Штамм бактерий rhizobium leguminosarum-продуцент рестриктазы rle 69i

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯиг К ПАТЕНТУ Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам(71) Научно-исследовательский конструкторскотехнологический институт биологически активныхвеществ Науао-производственного объединения"Вектор"; Центральный Сибирский ботанический садСО РАН(73) Научно-исследовательский конструкторскотехнологический институт биологически активныхвеществ Научно-производственного объединения(57) Использование: биотехнология и генная инженерия Сущность изобретения использование штамма бактерий ВЬдоЬцт 1 едцп 1 гпояаплн ВНИ - ИСХМ В(69) - продуцента рестриктазы В 1 е 69 1 позволяет в 3,3 раза повысить выход целевого фермента, тем самым снизить себестоимость продукции. Штамм бактерий ВЫгоЬап 1 1 еряпловаш 1 т 1 69 продуцирует эндонуклеазу рестрикции, имеющую сайт узнавания СОТСТС ССАОАО 4 ил.Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеазы рестрикции,способной узнавать последовательностьнуклеотидов 66 ТСТС,ССА 6 А 6Известен штамм РзецбовопаерацсаоЫ 11 з, продуцент эндонуклеаэы рестрикции Рра 1, способной узнавать последовательность нуклеотидов 66 ТСТСССА 6 А 6Данные о продуктивности штамма отсутствуют,Наиболее близким к предлагаемомуизобретению является штамм Езсгегсй 1 асо 1 ВР 31, продуцент эндонуклеазы рестрикции, способный узнавать последовательность нуклеотидов 66 ТСТСССА 6 А 6,Недостатком штамма-прототипа является низкая продуктивность штамма, Выходфермента наблюдался около 9000 ед.акт./гклеток,Целью изобретения является получениенового штамма-продуцента, не требовательного к питательным средам, обеспечивающего более высокий выход целевогофермента, способного узнавать последовательность 66 ТСТС,ССА 6 А 6Это достигается получением и использованием штамма ВЬгоЫцв 1 е 9 цп 1 позагцп 169, продуцента эндонуклеазы рестрикцииВ 1 е 69 1,Штамм В.еццвпозагцв 69 выделен изклубеньков айугцз тцЬегозцв в результатепоиска штаммов - продуцентов эндонуклеаз рестрикции,Полученный штамм В,1 е 9 ца 1 позагцв 69хранится в коллекции НИКТИ БАВ под номером 320 и депонирован в коллекции культурмикроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под регистрационнымномером В. Продуцируемая им эндонуклеаза рестрикции названа В 1 е 69 1 согласнообщепринятой номенклатуре Натана иСмита,Штамм В,е 9 цв 1 позагца 69 характеризуется следующими морфологическими,культуральными и физиологическими признаками; клетки - полиморфные палочки,размером 0,5 - 0,8 х 1 - 3 мкм, грамотрицательные, подвижные. На агаризованнойсреде РПА (рыбно-пептонный агар) штаммобразует слабо прозрачные, блестящие,гладкие, круглые колонии с ровным краем,пигмент среды и посевной черты не выражен; усваивает многие углеводы, индол, сероводород не выделяет, восстанавливаетнитраты, использует цитрат, растет при эна 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 чении рН 5,4, отрицэтелвн по цистинээв, уреээе, хорошо растет на обычных оргэнических средах.Штамм ЙЫзоЫца 1 едцаповэгца устойчив к тэким энтибиотикэм кэк пенициллин, олиэидомицин, эритромицин, оксациллии, ристомиции, эмпициллин, метициллин, рифампицим, линкомицин, чувствителен к твтрациклину, стрептомицину, мономицину, неомицину, левомицетину, кэнамицину, карбенициллину. полимиксину, гетэмицину.Продуцируемая предлагаемым штаммом рестриктаза Й 1 е 69 1 характеризуется следующими свойствами:узнает последоеэтельность нуклеотидов ,66 ТСТС.ССА 6 А 6оптимальная температура действия фермента 37 С;значение рН 7,5-8,0,для проявлания активности рестриктаэы требуются ионы М 9 + в концентрации 5 - 10 мМ.Для поддержания штамма й,1 ерцв позэгц в 69 используетсяВ-агар, Для культивирования и ферментации В.1 ецца 1 позагца 69 применяют питательную среду следующего состава, г/л воды: пептон 10; дрожжевой экстракт 5; йаС 5; глюкоза 10, Культивирование проводят при температуре 30 С с аэрацией (180-200 об/мин) на качалке в течение 18 ч.В ыход биомассы: 6 - 8 г/л культуральной среды, Выход высоко- очищенного ферменте: 3000 ед.акт./г клеток.Определяющим отличием предлагаемого штамма В.1 е 9 ца 1 позагца 69 по сравнению с прототипом является в 3,3 раза более высокая продуктивность штамма.Поскольку данный штамм получен впервые и для получения рестриктазы, узнающей последовательность нуклеотидов 66 ТСТСССА 6 А 6 ранее никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "существенные отличия".На фиг. 1 изображена электрофореграмма гидролиза ДНК фага А рестриктазами Нпб 111 ц В 1 е 69 1, дорожки: Г - обработка Н пО 111, Д - совместный гидролиз Н 1 пО 1 ц Ве 69 1; на фиг. 2 - электрофореграмма гидролиза ДНК фага А рестриктазэми Мц ц В 1 е 69 1, дорожки: А - совместный гидролиз Мц + йе 69 1, Б - гидролиз Й 1 е 69 1, В - гидролиз М 1 ц 1; на фиг, 3 - построение рестрикционной карты ДНК фага А с использованием ферментов Н 1 пб 111, М 1 ц 1 ц Й 1 е 69 1; на фиг, 4 - электрофореграммэ гидролизэДНК плаэмиды рВВ 322 рестриктазами Вва 1, В(е 69 1 о Нпб, дорожки: А - обработка Вза 1, Б - обработка Ве 69 1, В - совместный гидролиз Ве 69 1 о Нпб , цифрами указано количество пар нуклеотидов в ферментах ДНК,П р и м е р 1. Культивирование штамма и получение биомассы.Культуру В.едогппозагогп выращивают на питательном бульоне следующего состава, г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт 5; хлористый натрий 5; глюкоза 10 ( -бульон),Для получения инокулята суточную культуру с плотной среды засевают петлей в пробирки с косячками-агара, инкубируют в термостате при температуре 30 С в течение 18 - 24 ч. Выращенную таким образом культуру смывают физиологическим раствором (или -бульоном) и засевают полученной суспензией клеток качалочные колбы с объемом среды 250 мл, предназначенные для ферментации, иэ расчета:смыв с одного косячка - на две колбы, Инкубируют на качалке (200 - 220 об/мин), 24 ч при температуре 30 С. После охлаждения клетки собирают центрифугированием при 6000 об/мин. Выход биомассы составляет в среднем 6 г влажных клеток на 1 л среды,П р и м е р 2. Очистка фермента, 2 г клеток суспендируют в 4 мл буфера экстракции, содержащего 0,1 М трис-НС, рН 8,0; 10 мМ 2-меркаптоэтанол и 0,1 ф-ный тритон Хдо гомогенного состояния, Смесь обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДНт три раза по 20 с с перерывами по 40 с для охлаждения в ледяной бане. К суспензии добавляют 10 мл раствора, содержащего полиэтиленгликоль ПЭГ, декстран Ти МаС до конечных концентраций в суспенэии соответственно 7 ф; 10 ь и 0,35 М, Смесь тщательно перемешивают 20 мин при 0 С, затем центрифугируют 15 мин при 5000 об/мин, Супернатант (около 13,5 мл) отбирают и наносят на колонку (6 мл) с гепарин-сефарозой, Колонку промывают 10 мл буфера А, содерж. щего 10 мМ калийфосфат, рН 7,4 и 10 мМ 2-меркаптоэтанол, Белки элюируют линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 1 М в буфере А, Рестриктаза Ве 69 1 обычно элюируется с колонки при концентрации йаС около 0,8 М, Фракции, содержащие активность рестриктазы, объединяют и наносят на колонку (1,5 мл) с гидроксилапатитом, Колонку промывают 3 мл буфера А и белки элюируют линейным градиентом калийфосфата от 0,01 до 1 М в растворе 10 мМ 2-меркаптоэтанола, Рестриктаза Ве 69 1 обычно элюируется при концентрации ка 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55(56) ВоЬегтэ В - Веэтгстоп епгугпеэ апб тлег эоэсйготегэ,-Нос Асс Вез 1987, ч.15, коррепепт р г 189-г 217 лийфосфата около 9,5 М, Фракции, содержащие целевой фермент, объединяют и диалиэуют против 100 мл буфера Б, содержащего 10 мМ трис-НС, рН 7,4, 50 мМ КС, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА и 50-ный глицерин. Полученный фермент н ы й п репарат хранят при минус 20 С, Выход рестриктазы 30000 ед.акт. из 1 кг клеток.Активность фермента определяют в 20 мкл рестрикционной смеси, содержащей 10 мМ тоис-НС рН 8,0, 10 мМ М 9 С 2, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 20 мМ МаС и 1 мкг ДНК фага 1. при 37 С. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК за 1 ч при 37 С. Ферментный препарат свободен от значительных количеств примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз и пригоден для генноинженерных работ.Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Ве 69 1, проводят картирование мест расщепления на ДНК с известной первичной последовательностью, в частности на ДНК фага А и ДНК рВВ 322, Для этого проводят параллельный и совместный гидролиз этих ДНК рестриктазой Ве 69 1 и рестриктазами с известной специфичностью. Для картирования мест гидролиза на ДНК фага Аиспользовали рестриктазы Нпс(фиг. 1) и Мо 1 (фиг, 2), Установлено, что рестриктаза Ве 69 1 гидролизует ДНК в двух местах, а именно в районе участков 114004-100 п,н. и 4270 .+ +100 п,н. (фиг. 3), При совместном гидролизе ДНК рВВ 322 рестриктазой Ве 69 1 и рестриктазами Вэа 1 и Нпс(фиг, 4) место гидролиза для Ве 69 1 локализовано в районе 3430.+.20 п.н. от ЕсоВ 1 сайта. Сопоставляя все эти данные и исходя из первичных структур ДНК, устанавливают что единственным сайтом узнавания рестриктазы Ве 69 1 является последовательность нуклеотидов . СОТСТС.,ССАОАО.,Полученный штамм по сравнению с прототипом обеспечивает повышенный выход целевого продукта, составляющий 30000 ед.акт,/г биомассы (в 3 раза больше, чем впрототипе).Поскольку рестриктаза Ве 69 1 имеет сайт узнавания 60 ТСТС,.идентичный сайту узнавания рестриктазы Есо 31, 1, она может заменить эту рестриктазу во всех генно-инженерных работах.2001952 А /Юа 22 Т яге ИХ Г д гля 31 1 б б 557 Об 1 2 Л 2 2027 Рог 1 А Ю Ря ЮЗ Игеб 9 тотягеб 97ЛЮ20495 А б В Я 7 б 578 7875090Зй М ЮУ го ЮО Убо РО Вцтусцз ЧВЖпа 1 се у Кегзц 1 уеО.,.уапц 1 аЮзА. - А печч гезтг 1 сбоп епс 1 опцс 1 еазе Есо 31 1 Формула изобретенияШтамм бактерий ВЫгоЫцгп гесосуп 1 г 1 пд а поп-ра 11 пбгов 1 с зеццепсе, - ВосЬ, В 1 орЬуз, Ас 1 а, 1985, ч. 826, р, 208-212. 1 едцгп 1 позагвгп ВНИИСХМ В- продуцент рестриктазы Юе 69. 1170 б - Д3 б ЛЧ Обl ггг Ю 27 гб2001952 Я б 45 бГ Я 5 б Па Редактор Л, Павлова Корр исное аз 3156 Тираж П НПО "Поиск" Роспатента13035, Москва, Ж, Раушская наб