Способ определения интерлейкина-1 моноцитов человека

(51)5 6 01 М 33 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР В Оо ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ КОМУ СВИДЕТЕЛЬС В(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕРКИНАМОНОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА(57) Использование: изобретение относк медицине, преимущественно к иммугии, и может быть использовано в дистике состояния иммунной системы.изобретения - упрощение, ускорениевышение точности определения ИЛмцитов человека, Моноциты крови и итс гноель поо-. еИзо преиму быть исп иммунно бретение отностися к медицщественно к иммунологии, и м ользовано в диагностике состо й системы. ине, ожет яния Цель изобретения - упрощение, уск ние и повышение точности определе ИЛмоноцитов человека.Поставленная цель достигается тем моноциты крови после отделения от ли цитов в пластиковых лунках посредс адгезии промывают, активируют липоп сахаридом в течение 1,5 - 3 ч, повторно мывают и вносят в лунки равный объем мл) суспензии аутологических лимфоци фитогемагглютинин и после культивир ния смеси клеток подсчитывают по сра нию с контрольными пробами ин восстановления реакции бласттрансфо оре ния(71) Витебский медицинский институт, что мфотвом оли- про(0,2 тов и ова- внедекс рмаотделения от лимфоцитов в пластиковых лунках посредством адгезии промывают, активируют липополисахаридом в течение 1,5 - 3 ч, повторно промывают и вносят в лунки равный объем (0,2 мм) суспензии аутологичных лимфоцитов и фитогемагглютинин в субоптимальной дозе и после культивирования подсчитывают по сравнению с контрольными пробами индекс восстановления реакции бласттрансформации, Положительный эффект изобретения заключается в упрощении,ускорении и повышении точности определения ИЛза счет импульсной активации (1,5 - 3 ч) моноцитов липополисахаридом и использования аутологичной системы иммунокомпетентных клеток (моноцитов и лимфоцитов). 2 йл. 1 табл. Способ осуществляют следующим озом,Гепариниэированную(20 ЕД), венозную кровь в объеме 5 - 6 мл наслаивают на 2 мл градиента Фиколл-Гипак(1,077 г/см ) в цен 3 трифужной пробирке и центрифугируют при 400 9 40 мин, Фракцию мононуклеаров, находящуюся в интерфазном слое, собирают, отмывают три раза физиологическим раствором и приготавливают суспензию клеток до концентрации 2 х 10 в 1 мл среды ЕЯМ 1 - 1640 с 10%-ной инактивированной АВ(И) сывороткой. Для разделения прилипающих и не- прилипающих клеток суспензию мононуклеарных клеток разливают по 0,2 мл на одну лунку в пластиковые плоскодонные планшеты для культивирования клеток и инкубируют в течение 45 мин при 37 С и 5% СО 2. Неприлипшие клетки, состоящие на 95% из лимфоцитов (окраска азур-эозином)45 50 55 собирают и хранят при 4 С до использования. Прилипшие клетки, состоящие на 92 из моноцитов (окраска на неспецифическую эстеразу), осторожно промывают несколько раз средой 199 и во все лунки добавляют по 0,1 мл среды РРМ 1 - 1640. Клетки активируют липополисахаридом Е. Со (ЛПС "Яегча") импульсным методом, Для этого в часть лунок с моноцитами вносят по 0,02 мл (20 мкг/мл) ЛПС, в другие - 0,02 мл среды ВРМ 1 - 1640 и инкубируют при 37 С и 5 С 02 в различные интервалы времени (0,5;1,5; 3,0 ч). По окончании удаляют всю надосадочную жидкость и лунки с клетками осторожно промывают три раза средой 199. Затем в монослой моноцитов (активированных и неактивированных ЛПС) вносят по 0,2 мл суспензии аутологичных неприлипших клеток (лимфоцитов) в концентрации 2 х 106 на 1 мл среды ВРМ 1 - 1640 с 20 мМ глутамина, 10инактивированной АВ (И) сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина. В часть лунок (опыт) с клеточными смесями, состоящими из активированных или интактных моноцитов и лимфоцитов, добавляют субоптимал ьную дозу(1 мкг/мл) Ф ГА в объеме 0,02 мл. В другие (контроль) вносят равный объем среды ЯРМ 1 - 1640. Планшеты помещают в термостат при 37 С с 5; СО 2 и культивируют втечение 72 ч, По окончании реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) готовят мазки клеток, в которых определяют бластные клетки,РБТЛ с исходными мононуклеарными клетками и с неприлипшими клетками (лимфоциты) ставят с целью контроля спонтанного и митогениндуцированного пролиферативного ответа клеток. Для этого в лунки помещают по 0,2 мл суспензии клетоксконцентрацией 2 х 10 на 1 мл среды ЯРМ 1 - 1640 с 20 мМ глутамина, 10, инактивированной АВ(И) сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина, В опытные лунки добавляют 0,02 мл ФГА (10 мкг/мл), в контрольные лунки - такое же количество среды и культивируют при 37 С с 5 СО 2 в течение 72 ч с последующим определением бластных клеток. РБТЛ во всех исследованиях оценивают по индексу активации (ИА) - отношение числа бластных клеток в культурах, обработанных ФГА (опыт), к количеству бластных клеток в культурах, не обработанных Ф ГА (контроль),Для оценки прод иции ИЛмоноцитами используют индекс восстановления реакции бласттрансформации (ИВРБ).Лимфоциты + моноциты,активированные ИА импульсным методом, или интактные моноциты - ИА (лимфоциты) ИВРБ -ИА (мононуклеары) -ИА (лимфоциты) 5 10 15 20 25 30 35 40 В части исследований ИЛ - 1 определяют в суточных супернатантах моноцитов, активированных ЛПС импульсным методом, а также в суточных супернатантах интактных моноцитов согласно изобретению, Для этого монослой клеток инкубируют с или без ЛПС в течение 0,1; 1,5; 3 ч. Затем их осторожно промывают три раза средой 199 от индуктора, суспензируют в среде ВРМ 1- 1640 и культивируют в течение 1 сут при 37 С с 5 ф С 02. Затем собранные супернатанты центрифугируют при 4009 15 мин и определяют в них активность ИЛ. Полученные данные выражают в ИВРБ.ИА (лимфоциты) + ИЛ) - ИА (лимфоциты)ИВРБ --ИА ( мононуклеары ) - ИА ( лимфоциты )где ИЛ - суточные супернатанты моноцитов, активированных импульсным методом ЛПС или интактных моноцитов,Полученные результаты подвергают статистической обработке с применением критерия Стьюдента.Результаты. Интактные моноциты стимулируют пролиферативный ответ аутологичных лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу ФГА по сравнению с пролиферацией одних лимфоцитов (фиг,1). Однако эти клетки не способны восстанавливать пролиферацию лимфоцитов до показателей, полученных в РБТЛ с мононуклеарными клетками, так как ИВРБ равен 0,6 -0,09. После активации моноцитов ЛПС в течение 0,5 ч их способность стимулировать пролиферацию лимфоцитов существенно не отличается от действия интактных клеток (фиг,1), Пролиферативный ответ лимфоцитов значительно возрастает (Р0,05) после активации моноцитов ЛПС в течение 1,5 ч и сохраняется при применении моноцитов, активированных ЛПС 3 ч (фиг.1), Полученные данные свидетельствуют о том, что после импульсной активации ЛПС моноциты приобретают способность усиливать пролиферативный ответ аутологичных лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу ФГА,ЛПС является хорошим индуктором продукции ИЛ - 1 моноцитами, Поэтому предполагается, что после импульсной активации ЛПС моноциты человека приобретают способность продуцировать ИЛ - 1, который стимулирует пролиферацию аутологичных лимфоцитов. Для подтверждения этого с помощью известного способа определяют ИЛв суточных супернатантах моноцитов, активированных ЛПС импульсным методом. Кроме того, известным спо1730594 Способ 0,920,12 1,35 0,10 ИзвестныйПредлагаемый собом определяют ИЛв суточных супернатантах интактных моноцитов человека, Оказалось, что супернатанты интактных клеток стимулируют пролиферацию лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу Ф ГА. И В Р Б в этих случаях равен 0,92 + 0,12 (фиг.2), что видно по результатам, полученным согласно известному способу, Увеличение ИВРБ наблюдается при использовании супернатантов моноцитов, активированных ЛПС импульсным методом в течение 1,5 и 3 ч (фиг.2), в то время как супернатанты моноцитов, активированных ЛПС в течение 0,5 ч, не обладают таким действием (фиг.2),Результаты этих исследований свидетельствуют о том, что моноциты, активированные ЛПС импульсным методом, приобретают способность продуцировать ИЛ, который определяется в суточных супернатантах этих клеток с помощью известного способа,Таким образом, приведенные данные показывают, что моноциты, активированные ЛПС импульсным методом, продуцируют ИЛ - 1, который определяется по стимуляции пролиферации аутологичных лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу ФГА.П р и м е р 1, Исследования проведены на крови 25 доноров станции переливания крови. Статистически обработанные результаты представлены на фиг.1. После активации моноцитов ЛПС в течение 0,5 ч их способность стимулировать пролиферацию аутологичных лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу ФГА существенно не отличается от действия интактных моноцитов. Это указывает на то, что в обоих случаях определяется одинаковая способность моноцитов человека продуцировать ИЛ - 1. При активации моноцитов ЛПС в течение 1,5 и 3 ч возрастает (Р 0,0 б) пролиферативный ответ лимфоцитов на субоптимальную концентрацию ФГА, На основании полученных данных можно считать, что моноциты человека, активированные ЛПС импульсным методом (1,5 - 3 ч), продуцируют ИЛ - 1, который определяется по способности стимулировать пролиферацию аутологичныхлимфоцитов, стимулированных субопти 5 мальной дозой ФГА,П р и м е р 2, Проведено определениеИЛ - 1 моноцитов человека по известному ипредлагаемому способам у 30 доноров станции переливания крови,10 Данные представлены в таблице,При использовании известного способаопределено одинаковое количество ИЛ(ИВРБ = 0,92 + 0,12), При определении ИЛ -1 моноцитов человека предлагаемым спо 15 собом ИВРБ равен 1,35+ 0,1, что вышеданных по известному способу. Следовательно, предлагаемый способ повышаетточность определения ИЛмоноцитов человека.20 Положительный эффект изобретениязаключается в упрощении, ускорении и повышении точности определения ИЛ - 1 моноцитов человека за счет импульснойактивации моноцитов липополисахаридом и25 использования аутологичной системы иммунокомпетентных клеток (моноциты и лимфа циты),Формула изобретенияСпособ определения интерлейкина 30 моноцитов человека путем оценки влиянияпродуктов культивирования моноцитов нап ролиферативную активность Ф ГА-стимулированной культуры лимфоцитов человека,о т л и ч а ю щ и й с я,тем, что, с целью35 упрощения, ускорения и повышения точности определения, моноциты крови после отделения от лимфоцитов в пластиковыхлунках посредством адгезии промывают,активируют липополисахаридом в течение40 1,5 - 3 ч, повторно промывают и вносят влунки в обьеме 0,2 мл суспензии аутологичных лимфоцитов с фитогемагглютинином ипосле культивирования оценивают по сравнению с контрольными пробами индекс вос 45 становления реакции бласттрансформации. Активность ИЛИВРБ