Способ получения квадрациклического лактона, обладающего противоопухолевой активностью

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспубиик1969140 6 ) Дополнительн 22) Заявлено 30 .публикован и вткрыт 72) Авторы изобретени Гей Иностранна(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КВАДРАЦИКЛИЧЕСКОГО ЛАКТОНАОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ кислоепродукт химиконоситсяпромышлея лекарс ности ивенных т пр является и ого лактон ес ни рм ф0 евой акобладающего противоопух тивностью.Цель достигается тем Азрегд 11 оз еггепз МРР тивируют в азробных глу виях при, 22-30 С в тече в питательной среде, со углевод, белковую основ Кония 25-50 диамет"-5 ко-.орме,признаки олбообраз ородная иголовы с еричны по елости ста что штамм 11156 кул инных усло ие 4-15 су овятся ще ер Изобретение о Фармацевтической касается получен препаратов.Целью изобрет че е квадрацикл фо улы та опубликования описания 23, 10,Иностранцы н Калтон, Иарлин Альвин Эсп Ричард Лес Раниерилезо, и выделяют целевоз культуральной жидкостом. культивирование прово5 С в течение 12 сут. 5Штамм Аврег 911105 1 еггепз, используемый для получения квадрациклического лактона выделен из образца почвыиз Типперари, Северная территория, 1 о Австралия и хранится в коллекцииСельскохозяйственной научно-исследовательской службы США, Отделениепо научным исследованиям и развитиюдля использования в северных райот 5 нах Министерства земледелия СШАг.Пеория, шт.Иллинойс под номеромЙРР 11156. Иорфологически диальная голова с х 100-175. мкм, од ру. Очень молоды нидиями, в цепи, с с приближением зр столбообразными.3 969140Конидиофоры гладкие 4-5 И х 150200 И,Пузырьки диаметром 7-17 мкм, сферичные, некоторые со слегка грушеобразным контуром.5Стеригмы имеют размер первичнойсерии 5-6 х 2-3 мкм, Форма пузырьковая,Конидии сферообразной формы сгладкой стенкой, диаметр 2-2,5 мкм. 10Культуральные признаки после 8дней роста при 25 С:замачивающий водяной агар:размерколонии 30-35 мм, коричневато-желтоlго цвета; 15картофельно-декстрозный агар:размер колонии 25-40 мм, коричневато-желтого цвета;декстрозный агар Сабуро: размерколонии 50-60 мм, желтовато-коричневого цвета;солодово-дрожжевый агар: размерколонии 40 мм, желтовато-коричневогоцвета.Способ осуществляют следующим образом.Штамм А 5 регп 111 цз йеггепз МВЮ 11156культивируют в аэробных глубинныхусловиях при 22-30 С в питательной среде, содержащей углеводбелковую основу .и сернокислое желе 5зо. силикагеля и другими системами раст 25 ворителей аминокислоты и другиесоединения, содержащие азот ).Ферментация .проходит в аэробныхглубинных условиях,Микроорганизмы в ходе ферментацииЭв в водной среде находятся в суспензированном состоянии. При аэробнойферментации, сбраживаемая среда перемешивается для введения в нее воздуха. Это достигается как простымперемешиванием, так и барботироваЭ 5нием воздуха. Воздух перемешиваютот 100 до 400 об/мин. Воздух можнопродувать через культуральную жидкость в количестве 0,025-1 объемавоздуха в 1. мин на 1 объем среды,40т,е. коэффициент аэрации соответствует 0,025:1, Скорость аэрацииможно увеличить для того, чтобыдобиться максимального выхода.Квадрациклический лактон выделяютиз культуральной жидкости посредством экстрагирования растворителями, например н-бутанолом, хлороформом, этилацетатом, диэтиловым эфиром и тетрагидрофураном.5 ЬПосле экстрагирования квадрациклический лактон отделяют от экстракта известными способами, напримерэкстракт можно,.упаривать досуха илактон можно повторно растворить икристаллизовать из метанола водыили других систем растворителей ),можно использовать и другие системы,Подходящими источниками углеводов являются меласса, кукурузная патока, глюкоза, сыворотка, растворимый крахмал из кукурузы, картофеля, соя и другие бобовые ), кассава, бананы и зерно.Подходящими источниками азотсодержащих питательных веществ являются протеины, например, содержащиеся в муке соевых бобов, кукурузы, зерна и семян хлопка, отрубях, дрожжевых экстрактах, мясных экстрактах 1,из говядины, свинины, рыбы, курицы), рыбной муке, молочных продуктах казеина снятого молока) и в их продуктах распада.Кроме метода экстрации растворителем применяют и другие методы для того, чтобы выделить лактон из культуральной жидкости. Можно, например, пропускать культуральную жидкость церез макромолекулярную полистирол) дивинилбензоловую смолу. Примером такой смолы является ХЯДс пористостью по гелию 40 об удельной поверхностью 300 м /г и средним диамет 2 ром пор приблизительно 90410 в см.Лактон сорбируется поверхностью смолыпосле чего его удаляют посредством десорбции низшими цпйртами, например, метанолом или водометанольными растворами.Квадрациклический лактон можно выделить методом тонкослойной хроматографии, Лактон может быть обнаружен методом использования модифицированного реагента, проявляющегосветлое желтое пятно с Вт = 0,6-0,7,После этого экстракт лактона в растворителе подвергают хроматографиина пластинке силикагеля. Кристаллылактона получают вымыванием метанолом или аналогичными растворителя.- . ми) из кремнезема и последующего выпаривания метанола до получениянасыщенного раствора. Раствор подвергают медленному охлаждению,. втечение которого образуются кристаллы.Лактон можно вымывать из пластинокВо время обеих стадий инкубирования используют достаточное количество . блок-.сополимера оксиэтиленого оксипропиленового ("Р 10 гоп 1 с Р 1.-61") для того, чтобы свести пенообразование до минимума. Как правило, количество поверхностно-активного вещества составляет 0,154. На второй стадии инкубации бульон непрерывно перемешивают со скоростью 350 об/мин, Кроме того, через бульон продувают воздух в количестве приблизительно 2 л/мин. 5 96914например этанол ( вода, метанол, этанол, хлороформ ), циклогексан, циклогексан или этилацетат, например, этанол или хлороформ.Кристаллы могут быть получены и Вдругими методами, например экстрактметанола может быть выпарен, а полученный материал повторно растворяютв системе метанол/вода с последующим охлаждением для образования 16кристаллов.Квадрациклицеский лактон, полученный предлагаемым способом, представляет. собой вещество с молекулярным весом 248,14 18, определенный 1масс-спектральным методом, Это соот-.ветствует эмпирической формуле15 20 3Инфракрасный спектр показываетадсорбцию при 1745 см ", что указывает на присутствие пятицленного кетона или-лактона, и при 1390 и1375 см ", что указывает на присутствие двойной диметиловой группы.Ультрафиолетовый спектр лактона показывает слабую абсорбцию при 280 нм.Протоновый спектр ЯМР подтверждает присутствие двойной диметиловойгруппы с двумя 3-протонными синглетами при 6 1,24 и 1,28. Двух-,однопротон- цный дуплет дуплетов, центрированныхпри с 4,23 (,1 = 12,5 Гц ) и 4,65- 12,1 Гц ), характерны для неэквивалентных протонов метилена, примыкающих к о-лактоновому кольцу.П р и м е р 1. Производство квадрациклицеского лактона,Лиофилизованный образец Азрегц 11-,10 з еггецз(ЙМНо 11165) растворяютв 2 мл 24-ного раствора солодовогоэкстракта. Полученную суспензию намазывают на поверхность косого картофельно-.декстрозного агара, размером 16 х 125 мм, и подвергают.инкубации при 30 С в течение 7 дней, По 43лученную культуру суспендируют в10 млводы с тем, чтобы получить суспензию, содержащуюоколо 10 ф 101 О спор/мл. 20 мл приготовленнойсуспензии используют для того, чтобы их инокулировать .в 1 л среды,находящейся в цетырехлитровом сосуде. Состав среды следующий, г/л:Глюкоза 40Мука хлопковых семян 3ИМука из ростков кукурузы 1Масляная мука из сои 1КНРО 1МОЬО 7 НП 1 0Ре 50 7 НО 0,01 СаСОз 10 йаС 1 0,5 К этой среде добавляют достаточно. деионизированной воды для того, чтобы получить 1 л бульона. После инокули- рования бульон подвергают инкубации при 250 С в течение 3 дней при постоянном перемешивании(250 об/мин ).2 л этого бульона используют для инокуляции 20 л бульона. При этом мукой из кукурузных ростков или соевой мукой не пользовались, а количество Ге 04 7 НО сокращено до 0,001 г/л, Таким образом,единственным источником азота является мука .из семян хлопка, рН бульона устанавливают равным 6,9-7,1 и инкубируют при 25 оС, Через 7 дней конечный рН составляет 6,0-6,5Кроме того, бульон содержит 0,5-2 вес.Ф глюкозы.П р .и м е р 2. Выделение квадрациклического лактона..Фильтруют 20 л выработанного бульона для того, чтобы удалить мицелиальную массу ( около 1 л ). В фильтрат вводят 4 равные части н-бутанола в объемном отношении 4: 1, Таким образом, лактон, раствореннный в н-бутаноле,выделяют из среды; после соединения экстракты в н-бутаноле упаривают досуха над водяной баней при 40 С (приблизительно 1 мм/Нопосредствам тонкопленочного роторного испарителя. Полученную смолу рас" тирают с 0,5 л хлороформа, который затем отгоняют с паром. В результате получают густое коричневатое масло, Это масло растворяют в смеси метанола и воды, из которого кристаллизуют кристаллы лактона с помощью затравки. Используя описанную методику, выход лактона составляет примерно 0,2 мг/мл исходного Ферментативного бульона.формула изобретения О. обладающего про ностью о т л тем,.что штамм ййй 1. 11156 куль глубинных услов течение 4-15 дн среде, содержащ основу и сернок ляют целевой про жидкости.2. Способ по щ и й с я тем, проводят при 25 левой активи й с я з Сеггепз аэробныхтивоопухоч а ю щзрегп 111ивируютях при 2й в питай углевослое желдукт из и м е р 5. Активно вых клеток,чают опухолевые нос человека, известные клеток КВ. КВ-клет и инокулируют с раз лактона согласно иэ е. Установлено, что г/мл. В соответстви экспериментальной м П р опухол Пол клеткиоглоточныепод. наи культиичными естной Юро рас опи- тодикой звание вируют "дозами методи на 1,3 п.1,что кС в т л и ч а ютивирование ние 12 дней нно ИПИ Заказ 8195/8 аж 714 Подписное иал ППП "Патент", г. Ужгород, ул.Проектная 7 96 Дальнейшая перекристаализация иэ метанола/воды дает продукт максймальной чистоты, При этом выход квадрациклического лактона в этих случаях превышает 0,1 мг/мЛ.П р и м е р. 3. Выделение лактона методом препаративной тонкослойной хроматографии.Коричневое масло из примера 2 на,носят полосами на силикагелевую пластину размером в 20 х 20 мм (толщиной 1 мм ). В качестве проявителя применяют хлороформ/метанол в отношении 9: 1. Проявление производят при комнатной температуре. Визуализацию про водят смесью п-анисальдегида, серной кислоты, уксусной кислоты и этанола (в пропорции 0,5:0,5:1:9), которая наносится распылителем при нагреве до 43 ОС (110 чГ) до тех пор, пока не достигают максимальное проявление всех цветов. При проявлении лактон образует яркое желтое пятно. Затем лактон выделяют с помощью других пластин, применяя известный метод.Лактонвыделяют из силикагелевых пластин посредством суспензирования соскобов в метаноле, фильтрования, упаривания досуха с последующей кристаллизацией из метанола/воды. Повторную кристаллизацию из метанола/воды осуществляют, по крайней мере, один раз. Выход лактона при использовании метода тонкослойной хроматографии достигает не менее 0,01 мг/мл.П р и м е р 4. Токсичность квадрациклического лактона.Кристаллы квадрациклического лактона суспендируют в карбоксиметилцеллюлозе (10 мг в 1 мл ) и делают инъекции мышам при различных дозах. Дозы до 340 мг на 1 кг веса животного не вызывают смертельного эффекта.сть против 9140 8установлено, что дозы в 4 мкг/мли меньше оказываются активнымипротив опухолевых клеток.П р и м е р 6. Исследования противоопухолевой активности квадрациклического лактона проводят с мышами (штамм ВДГ; самки 18-22 г,группы по 10 животных для каждойдозы вместе с контрольной группой 10 той же численности ) с,легочной карциномой Льюиса, Квадрон растворяютв диметилсульфоксиде (в качественосителя) и полученный раствор вводят в брюшную полость раз в день, И начиная со дня после имплантацииопухоли. Экспериментальной группеживотных назначенную дозу дают. разв день в течение 9 дней. Установлено, что в дозах, превышающих .26 3,0 мг/кг, препарат активен. Предлагаемый .способ позволяетполучить квадрациклический лактон,обладающий противоопухолевой актив 25 ност ью е 1, Способ получения квадрациклического лактона .формулыМО