Способ определения активности интерлейкина 2

имеет активность 350 ед. Препарат 2повьппающий пролиферацию ФГА - стимулированных лимфоцитов, обработанных ДМ, до 837 имеет активность 600 ед,Все остальные варианты опытов, указанные в табл, 1-4, являются контрольными,. Вариант 1 (клеткн + этанол) показывает пролиферацию клеток в условиях опыта (дексаметазон растворен в этаноле). Вариант 2 показывает действие гормона на нестимулированные лимфоциты, Вариант 4 (клетки + фФГА + ДМ) показывает действие гормона на ФГА - стимулированные лимфоциты (28,5, 28 и 36% - подавлениепролиферации).По отношению к варианту 4 рассматривается действие исследуемого образца: в случае активного препаратапроцент опыта должен быть вьппе контрольного варианта 4 (51 против 28,5%в табл, 1, 94 и 97% против 287 втабл. 2, 69 и 837. против 36% в таблице 3).Варианты 5 и 6 (также контрольные)показывают действие исследуемого образца на нестимулированные и ФГА настимулированные лимфоциты,В табл, 5 приводятся результатытипичного опыта по тестированию наактивность интерлейкина 2 в плазмеонкологического . больного. Плазмаполучена при плазмофорезе, и центрифугирована при 2000 об/мин в течение30 мин при 4 фС,Таким образом, усиление пролиферации клеток образцом по сравнению с обработанными гормонами, свидетельствует о наличии в образце плазмы крови активного интерлейкина 2.Для анализа пробы, известным способом необходимо внесение достаточно большого количества образца (100- 300 мкл), для анализа пробы предлагаемым способом требуется не более15 мкл исследуемого препарата, чувствительность при этом возрастает на порядок,Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность и упростить способ определения активности интерлейкина 2 за счет известному способу),Формула и э о б р е т е н и яСпособ определения активности интерлейкина 2, включающий культивиро 3 1644036 аДля теста необходимо 3-15 мкл ис- следуемого образца.П у и м е р. Из периферическойкрови человека выделяют лимфоциты исуспендируют их в среде КРМЕ - 1640,содержащей 10% ТЗС, 2 10М,Е,-глютамина, 10 мМ НЕРЕЯ и 100 ед. пеницил-,лина и 100 мкг стрептомицина на 1 млсреды концентрации 1-510 клеток10в 1 мл.В каждую лунку 96-луночных плоскодонных пластин вносят по 200 мклподготовленной клеточной суспензии,ДМ (5104 М Зцрпа) разводят967,-ным этанолом, конечная концентрация 10 М, ФГА используют в стандартной концентрации, применяемой дляреакции бластотрансформации лимфоцитов.20В определенной последовательности(ФГА, итерлейкин 2, ДМ нли спирт)добавляют реагенты в необходимыелунки по схеме:клетки + 2 мкл этанола;25клетки + 2 мкл ДМ;клетки + 2 мкл ФГА;клетки + 2 мкл ФГА + 2 мкл ДМ;клетки + 1-5 мкл образца;клетки + 2 мкл ФГА + 1-5 мкл об-.30раэцарклетки + 2 мкл ФГА,+ 1-5 мкл об,разца + 2 мкл ДМ,Тестирование проводят.в 2-3 параллельных пробах,Клетки инкубируют в течение 72 чпри 37 пС и 5% СО,. За 6 ч до окончанияинкубации в каждую лунку добавляют1 мкКю метил- Н-тимидина. Клетки со- ФГА стимулированными лимфоцитами,бирают на фильтры из стекловолокнатипа ОРС с помощью прибора для полу 40автоматического сбора клеток (СеПНатчеайег, Р 1 оМ).Фильтры высушивают и помещают вофлаконы содержащие 5 мл сцинтилляУ45циониой жидкости (4,0 г РРО и 0,2 г,РОРОР в 1 л толуола). Радиометрию.образцов проводят в жидкостном сцинтилляционном -счетчике, определяяколичество импульсов в 1 мин (срш).Результаты опыта представлены втабл. 1-3.По данным табл. 1 и 2 можно построить калибровочный график (табл. 4).Тогда количество интерлейкина 2 в пре- исключения культуры клеток СТЕЕ, (попарате можно выразить в единицах активности. Так препарат 1, повьппающий. Реаг срш ан 7741 МОЗ46714608384182 ф 1154109493 ф 825 Уф10038+928 2 3 4 10 52 Ва гент срш 9050+7156790+720400254+87765111358+31981 Клетки + этанолКлетки + ДМКлетки + ФГАКлетки + ФГА + ДМКлетки + образец:1000 ед2500 едКлетки + ФГА + образец;1000 ед,2500 ед,Клетки + ФГА + образец:1000 е2500 е 4 31163 13122 36360+5788 399319 й 2234 379747+3303 374359+57705д. + ЛМ 388895 Ю 6005 ффайф соответствует соответствует соответствует соответствует 007,8 Х.43.7 Х. значение+ образец: Клетки Клетки Клетки Клетки Клетки 4 препарат 1 12116 ф 1508 препарат 2 17539947 ванне клеток, вьщеление контрольного и опытного образцов, добавление в опытный образец пробы с интерлейкиЮ ном, внесение в оба образца метилтимидина, определения содержания ин терлейкина 2 по уровню радиоактивно ти в опытном образце в сравнении с контрольным, о т л и ч а ю щ и й с тем, что, с целью упрощения способа при одновременном повьппении чувствительности, в качестве клеток используют свежевьщеленные лимфоциты периферической крови человека, стиму лированные фитогемагглютинином, а в опытный образец, содержащий интер лейкин, дополнительно вносят декса метазон в концентрации 10 М. Клетки + этанолКлетки + ДМКлетки + ФГАКлетки + ФГА +Клетки + образКлетки + ФГА +разецКлетки + ФГА +разец + ДМ.с Активность интерлейкина 2,Ж от контроля срш 300350600513 693 833 943 110834 й Составитель Н.ГуляеТехред Д. Олийнык о екто Л.Беск дакторН,Гунько К рр р ид Подписноеениям и открытиям при ГКНТ Ская наб., д. 4/5 Производственно-иэдательский комбинат "Патент", г.ужгор агарина, 101 тивность интерлей 20 на 2, ед. активсти стандартного препарата Закаэ 1237 Тираж 416ВНИИПИ Государственного комитета по иэоб113035, Москва, Ж, Ра КлеткиКлетки + ДМКлетки + ФГАКлетки + ФГАКлетки + ФГАраэец + ДМ 5239804042 ф 554113718 ф 324383467+5980