Способ получения антибиотика

СО 2 ОЭ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТКИ ЕСНИХРЕСПУБЛИК 092 022.4 (51) С 12 Р 1/06 Г ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ ен Иериело (Вели-.Керст сн.5(088.8) ГОСУДАРСТВЕККЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРИТЮ(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА общей Формулы0 Р е Ц - (-СНО), о, ацильного эфирного производного, сложного эфира и/или производного, где Я - (-СН ОН), заключающийся в том, что штамм Бгерйошусеа Егай 2.ае ВВЖ 12171 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинных аэробных усповиях с последующим выделением целевого продукта в виде основания и при необходимости переводом его в соль и/или ацильное эфирное производное, и/или сложный эфир, и/или производное, где Ч - (СН ОН)Н 15 Снз ОН Нз где Я - (-СНО),его ацильного эфирного производного,сложного эфира и/или производного, где Ц - (-СН ОН), штамм БГгерГовусез Егай 1 ае МВЮ, 1217 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях с последующим выделением целевого продукта в виде основания и при необходимости переводом его в соль и/или ацнльное эфирное производное и/или сложный эфир, и/или проиэвод ное, где Я - (СН 20 Н)Для осуществления способа используют штамм Бйгерговусез Хгай 1 ае БКЫ, 2171, который хранится в коллекции штаммов Северного регионального исследовательского центра отдела сельскохозяйственных исследований под номером ЯКИ 12171 и характеризуется следующими признаками.Культурально-морфопогические признаки.На агаре Чапека спороносцы имеют изгибы, петли и неправильные короткие спирали небольшого диаметра. 45 Поверхность спор гладкая, сферической формы диаметром 0,61-0,7 1 мкм.Воздушный мицелий слабо развит, с окраскоф от белого до серого, чаще отсутствует. Обратная сторона колоний имеет окраску от светло-желтого до умеренно желтого, Меланоидного пйгмента не образует.Бульон с триптон-дрожжевым экстрактом (1 БР). Рост средний, обрат ная сторона колоний желтого цвета, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют. 30Ф 1 1134Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового антибиотика.Аналогов в патентной и научнотехнической литературе не обнаружено.Целью изобретения является получение нового антибиотика.Эта цель достигается тем, что приспособе получения антибиотика общей формулы О11ат -крахмалтридыположи гидролизуе сстанавливельная, .фосф а отрицател раты в Катала положительна Проявляет антагонистическую актив ность в отношении ряда грамм-положительньи патогенных бактерий и вида Мусор 1 азва.П р и м е р 1. Лиофилизированную культуру Бгг. Егайае ЯВИ. 12171 диспергируют в 1-2 мп стерильной воды. Часть этого раствора (0,5 мп) используют для инокуляции 150 мл посевной среды следующего состава, 3:Зерновая настойка 1 в 0 Экстракт дрожжей 0,5 Мука грубого помоласоевых бобов 0,5 Карбонат кальция О, Соевое масло (неочищенное) 0,45 Обессоленная вода 97,25 3 120 2Среда 1 БР. Рост хороший. Обратная сторона колонии желтая, воздушный мицелий хороший, белого цвета. Растворимый пигмент отсутствует.Среда 1 БР. Рост хороший. Обратная сторона колонии желтого цвета, воздушный мицелий - следы, серый, растворимый пигмент отсутствует.Среда 1 БР. Рост хороший, Обратная сторона колоний желтая, воздушный мицелий хороший, серый, Растворимый пигмент светло-коричневый.Са-малат. Рост плохой. Обратная сторона колонии белая, Воздушный.мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.Среда Чапека. Рост хороший. Обр ная сторона колонии желтого цвета, воздушный мицелий хороший, белый.Растворимый пигмент отсутствует.Томатная паста - овсяная мука.Рост хороший. Обратная сторона колоний желтая. Воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.Физиолого-биохимические свойства.Диапазон рН для роста 6,1-7,8, температура 10-37 С. Устойчив к хлориду натрия в концентрации 47.Усваивает глюкозу, О-фруктозу, 0-галактозу, иэоинозит, сахарозу, 0-ксилозу; не усваивает О -арабинозу, 0-маннит, раффинозу, салицин, 0-рамнозу.Жепатину не разжижает, молоко не сбраживает, т,1134120 0,0945 35 40 45 50 55 3Другой вариант йриготовления посевного материала заключается в следующем.Культуру, сохраняемую в количестве 1 мл в жидком азоте, быстро оттаивают и инкубируют в посевную среду. Среду выдерживают в 500 миллилитро-.0 вых колбах Эрленмейера при 29 С в течение 48 ч в закрытой трясучке при 300 об/мин.Выдержанную посевную среду (0,5 мл) инокулируют 7 мл ферментационной среды следующего состава, 7:Свекольная патока 2,0Зерновая мука 1,5Рыбная мука 0,9Пшеничная клейковина 0,9Хламид натрия 0,1(БН)2 НР 04 0,04Карбонат кальция О, 2Соевое масло (неочищенное) 3,0Обессоленная вода 91,36Инокулированную ферментационную среду инкубируют в 50-миллилитровых бутылках при 29 С в течение б дн на0закрытой трясучке при 300 об/мин.П р и м е р 2. Для получения большого объема инокумента берут 60 мл вццержанной посевной среды, инокулируют ее в 38 мл среды, содержащей, Х;Зерновая настойка 1,0Соевая масляная мука 0,5Дрожжевой экстракт 0,5Карбонат кальция 0,3Соевое масло (неочищенное) 0,5Лецитин (неочищенный) . 0,015Вода 97, 185.рН среды доводят до 8,5 добавлением 503-ного раствора НаОН.Эту среду инкубируют в, 68-литровом ферментере в течение 47 ч при 29 С. 4 л подготовленного таким образом посевного материала используют для инокуляции 40 л стерильной ферментационной среды следующего состава, 7:Рыбная мука 0,9188 Зерновая мука 1,575 Зерновая клейковина 0,9188 Карбонат кальция О, 210 Хлорид натрия О, 105 (НН,), НРО 4 0,042 Свекольная патока 2,10 Соевое масло (сырое) 3,15 ЛецитинВода 90,8859рн регулируют до 7,2 добавлением 507-ного раствора БаОН.ферментацию ведут в 68-литровомферментере в течение 5 дн при 28 Спри аэрации стерильным воздухом,при этом концентрация растворенного кислорода поддерживается в пре О Делах 30-507., перемешивание осуществляют со скоростью мешалки 300 об/мин.П р и м е р 3. Полученную культуральную жидкость с рН 7,2 фильтруют через фильтровальный мелкозер нистый порошок. К 1450 мл фильтратадобавляют 400 мл этилацетата, рнраствора устанавливают 9,1 с помощьюИаОН. Смесь перемешивают 10 мин иотделяют этилацетат. Фильтрат повтор но экстрагируют 200 мл этилацетата.К объединенным этилацетатным экстрактам добавляют 200 мл воды и устанавливают рН 4,1 фосфорной кислотой,Водную фазу отделяют, а органическую 25 фазу отбрасывают, рН водной фазыдоводят до 9, 1 ИаОН и концентрируют .до 100 мл в вакууме. Получают аморфный осадок, выдерживают его в течение 8 ч и отделяют фильтрованием.30 Осадок растворяют в ацетоне (20 мл)и добавляют 75 мл воды. Раствор концентрируют в вакууме, образующийся осадок отфильтровывают и промывают водой. Получают 50 мг 23-де(мицинозилокси)тилозина (ДМОТ) . Аналогичнымспособом из фильтрата получают дополнительно 260 мг ДМОТ. ДМОТ представляет собой белое аморфное вещество, размягчается при 158 С, плавится при 165-167 оС,Элементный анализ,й: углерод 62, водород 8, азот 2, кислород 27,Эмпирическая формула: Сще Н 6 Я 01Молекулярный вес 726 (725 по данным масс-спектрометрии).ИК-спектр поглощения в хлороформе (шах поглощения), см ". 3653 (маленькая), 3588 (с уступом), 3470 (широкая), 3026 (с уступом), 2998 (с уступом)2969. (интенсивная), 2932 (йнтенснвная), 2873 (с уступом),1709 (интенсивная), 1669 (средняя), 1616 (очень маленькая), 1583 (интен-сивная), 1447 (средняя), 1400 (средняя),1365 (средняя),1309 (средняя), 1278 (маленькая), 1175 (средняя), 1151 (средняя), 1106 (маленькая), 1066 (с уступом),1036 (интенсивная).,1001 (сред3няя),982 (средняя),972 (с уступом), 946 (маленькая),913 (очень маленькая), 891 (очень маленькая), 853 (очень маленькая), 826 (маленькая).УФ-спектр поглощения в нейтральномэтаноле имеет максимум поглощения при 283 нм)(Я 21500).Удельное вращение /а / 62,75Электрометрическое титрование в 66%-ном водном диметилформамиде ука зывает на наличие титруемых групп с рКп величиной примерно 7,3.Умеренно растворимо в воде, растворимо в ацетоне, метаноле, диметилформамиде, хлороформе,диметилсульфокси де и других полярных органических растворителях. Лучшей растворимостью в воде обладают соли, кислот.Антимикробная активность, мкг/мп:БггерГососсцв руояепея 20С 203 0,25Яггергососсцв рпецшопдае р 1ясгергососсцз (Группа Э) 282 Ь,5 25БгарЬУ 1 ососсцяацгецв 3055 1,0Раягецге 11 а шц 1 госЫа 6,25Раягецге 11 а Ьешо 1 уг 1 са 25,00Мусор 1 аяша еа 11 ыергсцш 0,097Мусор 1 аята ЬуорЬецшоп 1 ае 0,39Мусор 1 аята ЬуогЬзп 1 в0,79П р и м е р 4. 11 г ДМОТ растворяют в разбавленной соляной кислоте (рН 1,8), Полученный раствор выдер. - живают при комнатной температуре в течение 24 ч и затем рН доводят до 9,0 с помощью ЯаОН. Щелочной раствор экстрагируют хлороформом. Полученный о экстракт сушат в вакууме и получают 9,65 г 23-деокси-0-мицаминозилтинолида (ДОМТ), имеющего структурную формулу р и м е р 5. 50 мг ДМОТ раствов водном растворе изопропилового спирта (40%, 25 мл) . В 30%-ном водном растворе изопропилового спирта (10 мп) растворяют 20 мп борогидрида натрия. 1 мл борогидрида натрия добавляют к раствору, содержащему ДМОТ. Полученную смесь перемешивают в течение 5 мин. Устанавливают Рн 7,5 с помощью фосфорной кислоты и концентрируют в вакууме, Добавляют 50 мп хлороформа. рН регулируют до 7,5. После зкстракции отделяют хлороформ и выпаривают досуха. Получают 20-дигидро-де(мицинозилокси)" тилозин (дигидро-ДМОТ),Дигидро-ДМОТ можно перевести в дигидро-ДОМТ, используя метод, описанный в примере 4.П р и м е р 6. Получение 2-0-ацетил-ДМОТ.5,0 г (6,9 моль) ДМОТ растворяют в 150 мп и обрабатывают 0,84 мл (8,2 ммоль) уксусного ангидрида, добавляемого по каплям при перемешивании и при комнатной температуре. После перемешивания в течение 17 ч растворитель выпаривают при пониженном давлении. Остаток растворяют в малом объеме этилацетата и хроматографируют на силикагеле. Элюируют 4 л этилацетата. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и выпаривают досуха при пониженном давлении. Получают 4,2 г (80%) 2-0 ф-4-ацетил-ДМОТ.П р и м е р . Получение 2-0- -ацетил-финилацетил-ДМОТ. 2,7 г (35 ммоль) 2-0-ацетил-ДМОТ растворяют в 70 мл хлористого ме-. тилена и 0,8 мл пиридина и обрабатывают раствором 0,56 мп (3,5 ммоль) фенилацетилхлорида в 30 мл хлористого метилена при перемешивании и при комнатной температуре. Через 6 ч растворитель выпаривают, остаток растворяют в хлористом метилене и экстрагирувт насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органический слой отделяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают. Остаток растворяют в этилацетате и хроматографируют на силикагеле (Вотерс Преп 500). Колонку элюируют 4 л зтилацетата. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и выпаривают досуха. Получают 1,2 г (3%) .2-0-ацетил-0-фенилацетил-ДМОТ.дП р и м е р 3. Получение 2-0-аце-,йтил-0-из овал ерил-ДМОТ.7 111 2 г (1.6 ммоль) 2-0-апетил-ПМОТ в 29 мл пнрилина обрабатывают 0,1 мл (3,9 ммоль) изовалерилхлорида при перемешиванни при 0 С. После обработки сухой продукт растворяют в толуоле н хроматографируют на силикагеле. Колонку элкируют смесью толуола и этилацетата (9: 1 до 1:2), Получают 0,12 г продукта. Затем элкируют колонку хлористым метиленом и получают 0,84 г (553) 2-0-ацетил 1 Ч -О-фе нила цетил-ДМОТ.кП р и м е р 9. 4-0-Изовалерил-ДМОТ.0,4 г 2-0-ацетил-0-изовалерил- -ДМОТ растворяют в 30 мл 80 Ж-ного водного метанола и кипятят в течение 4,5 ч.,Раствор охлаждают .до комнатной температуры и выпаривают досуха при пониженном давленииПолучают 0,13 г (343) целевого продукта. И10. 4-0-ФенилацетилСоставитель Г. Смирнова Редактор И.Николайчук Техред А.Бабинец Корректор В. СиницкаяеЗаказ 9972/46 Тираж 525 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Пример-ДМОТ.0,2 г 2-0-ацетил-0-фенилацетил-ДМОТ растворяют в 18 мл 803-ноговодного метанола и кипятят в течение5 ч. Раствор охлаждают до комнатнойтемпературы и выпаривают досуха припониженном давлении. Получают 0,16 г-ацетнл-пр опионнл-ДМОТ.В 30 мл пиридина растворяют 1 г2-0-ацетил-ДМОТ н обрабатывают 5 раствор 0,6 мл пропионового ангидрида, добавляемого по каплям при перемешивании прн комнатной температуре.Через 20 ч добавляют еще 3,0 млпропионового ангидрида и реакционнуюмассу перемешивают в течение 26 чпри комнатной температуре, Смесьразбавляют 30 мл толуола и при пониженном давлении выпаривают растворителем. Остаточное масло растворяют в 15 50 мл дихлорметана и экстрагируют насыщенным раствором бикарбоната натрия.Органический слой отделяют, сушат надсульфатом натрия, фильтруют и выпаривают. Остаток загружают в колонку с .20 силикагелем и элкируют при линейномградиенте толуола (4 л) у этилацетата(4 л). Элкируют 305 мг 2-0-ацетил 3,4-ди-О-пропионил-ДИОТ, а затемФ286 мг 2-0-ацетил-0-пропионил-ДМОТ.Каждое соединение кипятят с обратным холодильником в 803-ном водномметаноле и получают два производныхДМОТ.Использование изобретения позво ляет расиирить ассортимент антибактериальных средств.