио-. 5 ) Я-бензоилдезоксиаденозип-(3 - Зметилтио - 5 )-тимндин -3 - Ь- метилтиофосфат (ЧШ).Вещество (Ц (4675 о.ед., 0,09 ммоль) растворяют в хлороформе (10 мл) К охлажденному .до ОфС хлороформному раствору приливают охлажденный до О С 2%- иый раствор тоауолсульфокислоты (10 мл) в смеси метанол-хлороформ (3:7 ). Через 2 мин нейтрализуют 5%-ным водным раствором бикарбоната натрии, водный слой отделяют, органический слой промывают водой (5 мл к 2), фильтруют через безводный сульфат натрия и упаривают досуха. Получают М -изобутирилдез 1 " г.т 7, оксигуанилил-(3 --метилтио)- Й изобутирилдезоксигуанилил-(3 - 3 -метилтио)- й:-бензоилдезоксиаденозил В(3 - 3 -метилтяо -+5 )-тимядин.-0-2- цианэтил- Ь-метилтиофосфат ( Х). Конденсация вещества УЦ 1 с веществом 1 Хи обработка реакционной смеси в условияхпримера 3 дает соединение Ц (7560 о,ед., 0,063 ммоль, 70%).Ь 6010800.Вещество гомогенно при тонкослойнойхроматографии на силикагеле в системеА. Отношение количеств вещества И,найденных при 260 нм и 500 нм, И= 0,95. Это подтверждает состав соединения У 11,П р и м е р 8. 5 -ДиметокситритилМ -изобутирилдезоксигуаиилкл-(3 - -метилтио)- и -иэобутирилдезокси 2,гуанилил-(3 --метклтио)-М -бенс 1 В1зоилдеэоксиаденоэил-(3 --метилтио,5 ф )-тимидил-(З - 3-метилтио)- Йфизобутирялцезоксигуанилил-(3 - 3 -метилтио)- И -изобутирилдезоксигуанилил-(3 -3 -метклтио - 5 )- Н.ензоилдезоксиаденозял-(3 --метилтио-м 5 )14 85 )-аденозил-(3 -ф 5 )-тимидил-(3 +5 )- гуанилил-(3 -+ 5 )-гуанилил-(3 -45 )- аденоэил (3-5 ) тимидилил-(3-+5 ) тимидилил-(3-+ 5 )-тимидилил (3- 5 ) гуанилил-(3 - 5 )-адеиозил-(3 - 5 )- дезоксиаденооин (ХШ). Аммиак упаривают на ротационном испарителе, добавляют к остатку 80%-ную уксусную кислоту (10 мл) и сразу же упаривают, затем к остатку добавляют воду (10 мл) и опять упаривают, получают соединение ХТ 7. Соединение Х 1 Ч хроматографируют на колонке с аминохромом (У = 200 мл). Элюцию проводят в градиенте КНРО (рН = 7) в 7 М мочевине при 40 С, Обессоливание проводят на колонке с сефадексом 6 10 ( Ч = 500 мл).Применение предложенного способа позволяет увеличить выход целевого продукта до 36% и исключить из процесса трудоемкую стадщо хроматографической очистки. Способ получения полидезоксинуклеотндов путем конденсации в пиридине нукпеоэидного и нуклеотидного компонентов в присутствии арипсульфотетразолидов и обработки продукта конденсации кислотой или триэтиламином или последовательной обработки кислотой и триэтиламином с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве нуклеозидного и нуклеотидного компонентов в реакции конденсации используют 2-деэоксинуклеотиды обшей форму- лы ВОНе О В 7 92596 тимидилил-( 3 - 8 -метилтио -+5 ) -изобути рилдезоксигуанилил-(3 - 5 метилтио5 )- тимидилил-(3 -8-метилтио )- й6 бенэоилдезокс иаднозил-( 3 - Ь -м ет илтис -ю)- Я -бензоилдеэоксиааенозил-(3-З-метилтио-.5 )- Я , 3 -дибензоилдеэ 6оксиаденоэин (Х).Соединение 1 Я (259 мг, 0,063 ммоль), обрабатывают 10 мл смеси ацетонитрилтриэтиламин (1: 1"( ) и нагревают 10 10 мин при 50 С, Упаривают в вакууме досуха, остаток растворяют в хлороформе (10 мл), хлороформный раствор промывают водой (5 мл х 3), затем фильтруют через безводный сульфат натрия и упа ривают досуха, Получают 5 -диметокситритил- М -изобутирилдезоксигуанилип- ( 33 - 3 -метилтио) -М-йэобутирилдю , оксигуанилил-(3 - 5-метилтио +5 )-ф - бензоилдезоксиаденозил-( 3 - Ь -метилтио 20 Ж )-тимидилил-(3 - 5-метилтио -5 )-1 ф-изобутирилдезоксигуанипил-(3 - в - - метилтио )- 8-изобутирипдеэоксигуа пилил-(3 - 3 -метилтио-ф 5 )- Мф -бенэоипдезоксиаденозил-(3 - 3 -метиптио ".5 )- 25 тимидин- 5 -метилтиофосфат (Х 1) (249 мг, 0,063 ммоль). Соединение 7 Х (172 мг, 0,086 ммопь) растворяют в хлороформе (10 мл), К ох 30 лажденному до СР С хлороформному раствору приливают 10 мл охлажденногодо ОбС 27 о-ного раствора толуолсульфокислоты в смеси метанол-хлороформ (3:7 /,). Через 2 мин нейтрализуют2 Ж-ным раствором бикарбоната натрия,35водный слой отделяют, органическийслой промывают водой (5 млф 2), фильтруют через безводный сульфат натрия,упаривают досуха, Получают тимндипип,(3 - -метилтио-+5 )- М -изобутирипдеэа 40 .оксигуанилил-(3 В -метилтио )- Й1б бенэоилдеэоксиаденозил-(3 -Ьметнлтио- чб )- й, 3 -дибенэоилдезоксиаденозил (Х 11) (154 мг, 0,086 ммоль).45Конденсация соединения Х 1 (259 мг,0,063 ммоль) и соединения ХП (172 мг, 0,086 ммоль) и обработка реакционной смеси в условиях /прймера 2 дает вещество Х (220 мг, 0,038 ммоль, 60%)баьо "15540. Вещество гомогенно при тон кослойной хроматографии на силикагелев системе А, Отношение количеств вещества Х, найденных при 260 нм и 500 нм, М = 0,96.Соединение Х нагревают в концентриро о ванном аммиаке (20 мл) 6 ч при 50 С. Получают 5 -диметокситритил-дезоксигуанилил-(3 - 5 )-дезоксигуанилил-(3 -ь. Фор мула изобретения ОСКАЗ - Р=О1 /Э) где В - остаток тимина, Йф -анизоилцитозина, Й -бензоиладенина, М -иэобутирил 6 3. гу анина;К - Н, п, и-диметокситритил;Й 2 - Н, 2-цианэтил,до обработки продукта конденсации кислотой или триэтиламином продукт конденсации выделяют экстракцией хлороформом или смесью хлороформ-метанол (7:3) с последующим снятием тиометильной заши