Способ получения противовирусного комплекса

Юий п 1) 486514 ОП ИИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(33) Великобритания Государственный комитет Совета Министров СССРОпубликовано 30,09.75. Бюллетень36по делам изобретений(088.8) и открытии Дата опубликования описания 19.04.76(72) Авторы изобретения Иностранцы Дуглас Бродбент, Гарольд Джордж Хемминг и Барри Хесп(Великобритания) Иностранная фирма Империал Кемикал Индастриз Лимитед(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНОГО КОМПЛЕКСА Изобретение относится к медицинской промышленности.Способ получения противовирусного комплекса из культуры грибка штамма Ягодезпп- цгп йчегзцгп С. М, 1.102519 является новым и состоит в том, что культуру грибка штамма 51 годезгп 1 цт йчегзцтп С. М. 1.102519 выращивают на среде, содержащей источники углерода и азота, экстрагируют фильтрат культу- ральной жидкости не смешивающимися с водой органическими растворителями, например хлороформом, высушивают экстракт и при необходимости фракционируют на активные компоненты.Штамм грибка 51 годезтп 1 цгп дкегзцгп (Кук), получаемый из Государственного микологического института, находящегося в Ферри Лейн, Кью, Англия, по каталогу значится как С. М, 1.102519.Культура хорошо произрастает на обычной микологической агаровой среде, и через 6 дней в колонии образуется центральный участок спорообразующего мицелия, окруженный зоной гиф, которая может быть как воздушной, так и погруженной или первично погруженной, Эта зона неокрашена. Спорообразующая область обычно темно-коричневого цвета с несущими споры клетками, возникающими при росте на агаре или на воздухе. Рост может быть довольно энергичным, например, на солодовом агаре или неравномерным, например, на агаре Чапек - Докс.5 Споры, образующиеся из ветвей конидиофор, видны в длинных, редко разветвленных цепях. Они представляют собой амероспоры и дидимоспоры (фрагмоспоры встречаются редко), развивающиеся от вершины к основанию.10 Зрелые споры довольно толстые, но местамитонкие. Амероспоры шарообразные диаметром 10 (9 - 11) мм, дидимоспоры почти цилиндрические с сужением около перегородки 18 (15 - 22) (10 (9 - 15) мм.15 Источником усвояемого углерода являются,например, многоатомные спирты - сахароза, глюкоза, лактоза, глицерин или маннит; источник полимеризуемого углевода, например крахмал; природные или синтетические масла или жиры. Источник углерода содержится обычно в среде в количестве от 0,1 до 30% по весу.Источниками усвояемого азота являются вещества органического или неорганического происхождения. Они могут быть в форме нитрата щелочного или щелочноземельного металла или аммонийной соли неорганической или органической кислоты, например, нитрата-Фнатрия, калия, кальция или аммония, тартрата аммония, сульфата аммония или фосфатааммония. Они могут быть также в форме аминокислоты, например глицина, в форме муки,например муки из семян хлопчатника, или 5жидкости моченой кукурузы, пептона, мочевины, дрожжевого экстракта или мясного экстракта. Можпо использовать смеси двух илиболее указанных выше веществ. Обычно источник азота содержится в среде в количестве 100,001 - 1,0%,Среда содержит меньшие количества такихэлементов, как фосфор (например, в виде первичного кислого фосфата калия или вторичного кислого фосфата аммония), магний (например, в виде сульфата или карбоната магния), сера (например, в виде сульфата) и калий (например, в виде хлорида или карбоната калия), и ничтожные количества, следы железа, марганца, цинка, молибдена или меди. 2 ОВ качестве водной питательной среды используют среду под названием Чапек - Докс.Выращивание ведут при температуре 15 -35 С, предпочтительно при - 25 С,В качестве не смешивающегося с водой органического растворителя используют, например, хлороформ, этилацетат, толуол или диэтиловый эфир, из которых предпочтительнымявляется хлороформ.Антивирусный комплекс состоит из восьми зосоединений, обладающих способностью задер 2 кивать рост вирусов, Это - Сиродесмины А,В, С, Р, Е, Р, 6 и Н.Сиродесмин А имеет структурную формулу 1, где К, - ацетил, К, - водород и Н=2: 35 ОН СН Сиродесмин В имеет также структурн формулу 1, но К 1 - ацетил, К 2 - водород Н=4; у Сиродесмина С К 1 - ацетил, К 2 водород, а Н=З.При обработке комплекса, задерживающе рост вирусов, двуокисью серы образуется др гое соединение, обладающее тем же свой вом - Сиродесмин 1.Сиродесмины А, В, С, Р, Е, Р, б, Н и имеют следующие характеристики,5 есмин А,7; Н 5 4; М 5 8; 8 13 2.твует исходный ион, нопри (М - 52)+. НайденоК 208; требует м/е 422,триметилсилилимидазоНайдено, %:С 20 Н 26 К 20882Вычислено, 0/Масс-спектр,имеется сильньм/е 422, 1731;1689, При обр 0 С 49Отсут й пик СН 2 аботке 44 8 йб 144лом (бензол, 60 С, 3 час) образуется бис-триметилсилилпроизводное, в масс-спектре которого отсутствует исходный ион, но виден слабый пик. Соответствующие (М - СН 8)+ прим/е 615, 1689; С 8 Н 89 М 20882 Я 2; требует 615,1686.Ацетилирование. При обработке уксуснымангидридом в пиридине в течение недели притемпературе 22 С получается бис-ацетат стемпературой плавления 186 в 1 С.Найдено, %: С 50,5; Н 5,3; Х 4,9.С 24 Н 30 Х 201082.Вычислено, %: С 50,7; Н 5,2; М 4,9,Наибольший пик масс-спектра (М - Ь 2)+при м/е 506, 1871, С 24 Н 80 Х 2010 требует м/е 506,1901,Гри обработке Сиродесмина А уксуснымангидридом в течение 1 час при температуре22 С получается моноацетат,Найдено, %: С 49,9; Н 5,3; К 5,3; 8 11,7.С 22 Н 27 Х 20952.Вычислено, %: С 50,0; Н 5,2; М 5,2; Ь 12,1.На масс-спектре виден небольшой пик для(М - Я 2)+ при м/е 496 и сильный пик для(М - 82)+ при м/е 464,При гидролизе Сиродесмина Л 0,1 н. раствором НС 1 в метаноле получается дезацетилсиродесмин Л с температурой плавления198 в 2 С,Найдено, %: С 48,4; Н 5,6; Х 6,0; Ь 14,3,С 18 Н 24120782.Вычислено, %: С 48,8; Н 5,6; Х 6,3; 5 14,4.В масс-спектре отсутствует ион, но виденсильный пик для (М - Ь 2)+ при м/е 380.Г 1 ри обработке Сиродесмина Л трифенилфосфином в хлороформе получается моносульфид,Найдено, %: С 52,7; Н 5,7; М 5,8; Ь 7,1,С 201 1261208,Вычислено, %: С 52,9; Н 5,8; И 6,2; 5 7,0.Молекулярный ион виден при и/е 454.Сиродесмин ВНайдено, %; С 43,4; Н 4,9; Х 4,9; Ь 22,8.С 20 Н 26 Х 2088 4.45Вычислено,%; С 43,6; Н 4,8; М 5,1; Ь 23,3.Масс-спектр: исходного иона не видно, ноую виден сильный пик для (М - 58)+ при м/е 422,Спектр практически идентичен спектру Сиродесмина А.При обработке бис-триметилсилилтрифторго ацетамидом (бензол, 50 С, 3 час) образуетсябис-триметилсилилпроизводное, На масс-спектре исходный ион отсутствует, но виден слабый пик, соответствующий (М - СН 8)+ прим/е 647, 1445; С 26 Н 89 Х 20858812; требует м/е647, 1407.Сиродесмин СНайдено, %: С 46,3; Н 5,1; И 5,1; Я 18,0.С 201 26112083Вычислено, %: С 46,3; Н 5,0; М 5,4; Ь 18,5.Масс-спектр. Сильный пик, соответствующийМасс-спектр. Исходный ион отсутствует, новиден сильный пик для (М - 8,.)+ при м/е 422.Сиродесмин ЕМолекулярная формула С 26 Н 26 Х 2085 гдех равен, вероятно, 3. Масс-спектр. Исходныйион отсутствует, но виден сильный пик для(М - 8)+ при м/е 422.Сиродесмин ГМолекулярная формула С 26 Н 26 И 2085 гдех равен, вероятно, 3, Масс-спектр, Исходныйион отсутствует, но виден сильный пик для(М - 8,)+ при м/е 422.Сиродесмин 6Найдено, /,: С 49,7; Н 5,4; М 5,7; Ь 12,6.С 20 Н 26 К 20852.Вычислено, %: С 49,4; Н 5,4; И 5,8; Ь 13,2,Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, новиден сильный пик для (М - Я 2)+ при м/е 422.Гидролиз. При обработке Сиродесмина С0,1 н, раствором НС 1 в метаноле образуетсядезацетилсиродесмин С; температура плавления 195 - 196,5 С.Найдено, %: С 48,4; Н 5,5; М 6,5; 8 14,6.С юН 24 М 20752,Вычислено, /6. С 48,8; Н 5,5; М 6,3; Б 14,4.Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, новиден сильный пик для (М - 52)+ при м/е 380.Ацетилирование, При обработке Сиродесмина С уксусным ангидридом в пиридине в течение 9 дней при комнатной температуре образуется бисацетат Сиродесмина С с температурой плавления 159 - 159,5 С.Сиродесмин НМолекулярная формула С 26 Н 26 К 2085, Массспектр, Исходный ион отсутствует, но виденсильный пик для (М - 8.,)+ при м/е 422.Сиродесмин 1Найдено, %: С 49,8; Н 5,5; И 5,5.С 20 Н 26 М 20882.Вычислено, %: С 49,4; Н 5,4; И 5,8.Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, новиден си.пьный пик для (М - Я)+ при м/е 422и слабый пик для (М - 5)+ при м/е 454,Сиродесмины А, В, С, Р, Е, Г, Н и 1 и ихпроизводные разделяются методом хроматографии в тонком слое на силикагеле.Сиродесмины, кроме 1, выделяют из комплекса, задерживающего рост вирусов, например, при сочетании колонной хроматографиии препаративной хроматографии в тонкомслое.Комплекс, получаемый при экстракции грибкового бульона, выделяемые из него Сиродесмины А, В, С, Ь, Е, Р, 6, 1, дезацетилпроизводные Сиродесминов А и б, моноацетат имоносульфид Сиродесмина А обладают способностью задерживать рост вирусов в присутствии клеток хозяина, в частности они обладают активностью в отношении реновирусов в присутствии эмбриональных легочныхклеток человека, а также в отношении вирусов Кокссаки А и В и Эко-вирусов.Активность в отношении реновирусов измеряют следующим образом. Легочные эмбриональные клетки человека выращивают обыч 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ным способом на минимальной специфической среде Игла с добав,пением 1% телячьей сыворотки в стеклянных трубках при температуре 33 С. Восемь групп (по три в каждой) таких трубок обрабатывают испытуемыми растворами соединений в той же среде. содержащей 200, 50, 12,5, 3,1, 0,8, 0,2, 0,05 н 0,00 мг испытуемого соединения в 1 мл раствора, Инкубацию производят прп 33 С, и через 24 час в каждю трубк помещают доз риновируса, например, типа 2, соответствующую 100-кратной дозе культуры, вызывающей 50% инфекции.После дополнительной пнкубацни в течение 2 дней при 33 С каждую трубку исследуют визуально пля определения наличия цитопатического эффекта, вызываемого токсичностью соединения, которая характеризуется цитопатическим эффектом на весь слой клеток, а также,чля определения наличия цитопатического эффекта, обусловленного ростом вируса и который является характерным, фокальным цитопатическим эффектом, легко отличимым от токсичности сое,пинсний. Активной дозой испытуемого соединения называется концентрация соединения, которая защищае. 50% клеток от цитопатического эфФекта, вызываемого ростом вируса. Токсичной дозой называют концентрацию испытуемого соелинения, которая обусловливает токсичность соединения506/6 к,четок культур, обработанных при такой концентрации соединения.Комплекс и соединения задерживают рост реновируса типа 2 при концентрации, равной или меньшей 0,25 мг/м,ч, но в то же впемя не оказывают заметного токсического эфФекта на клетки ткани к.льтуры при дозах, в 10 раз бо,пьших наименьшей активной дозы.Сиподесмин А вводили через нос самкам и сампам крыс в позе 0,25 мг/мл в день в течение 14 дней, Все крысы выжили и после их смерти не было обнаружено никаких гистологических ненормальностей,При примс ненни с целью достижения антивирусного эФфекта в присутствии клеток хозяина комплекс пли соепинение давали хозяин в концентпацип, близкой к концентрации вируса, от 0.003 до 0.25 мг/мл, Допстимоппименение через нос или горло в дозах от 0,02 до О,1 мг 3 - 6 раз в день. Для взрослых люлей это эквивалентно дневной внутренней дозе от 2 до 20 мг.Фармацевтические препараты могут быть изготовлены в Форме таблеток, лепешек, капсул, носовых капель, жидкостей для впрыскивания в нос или горло, аэрозолей и,пи жидкостей для ингаляции; их можно приготовлять обычными способами с добавкой обычных индифферентных компонентов.Предпочтительными являются композиции, обеспечивающие антивируснчю концентрацию комплекса или соединения в тех органах хозяина, в которых обычно произрастают риновирсы, например на слизистой оболочке носа или горла, при непосредственном нанесе1,00второстепенных нии а указанные места или косвенно путем образования достаточно высокой концентрации комплекса илп соединения в крови после приема внутрь.К таким предпочтительным композициям для непосредственного нанесения (например, в форме лепешки, которая медленно растворяется во рту и смачивает рот и связанные с ним пути раствором активного ингредиента) относятся композиции для ингаляции носа или горла в виде растворов антивирусного комплекса или соединения в фармацевтически допустимой жидкости, котор ая при ингаляции отлагается в носовых проходах и горле, а также композиции для приема внутрь, например, таблетки.Эти таблетки или лепешки содержат от 0,05 до 5 мг ангивирусного соединения; для профилактики или лечения вирусной инфекции таблетки принимают от 3 до 6 раз в день,Состав для впрыскивания в нос или горло содержит от 0,01 до 1 мг антивирусного соединения в 1 мл раствора, и для профилактики или лечения рииовирусной инфекции 0,1 мл такого раствора впрыскивают в нос ичи горло 3 - 6 раз в день.Комплекс, соединения или композиции можно применять профилактически для людей, которые могут соприкасаться с носителями риновирусной инфекции.П р и м е р 1. Готовят питательную среду следующего состава (г):Нитрат натрия 2,00 Первичньш кислый фосфат калия 1,00 Семиводный сульфат магния 0,50 Хлорид калия 0,50 Семиводный сульфат железа 0,01 Декстроза (Церелоза) 50,00 Дрожжевой экстракт (Оксоид) 1,00 Концентрат второстепенных элементовЗатем готовят концентратэлементов, содержащий (г):Семиводный сульфат железа 1,00 Пятиводный сульфат меди 0,15 Семиводный сульфат цинка 1,00 Четырехводный сульфат марганца 0,10 Молибдат калия 0,10 Его растворяют в дистиллированной воде сдобавлением концентрированной соляной кислоты в количестве, достаточном для получения прозрачного раствора, и разбавляют дистиллированной водой до 1 л.К питательной среде добавляют 10 н. раствор гидроокиси калия до рН 5,8 и автоклавируют при давлении 0,7 кг/см 25 мин.Ягодезгп 1 цт йчегзцгп С.М,1,102519 выращивают при 25 С в поверхностной культуре в 90 бутылках Томпсона, каждая из которых содержит 1 л питательной среды. Продукт сооирают через 35 дней, и фильтрат культуры (70 л, рН 6,5) экстрагируют толуолом (2 раза по 14 л) . Объединенные экстракты высушивают безводным сульфатом натрия и выпарп.вают при 60 С/20 мм. Остаток (7,1 г) промы б 0 б 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8вают петролейным эфиром (т. кип, 60 - 80 С, 4 раза по 25 мл), промывную воду отбрасывают и получают антивирусный комплекс.П р и м е р 2, Антивирусный комплекс двух опытов примера 1 объединяют (6,52 г) и разделяют на 2 равные части. Каждую часть отдельно фракционируют на хроматографических колонках.Через верх колонки добавляют экстракт вминимальном объеме смеси эфира и этилацетата (3:2), и колонку проявляют той же смесью растворителей до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет основания колонн.Каждую колонку разрезают на шесть равныхсекций, объединяют равноценные секции двухколонн и элюируют смесью этилацетата и метанола (97: 3) 3 раза по 500 мл,При выпаривании растворителей получают6 фракций; 1-я фракция наименее полярнаяи 6-я фракция наиболее полярная. Фракции1 - 3 отбрасывают, фракция 4 содержит Сиродесмины А и С совместно с менее полярнымпродуктом, фракция 5 содержит СиродесминыА, В и С совместно с нежелательным продуктом; фракция 6 содержит Сиродесмины Всовместно с основным продуктом.Фракции 4 - 6 дополнительно разделяют методом хроматографии в тонком слое на силикагеле 6, Р. Для проявления используют следующие смеси растворителей: 1 - этилацетат и толуол (2: 1), 11 - муравьиная кислота, метанол и хлороформ (1: 4: 95). Разделенные продукты выделяют при элюировании полос смесью этилацетгта и метанола (97: 3).При разделении хроматографией в тонкомслое фракции 4 сухой колонки (780 мг, 8 пластин, растворитель 1) получают фракцию (а)92 мг (главным образом Сиродесмин А) ифракцию (б) 165 мг (главным образом Сиродесмины А и С). При дополнительном разделении фракции (а) тем же методом (однупластину проявляют дважды, растворитель 11)получают фракцию (в) (43 мг, СиродесминА). При дополнительном разделении фракции(б) (2 пластины проявляют дважды, растворитель 11) получают фракцию (г(36 Л мг,Сиродесмин А и следы Сиродесмина С) ифракцию (д) (65 мг, Сиродесмин С. загрязненный следами Сиродесминов А и В).При разделении тем же методсм фракции 5сухой колонки (716 мг, 8 пластин, растворитель 1) получают фракцию (е) (296 мг, главным образом Сиродесмины А и С), при дополнительном разделении которой (6 пластин,растворитель П) получают фракцию (ж)(63,4 мг, главным образом Сиродесмин А) ифракцию (з) (146 мг, главным образом Сиродесмин С). Фракции (г) и (ж) объединяют и дополнительно разделяют (2 пластины проявляют дважды, растворитель 11) и получают фракцию (и) (37 мг, Сиродесмин Л). Фракции (в) и (и) объединяют и растворяют в бензоле (2 мл), а затем по каплям добавля,отк перемешиваемому раствору для осаждения твердого Сиродесмина А (68 мг).Фракцию (з) дополнительно разделяют (1 пластину проявляют дважды, растворитель 11) и получают фракцию (к) (68 мг, Сиродесмин С, загрязненный небольшими следами Сиродесминов А и В). Фракции (д) и (к) объединяют, растворяют в этилацетате (2 мл) и выделяют твердый Сиродесмин С (60 мг) при осаждении петролейным эфиром.При разделении тем же методом фракции 6 сухой колонки (6 пластин, растворитель 11) получают фракцию (л) (193 мг, масло, Сиродесмин В), из которой при обработке смесью бензола и петролейного эфира получают твердый Сиродесмин В (113 мг).П р и м е р 3. Антивирусный комплекс (2,5 г), полученный из 90 л сброженного продукта, обрабатывают в безводном пиридине (50 мл) хлористым тионилом (5,0 мл) 15 мин при 0 С. Затем добавляют к смеси льда с водой (500 мл) и выдерживают дополнительно 15 мин. При добавлении 2 н. серной кислоты устанавливают рН 2 и экстрагируют хлороформом (3 раза по 500 мл). Экстракты высушивают над сульфатом натрия и концентрируют до получения масла (1,43 г), которое высушивают в сухую колонку силикагеля (430 г), приготовленную следующим образом: колбу емкостью 2 л, содержащую силикагель (1 кг, силикагель 1 Ч.Г.С. фирмы Хопкин и Виллиам) и воду (120 мл), вращают при комнатной температуре 2 час. Затем добавляют смесь этилацетата и толуола (2: 1) 112,5 мл, и колбу вращают еще 3 час. Колонку проявляют смесью винилацетата и толуола (2: 1) и разделяют на 9 частей, каждую из которых элюируют смесью этилацетата и метанола (97: 3) - 3 раза по 500 мл. Фракции, содержащие Сиродесмин А, объединяют и разделяют методом хроматографии в тонком слое (силикагель С.Г., этилацетат: толуол=2; 1) и получают чистый Сиродесмин А в виде масла (218 г).Вторую партию промытого петролейным эфиром толуольного экстракта из 90 л перебродившего бульона обрабатывают таким же способом, и два образца Сиродесмина А (всего 505 мг) объединяют и растворяют в бензоле (5 мл), Твердый Сиродесмин Л (358 мг) выпадает в осадок из раствора при добавлении по каплям петролейного эфира (т. кип.60 - 80 С) .П р и м е р 4, Сиродесмин В (50 мг) в безводном пиридине (1,0 мл) обрабатывают хлористым тионилом (О,1 мг) в течение 12 мин при 0 С, добавляют смесь льда с водой (25 мл) и выдерживают 15 мин. При добавлении 2 н. сепной кислоты устанавливают рН 2 раствора, который затем экстрагируют хлороформом (3 раза по 20 мл). Экстракты высушивают над сульфатом натрия, концентрируют до получения масла (29,4 мг), состоящего в основном из Сиродесмина А, но содержащего следы Сиродесминов В и С. Сырой продукт очищают методом хроматографии в тонком слое на силикагеле С.Г. (растворитель муравьиная кислота - метанол - хлороформ 1:4:95) и получают Сиродссмин А в виде 5 масла (12,5 мг).П р и м е р 5. Сиродесмин С (5,0 мг) в безводном пиридине (0,1 мл) обрабатывают хлористым тионилом (0,01 мл) в течение 10 мин при 0 С, добавляют к смеси льда с водой 1 О (5 мл) и выдерживают 15 мин. При добавлении 2 н. серной кислоты устанавливают рН 4 и экстрагируют хлороформом (3 раза по 5 мл. Экстракты высушивают над сульфатом натрия, концентрируют и получают Сиродес мин А в виде масла (4,3 мг).П р и м е р 6. Проводят реакцию Сиродесмипа А (250 мг) с уксусным ангидридом (6,25 мл) в безводном пиридине при комнатной температуре в отсутствии света в течение 20 1 недели, а затем реакционную массу обрабатывают водой (1,25 мл) в течение 1 час при температуре 5 С. При добавлении 2 н. серной кислоты устанавливают рН 2, разбавляют водой и экстрагируют этилацетатом (4 раза по 25 50 мл), Экстракты высушивают над сульфатом натрия и концентрируют до получения масла (280 мг), которое очищают на силикагеле методом хроматографии в тонком слое растворитель муравьиная кислота - мета- ЗО нол - хлороформ 1: 4: 95).Полученный основной компонент дваждыперекристаллизовывают из смеси этилацетата и петролейного эфира и получают бисацетат Сиродесмина А в форме игл светло-желзэ того цвета (127 мг; т, пл. 186 - 189 С.П р и м е р 7. Раствор Сиродесмина А (50 мг)и серы (15 мг) в пиридине (2 мл) выдержи вают при комнатной температуре в темноте 24 час, а затем выпаривают досуха при тем пературе 35 С. Сиродесмины А, В и С получают при хроматографии - в тонком слое остатка (1 пластина силикагеля С.Р., 40 К 20 К ;",1 см, растворитель этилацетат - толуол 2: 1).4- Г 1 ри мер 8. Культуру, выращенную, какописано в примере 1, собирают через 28 дней и фильтрат (70 л) экстрагируют хлороформом (2 раза по 14 л), высушивают над безводным сульфатом натрия, выпаривают при по ниженном давлении и получают антивирусный комплекс, Взболтав толуол, метанол, хлороформ и воду при объемном соотношении 9: 9: 4: 4, получают двухфазную систему (верхчюю и нижнюю). Полученный ранее комплекс (15 г) растворяют в нижней фазе (300 мл), и этот раствор, а затем две дополнительные порции (300 мл) нижней фазы взбалтывают с верхней фазой (2 раза по 100 мл). Объединенные нижние фазы (900 мл)60выпаривают досуха и остаток растворяют в нижней фазе (100 мл) второй двухфазной системы, приготовленной при взбалтывании петролейного эфира (т. кип. 60 - 80 С), толуола, метанола и воды при объемном соотношенин 2: 3: 4: 1. Этот раствор и вторую порцию нижней фазы второй двухфазной системы (100 мл) взбалтывают с верхней фазой (2 раза по 100 мл), и объединенные нижние фазы (200 мл) выпаривают досуха. Остаток (10 г) хроматографируют на дезактивном силикагеле (850 г), и элюированные фракции дополнительно очищают многократной хроматографией в тонком слое на силикагеле С.г.П р и м е р 9. К раствору очищенного комплекса (11 г), полученного как описано в примере 8, при разделении растворителями в пиридине (30 мл), добавляют холодный раствор двуокиси серы в гиридине. После выдержки в течение / час при комнатной температуре реакционную смесь выливают на лед и при добавлении 2 н. соляной кислоты (410 мл) устанавливают рН 2. Смесь экстрагируют хлороформом, экстракт промывают, высушивают и выпаривают. Получают остаток (8,9 г), который хроматографируют на дезактивном силикагеле.Фракцию 2 очищают хроматографией в тонком слое на силикагеле С.Р., вначале применяя хлороформ - метанол - муравьиную кислоту (95; 4; 1) в качестве растворителя для выделения фракций с высоким и низким К.Фракции с низким К дополнительно очищают хромотографией в тонком слое, применяя этилацетат - хлороформ (7: 3) в качестве растворителя, и получают Сиродесмин 1,Фракции с высоким К, очищают хроматографией в тонком слое с применением в ;.ачестве растворителей хлороформа - метанола - муравьиной кислоты (95: 4: 1), а затем толуол - метилацетат (1: 2) для получения Сиродесмина 6.Фракции 5 и 6 объединяют, хроматографируют на колонке дезактивированного силикагеля (288 г) хлороформом и получают Сиродесмин А.П р и м е р 10. Остаток из хлороформенного экстракта, описанный в примере 9, (4,46 г) растворяют в метаноле (400 мл), содержащем концентрированную соляную кислоту (4 мл), и раствор выдерживают 40 час при комнатной температуре. Затем этот раствор выпаривают до 35 мл и добавляют воду (35 мл). Смесь экстрагируют смесью петролейного эфира (т. кип. 60 - 80 С) и толуола (2: 3, 2 раза по 20 мл). Экстракты и часть нерастворимого вещества отбрасывают. Остальную водную фазу экстрагируют хлороформом, хлороформ испаряют и остаток разделяют на равные части.Одну часть (1,15 г) хроматографируют надезактивированном силикагеле. Остаток 3 фракции перекристаллизовывают из ацетона и получают дезацетилсиродесмин А, т, пл, 199 - 201 С. Другие части сырого продукта кристаллизуют из ацетона и получают дезацетилсиродесмин с температурой плавления 198 в 2 С.П р и м е р 11, К питательной среде, приготовленной, как описано в примере 1, добавляют гидроокись калия в виде 10 н. раствора до рН 5,6 и автоклавируют при давлении0,7 кг/см 25 мин. Ягодезгпшгп йчегзпгпС. М. 1.102519 выращивают при температуре25 С в конических колбах, содержащих по5 150 мл среды, на вращающемся устройстве.Через 4 дня 12 мл бульона используют дляинокуляции дополнительного количества колб,содержащих такое же количество той же среды. Через 12 дней роста в указанных условиях1 О собирают урожай. Установив рН 6,0, фильтрат (50 мл) дважды экстрагируют половинным объемом хлороформа. Объединенные экстракты выпаривают и получают антивирусный комплекс,15 Пример 12. Ягодезппцт йегзшп С.М.1.102519 выращивают при температуре 25 Сна вращающемся приспособлении; каждаяколба содержит 1 л питательной среды, приготовленной, как описано в примере 11,20 Через 3 дня 3 л бульона используют дляинокуляции 30 л питательной среды следующего состава (г):Глицерин 40,00Нитрат натрия 2,21Первичный кислый фосфат калия 5,00Семиводный сульфат магния 1,00Дистиллированная вода До 1,00 (л)Питательную среду автоклавируют при давлении 1,05 кг/см в течение 25 мин, рН средыне устанавливают; рН стерилизованной среды - 4,9.Среда содержится в стеклянном и из нержавеющей стали бродильном чане. В последнийподают стерильный воздух со скоростью15 л/мин, и содержимое перемешивают турбинной мешалкой со скоростью 380 об/мин безприменения перегородок. При необходимостидобавляют противовспениватель пропилеягликоль 750.4 О Через 15 дней устанавливают рН 6,0 (вме -сто бывшего 6.7), фильтрат бульона экстрагируют хлороформом, затем хлороформ испаряют и получают антивирусный комплекс.П р и м е р 13. Раствор Сиродесмина А45 (0,083 г) в метаноле (100 мл), содержащийконцентрированную соляную кислоту (1 мл),выдерживают в темноте при комнатной температуре 4 дня, а затем выпаривают досухапри температуре ниже 20 С. К остатку добавляют метанол, и раствор выпаривают до удаления следов НС 1. Остаток очищают хроматографией в тонком слое на силикагеле С,Р.,применяя хлороформ - метанол - муравьинуюкислоту (95: 4 1) в качестве растворителя, и55 после перекристаллизации из смеси этилацетата и петролейного эфира получают дезацетилсиродесмин А с температурой плавления198 в 2 С.П р и м е р 14, Раствор Сиродесмина А(0,15 г) и трифенилфосфина (0,078 г) в хлороформе выдерживают 4 час при комнатнойтемпературе и выпаривают досуха. Остатокочищают методом хроматографии в тонкомслое на силикагеле С.)."., применяя хлоро 65 форм - метанол - муравьиную кислоту вПредмет изобретения Составитель С. МалютинаРедактор Н. Спиридонова Техред Т. Миронова Корректоры: Е, Рожкова и Л, ДенискинаЗаказ 674,13 Изд.1874 Тираж 529 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4(5Типография, пр. Сапунова, 2 качесзве растворителя, и получают моносульфид Сиродссмина в форме геля. При осаждении его из раствора в этилацетате петролейным эфиром получают бесцветный порошок.Пример 15. Сиродесмин С (0,1 г) раство ряют в метаноле (100 мл), содержащем концентрированную соляную кислоту (1 мл), и раствор выдерживают в течение 3 дней при комнатной температуре в темноте. Остаток, полученный после отгонки растворителя, очища ют методом хроматографии в тонком слое на силикагеле С.Г., применяя метанол - хлороформ в качестве растворителя для проявления, и после перекристаллизации из ацетона получают дезацетилсиродесмин С с температурой 15 плавления 195 - 196,5 С,Пример 16. Сиродесмин б (0,044 г) растворяют в смеси пиридина (2 мл) и уксусного ангидрида (1 мл), и раствор выдерживают в темноте при комнатной температуре 9 дней. 20 Затем раствор охлаждают на соленом льду, добавляют холодную воду (0,4 мл), и смесь выдерживают 4 час. После добавления 3 н. серной кислоты (60 мл) смесь экстрагируют этилацетатом (3 раза по 25 мл), и объеди ненные экстракты промывают водой (50 мл), 5%-ным раствором бикарбоната натрия (2 раза по 50 мл) и снова водой (50 мл), Органический слой выпаривают, остаток перекристаллизовывают из смеси этплацетата и петролейного эфира и получают бисацетат Сиродесмина 6; т. пл. 159 - 159,5 С.П р и м е р 17. Приготавливают раствор для пульверизации в полость носа, содержащий следующие компоненты (мг):Сиродесмин А 6 Тимерозал 2 Метиловый эфир параоксибензойнойкислоты 80Пропиловый эфир параоксибензойнойкислотыФосфат натрияДинатриевая соль ЭДТКДистиллированная вода (безпир огенов) До 100 (мл) Способ получения противовирусного комплекса, отличающийся тем, что культуру грибка штамма Ягодезгп 1 цгп йегзпгп С. М.1.102519 выращивают на среде, содержащей источники углерода и азота, экстрагируют фильтрат культуральной жидкости не смешивающимися с водой органическими растворителями, например хлороформом, высушивают экстракт и при необходимости фракционируют на активные компоненты,