Способ получения рекомбинантной плазмидной днк pit337, экспрессирующей изопенициллин-n-синтетазу

)5 С 12 й 15/52 ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ЮЗОМ,,У 1 ЦУ ОПИСАК ПАТЕНТУ О Е МЭКомпани (О 5) Инголиа, Стефен Виатт ри Сзмсон и Пол Лютем Изобретение относится к биоехнологии и может быть использовано для получения изопенициллин-й-синтетазы,Сконструирована новая плазмиднзя ДНК рТ 337, обеспечиващая экспрессию гена изопенициллин-Й-синтетазы в клетках ЕзсЬегс)а со 1. П р и м е р, А. Выделение плазмиды, Лиофильную Е.со 1 К 12 А 221-р 1 Т 335 получают из йогтйегп Йе 91 опа Незеагс) 1 аЬогатог 1 ез, Реог 1 а, Й(поз под регистрационным номером ййй В - 15960, Этот лиофил можно непосредственно использовать как "культуру" в предлагаемом способе.Штамм Е.со 1 К 12 А 221/рТ 335 инкубируют в 1 л 1-бульона(10 г триптона, 10 г йаС 1 и 5 г дрожжевого экстракта на 1 л), содержащего 50 мкг/мл ампициллина при 37 С до достижения оптической плотности при 590 нм (О.Д 59 а) - единицы поглощения, добавляют 150 мг хлорамфеникола. инкубируют еще около 16 ч,(21) 4356444/13 62) 4027382/132) 19.09,8823) 21.04.86 (31) 725870 (32) 22,04.85 (33) ОЯ (46) 23.01,91, Бюл. (71) Эли Лилли энд (72) Томас Доминик Квинер, Сьюллен Мэ Скзтруд (ОЯ) (53) 577.224,2/.577.2 (54) СПОСОБ ПОЛУТНОЙ ПЛАЗМИДН 048) (088,8)ЕНИЯ РЕКОМБИНАНЙ ДНК р 1 ТЭ 37, ЭКСПРЕССИРУЮЩЕЙ ИЗОПЕНИЦИЛЛИН-й- СИНТЕТАЗУ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения иэопенициллинч-синтетаэы. Сконструирована новая плазмидная ДНК р 1 Т 337, обеспечивающая экспрессию гена иэопенициллин-й-синтетазы в клетках Е,со 1, Плазмиды рС 2106 и р 1 Т 335 обрабатывают эндонуклеаэами рестрикции с получением чС 01-МСО и ИСО - Вав 1 фрагментов плаэмиды рСЕ 106 размером 7,8 1 Ь и 1,5 МЬ, а также МС 01 - Ва(пН фрагмента плазмдь р 1 ТЭЗ размером 1,5 (Ь; полученные фра м нты лигируют с помощью ДНК-лигазы. Клетки центрифугируют са коростью 6000 об мин а течение 5 мин при 4 С. Полученную надосадочную жидкость сливают, а остаток промывают в 40 мл ТЕ буфе а(10 мМ трис-НС 1, рН 7,5; 10 мМ йаС 1 и 1 мМ ЕДТА), затем снова осаждают. После повто 1,ного слиоания надосадочной жидкости клеточ. ный остаток эамораживают в бане со смесью сухой лед - этанол, отгаивают и повторно суспендируют в 10 мл раствора 25-ной сахарозы и 50 мМ ЭДТ ч. Затем добавляют 1 мл раствора, содержащего , 5 мг/мл лиэоцима, 3 мл 0,25 М ЕДТА, рН 8,0 и 100 мкл 10 мг/мл ВМАзы А, раствор инкубируют на льду в течение 15 мин, Затем добавляют 3 мл лиэирующего раствора, полученного при смешивании 3 мл 10-ного тритон-Х 100; 75 мл 0,25 М ЭДА, р Н 8; 15 мл 1 М трис-НС 1, рН 8,0 и 7 мл воды перемешивают и инкубируют на льду в течение 15 мин. Лизированные клетки эамораживают в бане со смесью сухой лед - этанол, а затем оттаивают, 162356750 Клеточные осколки удаляют из раствора центрифугированием при 25000 об/мин в течение 40 мин в ЯЮ 27 роторе (Бекман) и экстрагированием забуферированным феиолом, После добавления 30,44 г СЯС 1 и 1 мл (5 мг/мл) раствора этидиумбромида объем раствора устанавливают 40 мл, декантируют в кювете ОТ 50 ультрацентрифуги (Бекман), центрифугируют в ОТ 50 роторе при 42000 об/мин в течение 16 ч, Полученную плазмидную полосу визуализируют, облучая ультрафиолетовым светом, выделяют, а затем центрифугируют при 50000 об/мин в течение 16 ч, Все необходимые изменения в объеме осуществляют добавляя ТЕК-буфер, содержащий 0,761 г/мл С 8 С 1, Плазмидную полосу снова выделяют, экстрагируют насыщенным соленым изопропанолом для удаления этидиумбромида, разбавляют 1:3 ТЕЯ-буфером, добавляют два объема этанола, а затем инкубируют в течение ночи при -20 ОС. Плазмидную ДНК таблетируют, центрифугированием раствора в ЯЯ 34 роторе (Сорвал) в течение 15 мин при 10000 об/мин,1 мг плазмидной р 1 Т 335 ДНК, полученной такигл способом суспендируют в 1 мл ТЕ-буфера (10 мМ трис-НС 1, рН 8,0 и 1 мМ ЭДТА) и хранят при -20 С,В, Конструирование плазмиды р 1 Т 337.Лиофильную культуру клеток Е.соИ К 2 ВЧ 308/рС 2106 используют для инокулирования 1 л 1:бульона, содержащего 50 мкг/мл канамицина, а затем инокулированный бульон инкубируют при 25 С в воздушном шейкере до О,Д 59 о между 0,5 и 1.0 ед, поглощения. Когда эти значения достигают интервала 0,5 - 1,0 ед, поглощения в оптической плотности, температуру повышают до 37 С и продолжают инкубирование в течение 2 - 6 ч для неконтролируемой реплика ции.После инкубирования при 37 С в течение 2 - 6 ч клетки собирают, плазмидную ДНК рС 2106 выделяют по примеру 1 А. 5 мг плаэмидной ДНК рС 2106 суспендируют в 5 мл ТЕ-буфера.К 25 мкг полученной плазмидной ДНК рС 2106 добавляют 10 мкг десятикратного ВагтгН 1-реакционного буфера, содержащего 1,5 М Л 3 аС 3: 60 мМ трис-НС 1, рН 7,9, 60 мМ МЫС 2 и 1 мг/мл бычьей сыворотки альбумина (ВЯА), 50 ед. рестриктазы Вагп Н и 50 ед рестриктазы Л со в обьеме 5 мкл и 55 мкл Н 20. Полученный реакционный раствор инкубируют при 37 С в течение 4 ч, после чего реакция практически завершается.Л со 1 - ВапН 1 реакционную смесь подвергают электрофорезу в 1 оь-ном агарозном геле до четкого отделения целевых 5 10 15 20 25 30 35 40 45 фрагментов - 1,6 3 Ь Л 3 со - ВагпНг и 8,7 МЬ Л 3 со 1-Л 3 со от других продуктов расщепления, 0.3 ЕЬ рестрикционного фрагмента. Визуализацию обработанной электрофорезом ДНК осуществляют подкрашиванием геля в разбавленном растворе(0,5 мкг/мл) этидиумбромида и экспонированием подкрашенного геля длинноволновым ультрафиолетом, После определения положения целевых фрагментов в геле делают небольшую щель перед каждым из целевых фрагментов и в каждую щель помещают небольшие кусочки мембраны ЯсЫесерег апО БсМеИ (Кеепе, ЛН 03431) ЛЗАДЕАЕ, При продолжении электрофореза ДЧ К дековэлентно связывается с ДЕАЕ мембрзной, После того, как целевые фрагменты связысаюге. с ДЕАЕ меглбраной, эти мебраны извлекают и промывают буфером, содержащигл 100 мМ КС, 0,1 М ЭДТА и 20 мМ трисНС 3. рН 8, Затсм каждую мембрану помещают в небольшую ампулу и погружают в буфер, содержащий 1 М Л 3 аС 1, 0,1 мМ ЕДТА и 20 мМ трио-НС 1, рН 8, инкубируют при 65"С в течение 1 ч для удаления ДНК с мембраны, После инкубирования при 65 С инкубационный буфер собирают, мембрану проглывзют,Раствор ДН К устанавливают таким, чтобы концентрация Л 3 аС 1 была 0,25 М, и добавляют три объема холодного абсолютного этанола. Затем полученные растворы смешиают и оставляют при (-70) С на 10 - 20 мин.После охлаждения растворы центрифугируют при 15000 об/мин в те ;ние 15 мин. После еще одного осаждения для удаления остаточной соли ДНК промывают этанолом, с,.дат, псвторно суспендируют в 20 мкл буфера ТЕ, Полученные очищенные фрагменты 1,6 со Л 3 со-ВаггН 1 и 8,7 сЬ Л 3 со - Л 3 сорикционных фрагментов плазмиды рС 2 Об отдельно растворяют в 25 мкл ТЕ буфера и хранят при (-20)ОС,25 мкг ДНК-плазмиды р 3 Т 335 расщепляют рестрикционными ферментами Л 3 со 1 и ВаспН 1, как описано выше. Л 3 со 1-ВагпН 1- расщепленную ДНК помещаг:т на 13 ь-ный агарозный гель и целевой 1.5 МЬ Л 3 со 3- ВагпН 1 рестрикционный фрагмент выделяют, как описа о выше. Получают приблизительнс бмкг целевого фрагмента, суспендг ругот его в 25 мкл ТЕ-буфера и хра.т при -20 ОС.5 мкл ",6 1 ЬЛ 1 со - ВагпН 1 и 2,5 мкл 8,73 сЬ Л 3 со 1-Л 3 со 1 рестрикционных фрагментов плазмиды р С 2106, лигируют с 5 мкл1,5 МЬ Л 3 сог-ВагпН 1 рестрикционного фрагмента ппазмиды р 11335 до получения плазмиды 1. 7337, Реакционный объем составляет О мкл и включает указанные фрагментыДНК, 1,1 мкл ( 100 ед,) Т 4 ДНК лигазы, 3мкл 10-кратного лигирующего буфера (0,5 Мтрис-НС 1, рН 7,8; 100 мМ М 9 С 1 г; 200 мМ дитиотреитола ЭДТТ); 100 мМ АТР; и 1 мг/млВЯА/ и 13,4 мкл НгО. Реакционную смесьинкубируют при 15 С в течение 2 ч, послечего реакция практически завершается. Лигированная ДНК составляет целевую плаэмидную ДНК рТ 337.С, Конструирование Е,со 1 К 12ЯЧ 308/рТ 337.А, Конструирование Е.со К 12ЯЧ 308/ р 1 Т 337,50 мл культуры Е,со 1 К 12 ЯЧ 308 (ИЯЯВ - 15624) в-бульоне выращивают доО.Д 59 о 0,5 единиц поглощения, Культуруохлаждают на льду в течение 10 мин, клетки собирают центрифугированием, Осадокклеток повторно суспендируют в 25 мл холодного 100 мМ СаС 1 г и инкубируют на льдув течение 25 мин. Клетки еще раз осаждаютцентрифугированием, осадок повторно суспендируют в 2,5 мл холодного 100 мМ Са С 1 г иинкубируют на льду в течение ночи, 200 мклэтой клеточной суспензии смешивают с лигированной ДНК, приготовленной, как описано выше, инкубируют на льду в течение20 мин, а затем клетки собирают центрифугированием, Клеточный осадок повторносуспендируют в 1 мл-бульона, и эту сус"пензию инкубируют при 25 С в течение ч,Аликвотные части смеси клеток помещаютна-агарные ( -бульон с 15 г/л агара) пластины, содержащие 50 кмг/мл канамицина,и эти пластины инкубируют при 25 С,Трансформанты Е,со К 12 ЯЧ 308/р 1 Т 337проверяют отбором на устойчивость к канамицину и рестрикционным ферментныманализом их плаэмидной ДНК.Некоторые изоляты Е.соК 12ЯЧ 308/рТ 337 трансформантов по отдельности инокулируют в 5 мл аликвотных частей -бульона, содержащего 50 мкг/млканамицина, и инкубируют в воздушномшейкере при 25 С до тех пор, пока О.Дюо несоставит - 0,2 ед, а затем при 37 С в течение приблизительно 6 ч,Спустя 6 ч собирают по 1 мл каждойкультуры клеток и центрифугируют. Клеточные осадки по отдельности промывают 1 мл10 мМ чаС 1, а затем суспендируют в 1,0 мл1 РЯ экстрационного буфера (0.05 М трисНС 1, рН 8,0, 0,01 М КС 1 и 0,01 М 9 Я 04). Клеткиобрабатывают ультразвуком импульсами по5,6 с, используя микронаконечники, Времямежду импульсами облучения ультразвукомсоставляет 60 с. Полученную смесь выдерживают в бане лед - этанол во время этойпроцедуры, После обработки ультразвукомклеточную смесь центрифугируют для удаления осколков, а затем используют непосредственно в анализе,Контроль синтеза изопенициллина-йпроводят в объеме 500 мкл, Для начала ре 5 акции 1,0 мл раствора 1,4 мМ д в / - ааминоадипил/-1:цистеинил-О-валина и3,75 мМ ДТТ оставляют при комнатной температуре на 30 - 60 мин для приведениялюбых димерных трипептидов в мономер 1 О ную форму. 50 мкл каждого из последующихисходных растворов помещают небольшими частями в контрольные ампулы (стерильные, стеклянные, ампулы 13 х 100 мм): вбуфере 500 мМ трис-НС 1, рН 7,4; 100 мМ15 КС 1; 100 мМ М 9 Я 04; 1,0 мМ ЕеЯО 4 и 6,7 мМаскорбиновой кислоты, Затем добавляютразличные количества экстракта, разбавленного водой до объема 150 мкл, Около100 мкл аликвотных частей раствора три 20 пептида добавляют затем в каждуюампулу; добавление трипептида начинаетреакцию. Каждую ампулу встряхивают, помещают в гиротропную шейкерную банюпри вращении со скоростью 250 об/мин,25 при температуре 25 С и инкубируют 45 мин,Затем отбирают два образца по 100 мклкаждый, капают в выемки пластинок длябиоанализа и к остальному добавляют 100 ед.пенициллиназы, В каждую реакционную30 смесь добавля от по 5 мкл (100 ед.) регидратированной пенициллинязы-А и оставляютна 5 мин при комнатной температуре а затем по 100 мкл каждого экстракта, обработанного пенициллиназой-А, помещают в35 углубление на пластинке для биоанализа.Такую обработку пенициллинаэй-А проводят для проверки того, чтобы увериться, чтозоны на пластине для биоанализа связаны сналичием пенициллина, а не цефадостори 40 на или других примесеиСтандартную кривую пенициллин-йполучают, добавляя 0,5; 2,0; 5,0; 10,0 и 20,0 мкгпеницлллина-И в углубление на пластинкахдля биоанализа. Активность пеницилли 45 назы-А проверяют также, добавляя 5 мклферментного препарата к 200 мкл 0,2мкг/мл пенициллина А.Пластины для биоаналиэа состоят изК 131 питательного агара, который пслуча 50 ют, растворяя 30,5 г ВВ 1 АпОЫотс Меойптв 1 л деионизированной воды, доводя раствор до кипения, охлаждая до 70" С, а затемвыдерживая в автоклаве 35 мин при 121 С идавлении 1,055 кг/см . Затем пластиныг55 засевают 4 мл свежей ночной культурыМ 1 сгососсцз 1 отеоз (АТСС 9341), а на 700 млагара М.цсеоз выращивают в К 544 питательном бульоне, который содержит 011 сопептона 5,0 г; ОИсо дрожжевого экстракта1,5 г; хлористого натрия 3,5 г. безводного ди1623567 устройчива к замораживанию и оттаиванию. Более высокая стабильность связана с разницей в обработке фермента между С.эсгевоп 1 ов и Е.со. Так, например, синтетэзэ изопенициллина-й, выделенная из С.эсгевопОа, не содержит первых двух эминотерминэльных эминокислотных остатков, метионинэ и глицина, которые имеются в ДНК, кодирующей активность синтвтэзы иэопенициллина-й С,асгеаоп Ощ и которые также присутствуют в предлагаемом материале, продуцируемом Е.со. 510 Формула из обре те н и я 20 25 30 35 Составитель Н,КузенковаРедактор А.Коэориз Техред М.Моргентал Корректор С,Шекмар Заказ 116 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент, г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 кэлийфосфатэ 3,7 г; монокэлийфосфатэ 1,3 г; ОИсо бычьего экстракта 1,5 г в 1 л деиониэировэнной воды. Раствор доводят до кипения, охлаждают до 25 ОС, доводят до рН 7,0 1 н, НС 1 или 1 н, чэОН, а затем выдерживают в автоклвве в течение 20 мин при 121 С и давлении 1,055 кг/см перед употреблением. Засеянный агар помещают в пластины 100 х 15 мм в количестве 15 мл эасеваемого эгера нэ пластину. Углубления получает отсасыванием 5 мл пипеткой; каждое углубление имеет диаметр 10 мм.После подготовки пластин образцы помещают в эти углубления и инвубируют при 37 С 18 ч. Результаты анализа определяют измеряя диаметр чистых поверхностей вокруг каждого углубления с образцом, которое образовывается из-за того, что М.цтецз не могут расти в присутствии пенициллина.Хотя линейность анализа по измерению размера зон заметно падает, когда размер зоны прввыщает 2,1 мм, результаты анализа показывают, что Е,со К 12 й 9308/рП 337 трансформанты экспрессируют активность синтетээы изопенициллинв И, тогда как трансформанты Е.соИ К 12 й 9308/рС 2106 этого не делают.Фермент, продуцирувмый Е,со, существенно болев стабилен, нежели синтетазэ иэопенициллинр Н, полученная иэ СерЬаозрог 1 цп асгевопЬе. Этэ более высокая стабильность проявляется в экспериментах по замораживанию и оттаиванию. Синтетаэа изопенициллима С.всгеаопов быстро инактивируется при замораживании и оттаивании, но синтетаээ изопенициллина-й, продуцировэннэя Е.со, достаточно Способ получения рекомбинатной глазмидной ДНК р 1 Т 337, экспрессирующей изопвнициллинч-синтетазу, заключающийся в том, что иэ штэммов бактерий Езсйег 1 сЫэ со 1 К 12 1 А 22 /р 1 ТЗЗ 5 и Е,со 1 К 12 Ю/308/рСЕ 106 выделяют плээмиды, которые подвергают обработке эндонуклеэээми рестрикции с получением И со 1-й со 1 и й со 1-ВэеН фрагментов плазмиды рСЕ 106 размером 7,8 ЕЬ и 1,5 МЬ, э также М со 1- ВэгпН 1 фрагмента плээмиды р 1 Т 335 размером 1,5 Ю; полученные фрагменты лигируют с помощью ДНК-лигаэы в буфере, содержащем 50 ммоль трис-НС 1, 10 ммоль МцС 12, 200 ммоль ДТТ, 10 ммоль АТФ, бычий сывороточный альбумин, рН 7,8 при комнатной температуре и концентрации ДНК 1 мг/мл в течение около 2 ч, полученной рекомбинэнтной ДНК трансформируют штамм бактерий Е,соИ КЧ 308 с отбором устойчивых к кэнамицину клонов, способны х экспрессировать активность изопенициллина-М-синтвтаэы, и выделением целевой плээмидной ДНК,