Штамм бактерий bacillus тнuringiеnsis продуцент рестриктазы изошизомера

(5 12 И 9/22, 9 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН К АВТОРСКОМУ ТЕЛЬСТВ юл. 11 7 аучно-иссЛедовательетики и селекции оорганизмовн, Б.А.Ребенти 8)рЬапоп 1 аЬип. Ицс 1.9, 4833.ИЙ ВАС 11 ЛЛБ ТН 11 К 1 ННТ РЕСТРИКТАЗЫ ИЗОтносится к биотехОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИРИ ГКНТ СССР(71) Всесоюзный нский институт генпромышленных мик(57) Изобретение Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и представляет собой штамм В. гЬцг 1 пд 1 епз 1 з, продуцирующий энаонуклеазу (рестриктазу), названную ВСци узнающую последовательность нуклеотидов 5 -АТССАТ Рестриктаза Вгц может быть использована при исследовании первичной структуры ДНК и в генной инженерии при конструировании рекомбииантных ДНК.Целью изобретения является создание высокопродуктивного штамма Вас 111 цз гЬцг 1 пдепз 1 з ВКПМ В- продуцента рестриктаэы Вгцизошизомера С 1 а 1, продуцирующего только одну рестриктаэу.Штамм В. гЬцг 1 п 8 депз 1 з (ВНИИ генетики 16-И) позволяет получить рестриктаэу Вгцизошизомер С 1 а 1 2нологии и генной инженерии и представляет собой штамм Вас 111 цз ГЬцгп 81- епз 1 з ВКПМ В, продуцирующий рестриктазу, названную Вци узнающую последовательность нуклеотидов 5 -(АТССАТ, Штамм выделен иэ природного материала в результате поиска штаммов-продуцентов рестриктазы путем оценки эффективности посева,различных бактериофагов. Штамм хорошо растет на простой по составу питательной среде и выделяет только одну рестриктазу, что значительно упрощает ее выделение. Выход фермента составляет 5000 ед./г сырой биомассы, 1 табл,в количестве до 5000 ед./г сырой биомассы. Предлагаемый штамм хорошо растет на питательной среде простого состава и продуцирует одну рестрик,тазу, что значительно упрощает ее хамвыделениеСлПредлагаемьй штамм В. 1 Ьиг 1 пепз 1 з ф ВКПМ В(ВНИИ генетики 16-И) ф выделен из природного материала в ре- р зультате поиска штаммов - продуцен- е тов рестриктаэы путем оценки эффективности посева различных бактериофагов.Исследуемый штамм В. ГЬцгдп 8.- епз 1 з (ВНИИ генетики 16-И) обла- ю дает следующими морфологическими, аеаЬ культуральными и физиологическими признаками.Морфологические признаки: грамм- положительные палочки, перетрихи раз- мером (1,5-1,9) х(3-6) мкм, образуетспоры и вытянутые мелкие ромбовидные кристдллы.Культуральные признаки: на агаризованной среде Хоттингера через24 ч роста при 30 С штамм В, СЬцгхп 81 епя 1 я (ВНИИ генетики 16-И) образует шероховатые колонии с серымотливом, края ровные, центр болееплотный, возвышается в виде "пугов- Оки", вокруг которой четко виден валик, о 3-10 мм,На среде МПА через 24 ч при 30 Собразует колонии с ровными краями,поверхность шероховатая, в центреедва заметное возвышение, по краювалик, й 3-8 мм.На дроюке-полисахаридной среде100 г сорбита, 60 мл дрожжевого автолизата, 1 г (ИН 4) БО 4, рН 5282 2020 г агара на 1 л среды штамм В,ГЬцг 1 п 1 епя 1 я (ВНИИ генетики 16-И),образует колонии плоские, с несколь-.ко различными краями, центр болееплотный, блестящий, с 1 3-8 мм. 25Физиолого-биохимические признаки.Отношение к источникам углерода.Штамм В. 1 Ьцг 1 пр 1 епяя сбраживаетглюкозу, сахарозу, Не используетманнозу, салицин, эскулин, ОбразуетТ 11 Е (Т 11-эстеразу), не образует лецитин,Отношение к источникам азота. Усваивает аминный азот белков.Отношение к,температуре: растетот 28-37"С, оптимум 30 С.Отношение к рН среды: растетПри рН от 5,8-7,2, оптимум рН 720.Отношение к кислороду: аэробШтамм не патогенен, Культура хранится на агаризованной среде Хоттингерапод вазелиновым маслом.Штамм В, гйцг 1 п 81 епя 1 я (ВНИИ генетики 16-И) продуцирует рестриктазу со специфичностью 5 АТССАТ нязванную Вгц, согласно общепризнан -ной номенклатуре. Рестриктаза В:ц чувствительна к метилированию внутреннего аденинового основания в сайтеузнавания, 50.Оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5-8,0, оптимальНая температура действия рестриктазыо37-40 С, для активности фермента требуются ионы Мр (5-10 мМ). Ферментактивизируется небольшими концентрациями ИаС 1 (25-50 мМ), За единицу ак.;ивности принимается количество Фермента, вызывающее полное расщепление1 мкг ДНК бага лямбда за 1 ч инкубации при 37 дС. Состав буфера: 1 О мМ трис-НС 1, 50 мМ ИаС 1, 10 мМ МЕС 1 10 мМ 2-МЭ, рН 7,5. Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемых рестриктазой Вц, проводили гидролиз ею ДНК различного происхождения, для которой известна нуклеотидная последовательность: бактериофага лямбда ( Ъ ), ф Х 174 РФ, М 13, вируса БЧ 40, плазмиды РВР 322., Расщепление ДНК проводят в реакционной среде следующего состава: 10 мМ трисНС 1 (рН 7,5) б мМ 2-мерпатоэтанола, 6 мМ МяС 1 и 50 мМ ИаС 1 при 37 С.Количество фрагментов, полученных при расщеплении различных ДНК рестриктаэой ВГцпозволяет однозначно установить сайт узнавания - 5 АТССАТ (Сепе 10, 357, 1980).Количество сайтов расщепления для рестриктаэы Вгци С 1 а 1 на ДНК раз" личного происхождения приведено в таблице. ДНК Рестриктаза изошизомера -ОВР 322ЙО (2 О 2124 2 О 2 0 2 0 2 В, цС 1 а 1 0 Таким образом, рестриктаза ВСц является изошизомером ранее описанной и широко используемой в генной инженерии, молекулярной биологии и биотехнологии рестриктазы С 1 а 1, Рестриктаза Вцпо характеру своего действия аналогично рестриктаэе С 1 а 1 чувствительна к Йаш-метилированию,П р и м е р. Штамм В. 1 Ьцгдпдзепя 1 я (ВНИИ генетики б-И) поддержи" вают в пробирках на агаризованной среде Хоттингера под ваэелиновым маслом, Для оживления штамм пересевают на агар Хоттингера и инкубируют при 37 С 19 ч, Затем пересевают в прообирки с 5 мп бульона Хоттингера и инкубируют при 37 С 4 ч на качалке.оТакую культуральную жидкость вносят в соотношении 1:50 в 250 мл бульона Хоттингера в колбы объемом 650 мл и выращивают на круговой качалке при 250 об/мин при 37 С до поздней лога" рифмической фазы (19 ч). Культуральную жидкость охлаждают до 4 С и центриФугируют на центрифуге "Богуа 1 -Зс" при 6000 об/мин 30 мин. Выход сыройФормула изобретения Составитель И.ПриваловаТехред М,Дидык Редактор В.Данко Корректор Н, Король Заказ 471 Тираж 482 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород., ул. Гагарина,101 5 15448 биомассы 5 г с 1 л культуральной жидкости. Биомассу хранят при -20 С.Для выделения фермента 1 г биомассы суспендируют в 6 мл буфера А ( 20 мМ трис-НС 1 рН 7,5; 1 О мМ 2-мер 5 каптоэтанола, О, мМ ЭДТА, 57. гли- церина), обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе при 50 Ю в течение 8 мин и центрифугируют при 18000 об/мин. О 60 мин. Полученный бесклеточный экстракт со скоростью 1 мп/мин наносят на колонку размером 1,51,9 см с ДЗАЭ-трисакрилом (ДЕАЕ-Тгвасгу 1 ш "ЬКВ", уравновешенную буфером А и подсоединенную к системе РРЬС фирмы "РЬагшаса" (Швеция).Колонку промывают тем же буфером и элюируют градиентом ЮаС 1 0-0,5 М в. буфере А, Общий объем градиента 20 35 мл, Наиболее активные фракции, элюируемые при 0,06-0,09 М ЮаС 1, объединяют, диализуют против буфера А и, наносят на колонку Моно Я,НК 5/5 ("РЬагшаса"), уравновешенную буфе ром А. Элюируют градиентом ИаС 1 (О,5 М) в буфере А. Общий объем градиента 20 мп. Наиболее активные фракции, элюируемые при 0,2-0,25 М МаС 1, объединяют, диализуют против 30 буфера В (60 мМ КРО ; рН 7,4; 10 мМ 2-мерпатоэтанола; 0,1 мМ ЗДТА; 5 Х глицерина) и наносят на колонку Моно Я НК ф/5 ("РЬагшаса"), уравновешен 02 6ную буфером В, Элюируют градиентом МаС 1 (0-0,5 М) в буфере В. Общий объем градиента 20 мл, Наиболее активные фракции,.элюируемые при 0,32- 0,38 М 11 аС 1, концентрируют диализом против буфера В с 507 глицерина и 50 м" МаС 1. Получают 1,25 мп препарата рестриктаэы Вгцс активностью 4000 ед./млПрепарат фермента хранят при -20 С, Выход фермента составляет 5000 ед./г сырой биомассы.Таким образом, предлагаемый штамм В. гЬцг 1 прдепвв (ВНИИ генетики 16-И) обладает следующими преимуществами по сравнению с известным штаммом: не требует для культивирования сложной питательной среды и превосходит его по продуктивности в 10 раз (5000 ед./г сырой биомассы против 450 ед./г сырой биомассы).Кроме того, предлагаемый штамм В. гЬцг 1 п 81 епядв (ВНИИ генетики 16-И) хорошо растет на простой питательной среде и обладает коротким временем культивирования: за 19 ч накапливает 5 г сырой биомассы/л культуральной жидкости,Штамм бактерий Вас 11 ця ГЬцг 1 п 81- епя 1 в ВКПМ В- продуцентрестриктазы Вгц-Е изошизомера С 1 а Е,