Способ экспрессии dacsdaocs активности в клетках еsснеriснiа coli

(54) СПОСОБ АКТИВНОСТ СО(57) Использо рия, рекомби ферментов. С экспрессии клетках Е.со цию штамма рТ 507 с посл прессирующи инженеолучения : способ ности в сформа- ой д Компани (ОЯ) галиа, Стефен Виатт Сэмсон и Пол Латер азмид нов,э 12 ил ет как ОАО тидной цепи, которая облада С-, так и ОАСЯ-активностями.Соединения ДНК, которые кодируют активности ОАСЯ/ОАОСЯ, были выделены из геномной ДНК СерЬаозрог 1 цгп асгегпопцгп.Продуцирование Е.со активности ОАОСЯ/ОАСЯ катализируют образование ОАОС из пенициллина йц ОАС и ОАОС, Сырые клеточные экстракты этих трансформантных Е.со по настоящему изобретению проявляют активности ОАОСЯ/ОАСЯ без какой-либо предварительной активационной обработки. Заявленный способ экспрессии в Е.со 1 обеспечивает эффективное средство получения больших количеств активного фермента ОАОСЯ/ОАСЯ, Этот фермент ОАОСЯ/ОАСЯ полезен не только для продуцирования ОАОСЯ и ОАС, но также и для расширения спектра пенициллинов иных чем пенициллин М и для гидроксилирования цефалоспоринов иных чем ОАОС для образования новых.ДНК соединения, отвечающие настоящему изобретению, образованные от геномной ДНК СерЬаозрог 1 цгп асгегпоп 1 цп 1,ГОСУДАРСТВЕННОЕ. ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(72) Томас Доминик ИнКвинер, Сьюллен МэриСкэтрад(.)Я) Изобретение касается способа экс- прессии ДНК последовательностей, которые кодируют активности деацетоксицефалоспорин С синтетазы и деацетилцефалоспорин С синтетазы,(ОАОСЯ) катализируют реакцию, в которой из пенициллина й образуется деацетоксицефалоспорин С (ОАСС), и очень часто рассматривается как экспандаза (увеличитель объема). Деацетилцефалоспорин С синтетаза (ОАСЯ) катализирует образование деацетилцефалоспорина (ОАС) из ОАСС, реакция гидроксилирования. Эти реакции являются критическими этапами в биосинтезе очень важных антибиотиков, таких, как цефалоспорины, из СерЬа 1 оврог 1 цгп асгегпопцгп и 7 с-метоксицефалоспорины из Яйгерсоеусез с 1 аУцН 9 егцз.Соединения ДНК, используемые в способе данного изобретения, кодируют ОАОС и ОАСЯ в одиночной открытой рамке считывания. Транскрипция этой открытой рамки считывания с последующей трансляцией полученной информационной РНК (гпРНК) приводит к получению одиночной полипей 1838413 А ЭКСПРЕССИИ ОАСЯ/ОАОСЯ И В КЛЕТКАХ ЕЯСН ЕЯ 1 СН 1 А вание: Генетическая нантная технология и ущность изобретения ОАСЯ/ОАОСЯ актив 1 предполагает тран Е,со 11 К 12 1 гп 109 пл едующим отбором кло х данную активностьвагась в течение 16 ч при 4 С. Лигаза инак-тивирооалась путем нагревания при 65 ОС втечение 10 мин. Полученный материал раэбаалялся до объема 100 мкл и в результатеполучалась композиция буферного раствора 1 Х, содержащего 10 единиц фермента ЯаИи ицкубировался в течение 1 ч при 37 С,Реакционная смесь разбавлялась до300 мкл, в результате получалась композиция буФерного раствора 1 Х Рчо 11(60 мМоль 10МаС 1; 6 мМоль Трис. НС, рН 7,5,6 мМольМ 9 С 12; 6 мМоль 3-меркаптоэтацол), содержащего 10 единиц фермента РчцИ. По прошествии 1 ч выдержки при 37 С ДНКфракционировалась а 5/-ом полиакриламидном геле, Примерно 0,5 лкг фрагмента950 п,о. извлекалось, очищалось и растворялось в ТЕ 1,0,2 микрограмма этого фрагмента раз бавлялись в 20 мкл буферного раствора 74 20ДНК лигазы, содержащего 20 никомолейфосфорилированцого связующего звенаВатп Н (5-ССООАТССОО, иэСоИаЬогатче Яезеагсй) и,2 единицы Т 4 ДНКлигазы, затем инкубировапись в течение 2516 ч при 4 С. Полученная ДНК затем нагревалась в течение 10 мин при 65 С, разбавлялась до обьема .100 мкл с образованиемкомпозиции буферного раствора 1 Х Ваго Н,содержащего 20 единиц Фермента Вап Н 1, 30ф инкубированного при 37 С в течение 2 ч,затем фракционировалась на 5-ом полиэкрипамидцом геле с целью удаления избытка связующих молекул,Полученный в результате фрагмент 950 35п.о. с липкими концами Вагп Н и ЯаИ очи-"щался обычныол образом и растворялся в 20мкл, буферного раствора Т 4 ДН К лигаэы, содержащего 0,2 мкг обработанной ВавИ 1- ЯаИ плазмиды 105 и Т 4 ДНК лигазы, После 40инкубации в течение 1 б ч при 4 С ДНК использовалась для трансформации Е.соИ К 12НВ 101 (КЯЕ 1.В).Были получены плазмиды из трансформацта Арй и зти плазмиды анализировались 45на наличие фрагмента ЯаИ-Вагп Н. Желаемая плазмида (- 5,2 кв) была обозначенарКЕМ 021 (106 на Фиг.4).10 мкг тлазмиды рКЕИ 021 расщеплялись при 37 С в 200 мкл буферного раствора 50Ваго Н 1, содержащего 10 единиц каждого изферментов Вагп п 1,и ХЬа 1, в течение часапри 37 С. Желаемая ДНК, обработаннаяХЬа 1-Вагп Н 1, затем обрабатывалась 2,5 единицами щелочной фон:ратазы в течение 1,5 55ч при 65 С, экстрагировалась смесь фенол(СНС 1 з, извлекалась путем осажденияэтацолом и растворялась в 50 мкл ТЕМ дляпоследующего использования (107 наФиг.4). В. Построение плазмиды рММ 575, Плазмида ртгр Е 050 сЬОН 800 (108 на фиг,5), описанная Магта 1 и др., 1979 г., Яс 1 епсе 205:602-607, использовалась в качестве источника ДНК, содержащей часть кодирующей последовательности пОН. Этот Фрагмент мог быть построен методом синтеза или мог быть получе путем использования метода распознавания, описанного Оооггпоп и др 1979 г. "Методы в знзимологии, 68, 75 - 90,путем изоляции мРНК, кодирующей ОН, из слизистых оболочек человека. ЧастьОН плазмиды р 1 гр ЕО 50 сЬ ОН 800 содержит уникальный сайт рестрикции на 6 п,о. ниже трансляционного концевого кодона данной кодирчющей последовательности. Этотсайт был заменен на сайт Вав И 1 как описано ниже.,Примерно б мкг плазмиды ртгр ЕО 50 сЬОН 800 обрабатывапось б единицами Ягпа 1 в 200 мкл буферного раствора 1 Х Ягпа (15 мМоль Трис. НС 1, рН 3,0; б мМоль МяС 2;16 мМоль КС 1; б мМольмеркаптоэтанол) в течение 1,5 ч при 37"С. После полного вываривания осуществлялась экстракция смесвью фенол(СНС 1 з, ДНК извлекалась путем осаждения этанолом и затем растворялась в 24 мкл ТЕК 40 пикомолей фосфорилированного связующего звена Вагп Н 1 (СоаЬогатче йезеагсЬ), вводили в 0,5 мкг (0,2 ликомоля концов) обработанной как указано выше плазмиды в 16 мкл буферного раствора лигазы, содержащего Т 4 ДНК лигазу, Смесь инкубировапась в течение 2 ч при 22 С, в течение 16 ч при 4 С и затем в течение 10 мин при 65 С. Липкие концы Вагап Н 1 образовывались путем обычной обработки Ферментов Вап Н 1, Данный Фермент расщеплял последовательность лицкера, а также сайт Вагп Н 1. расположенный в началелонировацной ОН ДНК последовательности, Данное расщепление приводило к образованию Фраплецта 691 п,о, с липкими концами Вагп Н 1, который отделялся ца бо(,-ом полилакрипамидном геле и затем извлекался обычным образом.Выделецньй фрагмент ДНК сшивался с 0,2 влкг обработанной Вап Н и щелочной фосфатазой плазмидой рВ 322 (фиг,5). По прошествии 16 ч выдержки при 4 С данный материал использовался для трансформации Е,соИ К 12 А 221(МВВ 1 В) в основном согласно процессу трансформации Яепзп 1 с и др 1974 гСМ 3: 315 - 325. Трансформанты отбирались ца агаровых пластинах, содержащих 100 мкг(мл ампициплина, и ппазмиды выделялись обычным образом и идентифицировапись путем анализа ограничительного фермента и методом гель электрофореза. Желаемые ппазмиды, обоз1838413 го раствора Гпо 011(6 ммоль йаС 1; 6 мМоль Трис,.НС 1, рН 7,4; б мМоль МдС 12; б мМоль /3-меркаптоэтанол) с 2,5 единицами фермента в течение 1,5 ч при 37 ОС. Электрофорез на бо-ом полиакриламидном геле и стандартные процедуры извлечения использовались для извлечения фрагмента ДНК 538 п.о., содержащего кодирующую последовательность последних 175 аминокислот6 Н, после чего осуществлялась трансля ция стоп сигнала,Двухнитевой фрагмент ДНК (100 на фиг,б) синтезировали фосфотриэфирным способом, соединяя зону промотора рр с кодирующей зоной6 Н. Этот двухнитевой фрагмент ДНК (,1100 на Фиг.б) имел указанную ниже последовательность: 5 10 15 5-СТМАГС(АНГЛ"Гф ДПЛС(А( ССАЙЛ П( (т (.:( (П(ПГ/ЛЛ(б(:ГА Ь( (СС 6-;33-"3 Г(:ГЛ."..:ю ( Л( (,с"А(:(:. ТСГАпг/г :(.:(.(.(Л ЛЛЛ(:Г(1(СНАл(.(з 6(С -525 30 35 40 обычным образом культивировались, используясь в качестве предпочтительного источника желаемой выраженной плазмидыр 1101. Д. Построение плазмиды р 1103, Последовательность гена6 Н в плазмиде р 1101 содержала сайт Х -1, начинающийся на 24 основания ниже трансляционной инициирующей точки и сайт ХЬа Н 1 в неко 50 дирующей зоне 5, Примерно 25 мкг плазмиды р 1101 вываривались в 250 мкл буферного раствора Ва(п Н 1 с 25 единицами ХЬа 1 и 25 единицами ХЬо 1 при 37 С в течение часа. Большой фрагмент, который имел слегка более быстрый пробег, чем линейная плазми 55 да, очищался от агарозного геля, какописано в примере 2 А. наченные как р 1 М 575 109 на фиг,5). содержат.фрагмент -700 п,о, Вагп Н 1 и их обычным образом усиливали (фиг,1) для последующего использования.С, Построение плазмиды р 1101, Кодирующая последовательность зрелого6 Н содержала один сайт Гпс(,Р 1, находящийся на расстоянии -47 п.о. от пЕрвого нуклеотида трансляционной инициирующей точки, Примерно 25 мкг плазмиды рчМ 575 переваривалось в 250 мкл буферного раствора Ва(п Н 1 с 25 единицами фермента Ва(п Н 1 при 37 С в течение часа (фиг.б), Фрагмент 691 п,о. Вав Н 1 извлекался обычным образом из 6 полиакриламидного геля и очищался. После очистки одна треть этого фрагмента (эквивалентно 8 мкг плазмиды) вываривалась в 100 мкл буферноДанный фрагмент получается распознавательным фосфотриэфирным способом,посредством которого получены ниже следующие Фрагменты,1) 5-СТА 6 А 666 ТА;2) 5-ТТАСАТАТ 66 АТТТСС;3) 5-СААССАТТССССТСТС 6 А 66 С;4) 5-ТТТТТОАСААС 6-35) 5-СТА 16 СТСС 63-3;б) 5-С 66 АССАТА 6 С 6 ТТОЗ;7) 5-6 ТСААААА С ССТ 8) 5-С 6 А 6 А 6666 ААТ;9) 5-66-ТТ 666 АААТС"3", и10) 5-САТАТ 6 ТААТАС С СТ.Используя приготовленные указанныесегменты, осуществлялись ступенчатым образом реакции катализированного связывания 14 лигазы, как описано ниже;а) 5-нефосфорилированный сегмент 1смешивался с Фосфорилированными сегментами 2, 9 и 10, и подвергался воздействию Т 4 лигазы с образованием дуплекса 1ДН К(Вгояп и др 1979 г. "Методы в энзимиологии", 63, 109-151). Этот дуплекс извлекался методом препаративного гельэлектрофореза на 15-ом полиакриламиде.б) 5-нефосфорилированный сегмент бсмешивался с фосфорилированными сегментами 3, 4, 5, 7 и 8 и подвергался воздействию Т 4 ДНК лигазы к образованиюДуплексной формы ДНК 2. Этот дуплексочищался электрофорезом на 15 оь-ом полиакриламлидном геле,с) ДНК дуплексы 1 и 2 затем соединялись вместе посредством Т 4 лигазы, образуя ДНК дуплекс 100 (фиг.б), который очищался электрофорезом на 10" ом п ли акриламидном геле, Этот ДНК дуплекс за тем Ферментно Фосфорилировался с использованием Т 4 полинуклеот(,( к,;л,лц и ","32 Р-АТР посредством указаннсл. них, процедуры.Экспрессируемая плазмида р 1101 с роилась путем сшивки 0,1 пикомоля (0,4 мк фрагмента ХЬа 1-Ва(п Нплазмиды рКЕ И 021 (107 на фиг.4), 0,025 пикомолей синтезнро. ванного фрагмента ДНК ( 1100 на фиг.б) и 0,3 пикомоля (0,08 мкг) Фрагмента.538 вр плазмиды рй М 575 в 24 мкл буферного раствора сливки с использованием Т 4 ДНК лигазы, После инкубации в течение 16 ч при 4 С смесь использовалась для трансформации Е,соИ 1 А 221 (Кг(ВВ). Трансформанты отбирались.на агаровых пластнах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, и23 1838413 5-СТЛГЛ 066 ТЛ 3"ЛЛЛЛТ(3 ТЛТЛТТГЛТТТЛЛТЛЛ(ГЛЛЛ 3 ЛЛ 3 СЛ 3 Л 3 С(ЛТТ 3 СССЛ133-ТССГЛТЛЛТЛТТЛСЛТЛТЛЛСТЛЛЛЛ 33 ЛТТ(:(,"(:( ТЛ 3 ЛГЛ 3 ЛС(;ТЛЛЛ(ГГТЛССЛ 3 ТССССТГ,-ЗТ 0 СТЛЛС(1 ССЛСЛ(СТ 5 Двухнитевой ДНК фрагмент синтезировался фосфотриэфирным способом с вводом короткой открытой рамки считки (цистрон) в переднюю часть кодиДанный фрагмент получался методом распознавательного фосфотриэфира, посредством которого получались следующие сегменты: 1) У-СГЛСЛССбТЛТГЛАИЛТОТАТАТТОАТПТААТЛАССЛС 3 2) 5-СЛЛТААТСЛТАТООЛ 1 ТТСССАЛССА 1 ТССССТС, , з 5-)схиасссспл 1 сспсаслллтсслтлтслтглпсс(ссп:зы 204) 5-ЛТТЛЛЛЛТСЛЛТЛТЛСЛТТЛ 1 ТЛЛТЛСССТИспользуя приготовленные, какукаэано выше, сегменты, осуществлялись катализированные Т 4 лигазой реакции соединения путем смешивания 5-нефосфорилированных сегментов 1 и 3 с 5-фосфорилированными сегментами 2 и 4 и воздействия на данную смесь Т 4 лигазы, Полученный дуплекс затем очищался путем электрофореэа на 10% полиакриламидном гоеле, Этот ДНК . дуплекс затем ферментно фосфорилировался с использованием Т 4 полинуклеатидокиназы, и )3 -АТР путем следующей процедуры. Э кспрессируемая плаз(ли(18 35 ЬОН р 1103 строилась путем сшивки 0,1 пико-: моля (0,4 мкг) фрагмента ХЬа-Х)о плазмиды р 1101 с 0,025 пикомолями синтезированного ДНК фрагмента в 24 мкл буферногоо раствора сшивки с использова ние(л Т 4 ДНК лигазы. После инкубации в течение 16 ч при 4 С эта смесь использовалась для трансформации Е,со 3 3 А 221 (МЯЛ 0-15014. Трансформанты отбирались на агаровых пластинах, содержащих 100 45 мкг/мл ампициллина, и обычным образом культивировались, как предпочтительный источник желаемой выраженной плазмиды р 1103 (фиг.7),Е, Построение Е.со 3 К 12 ВЙ 308/р 1 110 А.Плазмида р 110 описана в примерах Н публикации Европейского патента М 0217529, рассматриваемой здесь как ссылочный материал. Рестрикционная и функ циональная карта плазмиды р 110 представлены на фиг.8.Примерно 1 мкг плазмиды р 110 ДНК вываривалось с ферментом Яде в общем обьеме 20 мкл, содержащем 2 мкл высокосолееого буферного раствора 10 Х (1,0 моль рующей последовательности ЫН, Этот двухнитевой ДНК фрагмент имел указанную ниже последовательность: МаС 3, 0,50 моль Трис-НС, рН 7,5, 0,10 моль Мд С 2 и 10 мМоль дитиотриито),3 единицами фермента Ксе в течение часа при 37 С. Реакционная, месь экстрагировалась смесью фенол/хлороформ и ДНК осаждалась этанолом. Вываренная с Мсе плазмида р 1110 ДНК растворялась в 50 мкл буферного раствора Кленова Х (40 мМоль КР 04, рН 7, 5, 6,6 мМоль МоС; 1,0 мМоль 2-меркаптоэтанол, 33 мкмоль гАТр, 33 мкМоль сСТР; 33 мкМо)ь НОТР и 33 мкМоль ТТР), Дава микролитра ( 10 единиц Мед Епоапб В 3 оаЬз) крупного фрагмента ДНК полимеразы 1 Е,со 3, известного как фрагмент Кленова, вводили в данную ДНК и смешивали с ней, полученная реакционная смесь инкубировалась при 16 С в течение часа. Данная реакция завершалась путем экстракции фенолом и ДНК очищалась обычным образом,. Вываренная с К(е 1 и обработанная фрагментом Кленова ДНК затем сшивалась с Т 4 ДНК лигазой при 4 С в течение 16 ч. Полученная в результате ДНК использовалась для трансформации обычным образом ЛЧ 308 штамма Е,со 3 К 12 (КЛЛ.-15624), Трансформанты отбирались на -агаровых пластинах, содеркащих 100 мкг/(лл ампициллина, и плазмиды отделялись от полученных колоний путем быстрой. щелочной экстракции, описанной ВгпЬоп и Ооу. Была отобрана плазмида рЬ 110 А (на фиг.8) с отсутствием точки ссе,Р, Построение фага р)110 В путем сайтспецифическогоо мутагенеза.Процедура удаления сайта Вага Н в гене тетрациклин резистентной пугем сайтспецифическогоо мутагенеза показана на фиг,8.Г,Построение фага М 13 Тс 3.Плазмида р 110 служила в качестве источника гена тетрациклин-резестентной. Примерно 50 мкг плазмиды р 110 в 500 мкл буферного раствора ТЕ вводили в 25 мкл буферного раствора 10 Х Нп(3 33 и 170 мкл воды, Примерно 5 мкл ( 50 единиц) фермента Нпс 3 33 вводили в раствор ДНК плазмиды р)110 и образующуюся реакционнуюсмесь инкубировали при 37 С в течение 2 ч, Примерно 13 мкл 2 моль Трис. НС 1, рН 7,4, и 5 мкл ( 50 единиц) ограничительного фермента Есой 1 вводили в вываренную с Нпс 311 ДН К плазмиды р 3 110, данная реакционная смесь инкубировалась в течение более 2 ч при 37 С. Реакция прекращалась путемэкстрагирования реакционной смеси фенолом, насыщенным ТЕ; фенол удалялся путем экстракции хлороформом. Вываренная сЕсой 1-141 пс 3 111 ДНК плазмиды рН 110 затемизвлекалась путем осаждения и центрифугирования, вводилась в 10-й агарозный гель, выделялось и подвергалось очисткебольшое количество ограничительногофрагмента 4,3 кв Есой 1+11 пс 3 31. Примерно 5 мкг фага гпlЗспр 18 (13 едЕп 91 апс В 1 о 1 абз) растворялась в 50 мкл буферного раствора ТЕ, затем вываривалось сН 1 п 0 111 и Есой, как описано выше, Образованная Н 1 пс 111-Есой 3 ДНК фага М 13 гпр 18очищалась, как описано для р 1110, с той разницей, что был выделен и подвергнуточистке фаагмент -7,25 кб,Примерно 100 нанограммов фрагмента4,3 кб плазмиды рЬ 110 смешивались в примерно 100 нанограммали фрагмента 7,25кб Н 1 пс 3 111-Есой 1 фага М 13 гор 18, 2 мклбуферного раствора лигазы 10 Х, 1 мкл ( 100единиц) Т 4 ДНК лигазы и 14 мкл Н 20. Эта, реакционная смесь сшивки инкубираваласьпри 15 С в течение 1,5 ч, сшитая ДИК заключала в себе желаемую ДНК фага 1 ЗТсЗ, Рестрикционная и функциональная карта фага13 ТсЗ представлены на фиг.8.Один миллилитр ночной культуры Е.со 1К 12 1 М 109 (Е,со К 121 М 101, полученная изКем Еп 91 апс 3 В 1 о 1 аЬз, могла быть использована вместо Е,са 11 К 12 1 М 109) использовалидля инакуляции 50 мл питательного бульона, полученная в результате культура инкубировалась при 37 С с аэрацией до тех пор,пока ООвю не достигала значения от 0,3 да0,4, Клетки повторно суспензировались в 25мл 10 лМоль МаС 1, инкубировались на льдув течение 10 мин и собирались путем центрифугирования. Эти клетки снова суспензиравались в 1,25 ю 75 мМоль СаС 12; 200 мклаликвоту этих клеток удаляли, вводили в 10мкл сшитой ДН К, приготовленной как указано выше, и инкубировали на льду в течение примерно 40 мин, Смесь клетки-ДНК затем инкубировалась при 42 С в течение 2 мин, а различные аликвоты (1, 10 и 100 мкл) удалялись и вводились в 3 мл верхнего агара 33 питательный бульон с 0,5% агаром, поддерживаемом в расплавленном состоянии при 450 С), который также содержал 50 мкл 2 Х-ба 50 глкл 100 мМаль Ртс и 200 мкл Е.со 1 К 12, 1 М 109 в логарифмической фазе роста.1 О 20 25 ЗО 35 40 45 50 Смесь клетки - верхний агар затем помещалась на пластины с агаром, содержащим 40мкгд мл Х-Са 1(5-брома-хлора-индолилфО-тиогалактозид) и 0,1 мМоль РТ 6 (изопропил-0-тиогалактозид), а эти пластиныинкубировались при 37 С в течение ночи,На следующее утро несколько прозрачных в отличие от колоний индивидуальноиспользовались для инокуляции 2 мл питательного бульона 3, полученные в результате культуры инкубировались при 37 С саэрацией в течение 2 ч. Отсутствие синегоцвета говорит о том, что произошла желаемая вставка ДНК, Затем данные культуры5 центрифугировавались, и 200 мкл полученного поверхностного слоя вводили в 10 млкультуры ООко = 0,5) Е. со 1 К 12 1 М 109,выращенной при 37 С с аэрацией. Эти культуры инкубировались еще в течение 30 минпри 37 С; затем клетки гранулировались пу 0тем центрифугирования и использовалисьдля получения репликэтивной формы рекамбинантного фага, который они содержали, Двухниточная репликативная формаДН К фага была выделена из клеток с использованиемм процедуры, описанной в примере1 в уменьшенном масштабе, Трансфарманты, содержащие ДНК фага в 13 ТсЗ, былиидентифицированы путем рестрикционногоанализа фаговой ДНК.Г. (11) Получение аднонитевай ДНК фагагп 13 ТсЗ,Полтора глиллилитра ночной культурыЕ,со 3 К 12 1 Ы 109/гп 13 ТсЗ подвергали центрифугированиа, 100 мкл поверхностногослоя, содержащего фаг в 13 ТсЗ, использо-валась для инакуляции 25 мл культуры Е,соИМ 109 1 при ООыа примерно 0,4 - 0,5, Культура инакулиравалась в течение б ч при 37 Сс аэрированием, в течение этого временикультуру центрифугировали и полученныйповерхностный слой (примерно 20 мл) переносили в новую трубку, Примерно 2 мл раствора, содержащего 20;палиэтиленгликоля (РЕЯ) 6000 и 14,6,Л 3 аС 1, вводили в этот поверхностный слойцентрифугирования, который затем инкубировали на льду в течение 20 мин.Этот поверхностный слой центрифугиравали в течение 25 мин при скорости вращения центрифуги 700 аб/мин, иполученная гранула, которая содержала однаниточную ДНК фага в 13 ТсЗ, снова суспензировалась в 500 мкл буферногораствора ТЕ,Раствор ДНКдвукратно экстрагировалинасыщенным ТЕ фенолом и двукратно экстрагировали хлороформом. Затем осаждалась однонитачная ДНК с использованиемЛ 3 аОАс и этанола и подвергалась центрифу 183841325 45 в каждом из НОТР ТТР и ОСТР 1 мкл ( 2 ед, РЬаггпаса Р,1. ВосЬегпсаз, 800 Сепеппа 50 Ачепие, Рзсэтаучау, И. 08854) фермента гированию, Полученная грэнула промывалась 700 ь этанолом, высушивалась и затем растворялась в 60 мкл Н 20.Р.Мутагенеэ.Фрагмент однонитевой ДНК, используемый в мутагенезе, был синтезирован в автоматическом синтезаторе ДНК, Этот фрагмент имел указанную последовательность5-СССОТССТОТООАТАСТСТАСО ССОАи был гомологичен зоне, окружающей точку Вагп Н (5-ООАТСС) в придающем стойкость к тетрациклину гене от плазмиды рВЯ 322 с той разницей, что группа А вторая от конца 5 (или третья от конца 3) и редставляет собой С в плазмиде р 8 й 322. Такая замена не изменяет аминокислотный состав придающего стойкость к тетрациклину белка, но устраняет точку Вагп Н 1. Примерно 10 пикомолей мутаген ной затравки и универсальной затравки 13 (Вейезса ВезеагсЬ 1 аЬогатогез (ВЮ ) Р.О. Всх 6009, ОайегзЬцгд, МО 20760) обрабатывались отдельно 10 единицами (ВВ Т 4 полинуклеотидокиназы в 20 глкл буферного раствора киназы Х(60 мМоль Трис. НС 1, рН 7,8; 15 ммоль 2-меркаптоэтанола;10 мМоль МдС 2; 0,41 мКмоль АТР в течение 30 мин при 37 С, Обработанная кинэзой ДНК использовалась в операции мутагенеза, описанной ниже,Отжиг осуществлялся путем перемешивэния друг с другом 300 нанограммов (1,2 мкл) однонитевого фага 13 ТсЗ, 1 пикомоля (2 мклгуниверсальной затравки, 1 пикомоля (2 икл) мутагенной затравки, 2 мкл 10 Х буфериогоо раствора (100 мМоль Трис, НС 1, рН 7,5; 1 м Моль ЕДТА; 500 м Моль КаС) и 12,8 мкл Н 20, Реакционная смесь инкубировалась при 80"С в течение 2 мин, при 50 С в течение 5 мин и затем охлаждалась до комнатной температуры,. Реакция удлинения цепи осуществлялзсь путем ввода 5 мкл экстенсивного буферного раствора 10 Х(500 мМольТрис. НС 1,рН 8; 1 мМоль ЕДТА и 120 мМоль МдС 2), 5 мкл 2 мМоль, АТР, 1 глкл 6 мМоль раствора Кленова; 1 мкл (100 ед,) Т 4 ДНК лигазы; 17 мкл НгО в смесь аналелированной ДНК, Реакционная смесь вытягивания цепи инкубировалась при комнатной температуре втечение 1 ч, затем при 37 С в течение 2,5 чи затем в течение ночи при 4 С. Реакция прекращалась посредствомдвух экстракций насыщенным ТЕ фенолом,за которыми следовали две экстракции 510 15 20 35 40 СНС 3, ДНК осаждалась этанолом и МаОАс. ДНК извлекалась путем центрифугирования и повторно суспензировалась в 50 мкл Н;О, 6 мкл буферного раствора 10 ХЯ затем вводили в этот раствор ДН К,Раствор ДНК был распределен поровну в три трубки. В две из этих трубок вводили примерно 200 единиц (Мез 1 аЬога 1 огез Я) нуклеазы, Одна реакционная смесь инкубировалась при комнатной температуре в течение 5 мин, другая в течение 10 мин. Реакции прекращались путем экстракции реакционной смеси двукратно насыщенным ТЕ фенолом. За фенольным экстракциями следовали две экстракции хлороформом; затем ДНК осаждалась из реакционной смеси МаОАс и этанолом. Не подвергнутый обработке образец ДНК служил в качестве негативного контрольного образца.Обработанные Я образцы хранились отдельно друг от друга в ходе остальной части процедуры, но результать 1 получались аналогичные.Гранулы ДНК повторна суспензировались в 20 мкл Н 20, 10 мкл полученного раствора использовалось для трансформации Е.со К 12 М 109 (Е,со К 12 М 101 также можно было использовать) согласно процедуре, используемой при построении фага гп 13 ТсЗ с той разницей, что ни рТО ни Х-Оа не подавали на пластины,Двухнитевая репликативная форма ДИК была выделена примерно из 48 колоний как описано выше и отобрана на присутствие ограничительной точки Вагп Н. Маоляты без точки были отобраны путем получения однониточной ДНК, как описано выше, Однониточная ДНК была построена в форме последовательности с использованием метода построения дидеоксипоследовательности (.Н.ЯгпЮ 1980 г., "Методы в энзимологии", 65:560-580). Желаемый изолят был обозначен р 110 В (фиг.8).О, Построение плазмиды р 110 С.Г 1 римерно 50 мкг репликативной формы ДНК фага р 110 В вываривались в 250 мкл буферного раствора Х Иде (50 ММоль ИаС 1;6 мМоль Трис. НС 1, рН 7,5; 6 мМоль МдС 2 и 6 мМоль Р-меркаптоэтанол), содержащего 50 единиц фермента Мбе при 37 С в течение 2 ч, 5 мкл, 5 мМоль КаС затем вводили в обработанную Кбе ДНК фага р 1108, после чего вводили 5 мкл ( 50 единиц) фермента Яа. Вываривание продолжалось в течение 2 ч при 37 С. Желаемый фрагмент422 Юе 1-Яа 1, содержащий мутантную тетрациклин-резистентности гена, затем был выделен из акриламидного геля,ДНК плазмиды р 110 А затем вываривалась с Мсе и Яа в аналогичных условиях,1838413 ЗО 40 тифицировалась среди трансформантов путем отделения плазмиды и последующего рестрикционного анализа, 1, Построение плазмиды р 1104 Плазмида рСЕВ 336 представляет собойвектор экспрессии, который использует и ромотор ЛрЬ. Для соединения ОАСИОАОСЯ с промоторомЯр в плазмиде рСЕВ 336, необходимо использовать синтезированное связующее звено ДНК. Это свяэующее звено соединяло сайт Ибе плаэмиды рСЕВ 336 с сайтом Язб в кодиру-, ющей последовательности ОАСЯ/ОАОСЯ и 50 имело приведенную ниже структуру: 7 з-тлтслсттссллссттсссстстттсстстлслсслсстсллслсссссллсстсстслссслсст-з уууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууууу3-лстсллссттссллсссслслллсслслтстсстсслстстсссссттсслсслстсссотличающихся тем,.что фаг р 1.110 В был заменен плазмидом р 110 Л. Ограничительный фрагмент -6,1 кб Ыеа 11 плазмиды р 1.110 А был очищен от агарозы,Желаемая плаэмида р 1110 С была построена путем сшивки друг с другом 100 нанограммов каждого из фрагментов Мбе 1- 5 а 11 плазмиды р 110 А ("6,1 кб) и р 1110 В ( 422 п.о.) с использованием обычной процедуры, Желаемая плазмида 110 С придает устойчивость к 10 мкг/мл тетрациклина в Е.со 1, но не имеет сайта Вагп Н 1 тетрациклинреэистентности гена,Н. Построение плазмиды рСЕВ 111.Плдзмида рСЛВ 111 была построена путем сшивки фрагмента 3,5 кб ЕсоВ 1-Рз 11 плаэмиды р 1110 С (содержащей не поврежденную кодирующую последовательность) с фрагментом 3 кв ЕсоЯ РзО плазмиды Р 1 Т 160. Плаэмида Р 1 Т 160 содержала фрагмент - 3 кб ЕсоЯ-Рзт 1, образованный от плаэмиды р 110 С, вставленной в обработанную ЕсоВ 1-Рзс плазмиду РЧС 18 (Нею Еп 91 апг 1 ВоаЬз). Этот фрагмент - 3 кб содержал ген тетрациклинрезистентности плазмиды р 110 С с той разницей, что сайт Сабыл исключен. Рестрикционная и функциональная карта р 1 Т 60 представлены на фиг.9, Плаэмида р 1 Т 160 могла быть образована от Е.со 1 К 12 1 М 109 (р 1 Т 160, имеющейся в лаборатории МЯЯ 1, где она хранится под номером МЯИ В) в основном согласно процедуре, описанной в примере 1, Плазмида р 1 Т 160 придает устойчивость к 10 мкг/мл тетрациклина и в ней отсутствует сайт рестрикции, Са. Тетрациклин реэистентности плэзмиды рТ 260 очищался на фрагменте Рзт 1-ЕсоЯ 1 для использования в построении плазмидь рСЕВ 11.Примерно 50 мкг ДНК плазмиды р 110 С (пример 26) инкубировались в общем обьеме 250 мкл 1 Х ЕсоВ буферного раствора, содержащего 10 мкл ( 50 единиц) ЕсоВ 1, в течение 2 ч при 37 С. Затем вводился 1 мкл ( Б единиц) рестрикционного фермента, и инкубация продолжалась при 37 С, Аликвоты удалялись примерно каждые 5 мин и экстрагировались электрофоретически на агарозном геле, Желаемый фрагмент 3,5 кб ЕсоВ 1-Рз 11 содержал неподвергнутый воэдействиЮ ген в 6 Н и включал внутренний сайт Рз 11 (на нарезаемый в ходе частичного вываривания с РЫ 1). Желаемый фрагмент 5 10 15 20 25 30 35 отделялся от нежелаемых фрагментбв: фрагмента 2,5 кб Рзт-РзО, который содержал лишь часть гена в СН, фрагмента 3 кб ЕсоВ 1-Рз 11, который содержал ген тетрациклинрезистности; и фрагмента - 6,5 кб ЕсоЯ 1 (невываренный Рз 11). Фрагмент -3.5 кб Рзт-ЕсоВ 1 очищался и сшивался с фрагментом 3 кб РзО-ЕсоВ 1 плазмиды р 1 Т 160, Сшитая ДНК использовалась для трансформации Е.со К 12;1 М 109, и желаемая плазмида, обозначенная рСЕВ 111 и показанная на фиг,10, выделялась из трансформанта и характеризовалась с помощью общепринятых методик, Плазмида рСЕВ 111 также могла быть получена из лаборатории МВВ 1, где она хранится под номером ИЯВВ,1. Построение плазмиды рСЕВ 336.Плазмида рСЕЯ 336 является вектором экспрессии, построен н ым на основе ХЬа 1- Ващ Н 1 фрагмента плазмиды РСЖ 111(пример 2 Н) и двухцистронной структуры ОН от плазмиды р 1103 (пример 2 Д и фиг,7), Примерно 50 мкг плазмиды р 1103 инкубироеалось в 250 мкл высокосолевого буферного раствора 1 Х, содержащего 50 единиц каждого иэ ферментов Ваго 11 и ХЬа 1 в течение 2 ч при 37 С. Фрагмент "650 п,о. ХЬа-Вап 1 Н 1, содержащий первь 1 й цистрон, и ген, кодирующий последовательность СН, отделялся и очищался от акриламидного геля, Примерно 50 мкг плазмиды рСЛВ 111(прил 1 ер 2 Н) также вываривалось с ферментами ХЬа 1 и Вала Н 1 и большой фрагмент ХЬа 1-Вап 1 Н очищался от агарозы. Два фрагмента ХЬа 1- Вав Н 1 сшивались вместе друг с другом, и сшитая ДНК использовалась для трансформации Е.со К 12 ВЧ 308 (КЯВН) с использованием общепринятых процедур. Желаел 1 ая плаэмида РСЕЯЗЗб (фиг,11) иден 1838413Эта связующая молекула была синтезирована в автоматическом синтезаторе ДНКв виде двух одиночных нитей с использованием общепринятых процедур, Эта связующая молекула имеет несколько отличий отестественной последовательностиСерЬаоэрог 1 ца, ни одно из которых не оказывает цежелательногоо влияния на белок,кодированный получаемой последовательностью, Эти изменения включают: 1) образование сайта Лде 1, включающеготрансляционную инициирующую. току; 2)замену С на А в третьем положении кодона1 О, который составляет лейциновый кодон,поскольку СТС и СТА эквивалентны, образуя сайт ХЬа 1 и 3) замену С на Т в третьемположении четвертого кодона, который составляет алиновый кодон, поскольку 6 ТС иСТТ эквивалентны.Для облегчения последующего клонирования связующая молекула клонировалась в плазмиду рОС 19 (Лев Е 191 апд8 оа Ь э).. Примерно 5 мкг плаэмиды рОС 19 рас творялись в 50 мкл буферного раствора 1 ХБы 1(50 мМоль ИаС 1; 50 мЫоль Трис, НС 1, рН-7.5; 10 мМоль М 9 С 12), содержащего -10единиц фермента Яэт (ВВ 1), Данная реакционная смесь инкубировалась в течение 2ч при 37 С, Концентрация Л 1 аС 1 в реакционной смеси затем увеличивалась до 150мМоль путем добавления 1 мкл 5 мол, Л 1 аС 1,Вводили примерно 2 мкл (10 единиц)фермента Лде 1 и смесь инкубировалась втечение еще 2 ч при 37 С. Затем осаждаласьДНК и извлекалась путем цеприфугировация,Примерно 100 нанограммов вываренной в Яй-Л 1 де плаэмиды рцС 19 смешивалось с 1 пикомолем синтезированногосвязующего в буферном растворе лигазЬ сТ 4 ДНК лигазой, Сшитая ДНК использовалась для трансформации клеток Е,со К 121 М 109. и аликвоты этой смеси высевали начашки на 1-агэре(питательный бульон 1 с 15г на литр агара), с содержанием 100 мкг/млампициллина, 40 мкг/мл Х-ца 1 и 40 мкг/млРТ 6.Эти чашки инкубировались при 37 С втечение ночи. Колонии, содержащие плазмиду беэ вставки, такие как Е.со К 121 М 109/рОС 19, проявляли синий цвет наэтих чашках, Колонии, которые содержалиплазмиду с вставкой, такие как Е,со 1 К 12М 109/о 1104, были белыми. Отбиралось несколько белых колоний и осуществлялся ихотбор методом рестрикциоцногоо анализаих плазмиднойДНК на присутствие фермента -60 Ьр Лде 1 Язб с той же последовательностыо, что и синтезированный, какуказано выше, фрагмент. Типичный изолят желаемого построения обозначен как плазмида р 1104 (фиг.12).К, Окончательное построение плазмидыр 1 Т 507Плазмида р 1 Т 507 была построена путемсшивки содержащего кодирующего последовательностьОАСЗ/ОАОСЪ фрагментаЯы 1-Ват 111 плазмиды р 1 Т 508 с вставкойЛ 1 де 1-БэО плазмиды р 1104 и с расщепленным Лде 1-Вап Н фрагментом плазмидырС 28 336, Фрагмент 2,2 кб Ям 1-Вагп Н .плазмиды р 1 Т 503 (пример 1) получен путемполного вываривания с Вагп Н 1 и частичноговываривания с ЗэО (другой сайт Яэ 11 расположен на -50 п,о, от сайта Вагп Н в желаеглом фрагменте 2,2 п.о.),Плазмида р 1 Т 503 в количестве примерно 50 мкг растворялась в 250 мкл буферногораствора 1 Х Яэе 1, содержащего 50 единицВагп Н 1, и реакционная смесь находиласьпри 37 С в течение 2 ч, Затем вводили одинмкл (-10 единиц фермента Яэ 0) осуществлялась реакция при 37 С. Аликвоты удалялиськаждые 5 мин, охлаждались смесью фенол/СНС 1 з, осаждалась ДНК и осуществлялась грануляция путем центрифугирования,Фрагмент -2,2 кб Яэт 1-Вагп Н 1, содержащий наибольшую часть кодирующей последовательности экспандазы/гидроксилазы,выделялся и очищался от 6% акриламидногогеля,Примерно 50 мкг ДНК плазмиды рС 2 Я336 (пример 21) суспецдировались в 250 мклвысокосолевого буферного раствора, содержащего примерно 50 единиц каждого изферментов Лде или Вагп Н 1 и смесь находилась при 37 С в течение 2 ч.Фрагмент ф 3,8 кв Лде 1-Вагп Н 1 плазмиды рС 2 Я 336, который це имел кодирующейпоследовательцости, затем был выделен йзагарозного геля.П ри мер но 100 гл кг пл аз миды р 1104 (и ример 21) суспендировалось в 500 мкл буфер 5 .10 15 20 25 30 35 40 ного раствора 1 Х Язв, содержащего примерно 100 единиц фермента Яэ 11, и эта смесь находилась при 37 С в течение 2 ч, Концентрация Л 1 аС затем увеличивалась от 50 до 150 мМоль путем добавления 10 мкл 5 50 моль Л 1 аС 1. Вводили поимерно 20 мкл ( 100 единиц) фермента Лде и смесь инкубировалась дополнитегьцо 2 ч при 37 С, Желаемый фрагмент 60 вр Л 1 де 1/5 Ы очищался от 15% агарозного геля. 55 Примерно 100 нанограммов фрагмента5,8 кб Лде Вагп Н плазмиды рС 2 В 336,100 нанограммов фрагмента -2,2 кв Яэс- Вагп Н 1 плазмиды р 1 Т 503 и 50 нанограммов фрагмента - 60 рв Ям 1-Лде плазмиды р 1104 сшивались вместе с лигазой Т 4 ДНК, ЗЗ 1838413Сшитая ДНК использовалась для трансформации клеток Е,со К 12 1 М 109 с использованием обычной процедуры с той разницей, что клетки выращивались при 30 С, а не при 37 С (для предотвращения транскрипции от АрЬ). Сшитая ДНК смешивалась с 100 мкл компетентных клеток М 109 (промышленно получаемых Ятгатадепе Согр., 3770 Еапзу Боргест. Сан Диаго, Калифорния, 32121), инкубировалась при 4 С в течение часа, затем инкубировалась в течение 1 мин при 42 С и затем разбавлялась 2 мл свежего питательного бульона и инкубировалась при комнатной температуре (без встряхивания) в течение часа, Аликвоты высевались на чашках с агаром, содержащим тетрациклин, 10 мкг/мл, Чашки инкубировались при 30 С. Трансформанты Е.со К 12 1 М 109/р 1 Т 507 идентифицировались путЕм рестрикционного анализа плазмидной ДНК, Рестрикционная и функциональная корта плазмиды р 1 Т 507 представлены на фиг,11.П р и м е р 3. Определение продуцированной Е,со 1 активности ОАС/ОАОСЗ.А. Культура Е.со 1 К 12 М 109/р 1 Т 507: экспрессирующая активности ВАС.)/ОАОСЯ.Трансформанты Е.со 1 К 12 1 М 109 (р 1 Т 507(приМер 2 К) выращивалась пр.и 30 С в течение ночи в 500 мл питательного бульона 1 (содержащего 10 мкгlмл тетрациклина) в гироторном инкубаторе, вращающемся со скоростью 250 об;/мин, Клетки разбавлялись (1;10) путем ввода 100 мл ночной культуры в 900 мл свежеприготовленной среды, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина, в 2,8 л колбы ГогпЬасЬ и дополнительно инкубировались в течение часа при 30 С в тех же условиях выращивания, Температура воздушного встряхивателя затем повышалась до 42 С, инкубация продолжалась дополнительно в течение 6,5 ч. Чувствительный к температуре репрессор с 1857 лямбда р промотора, установленный таким образом, что обеспечивалась экспрессия ОАСЯ/ОАОСЯ на плазмиде рТ 507, был инактивирован при 42 С и, таким образом, допускал экспрессию ОАСЗ/ОАОСЗ. После инкубации клетки собирались путем центрифугирования и использовались как предпочтительный источник продуцирования активности ОАСЯ/ОАОСЗ.В. Иллюстрация активностей экспандазы и гидроксилазы в клетках Е.со 1 К 12 1 М 109/р 1 Т 507, выращенных при 42 С,Пример 14 г (сырая масса) клеток Е.со 1 К 12 1 М 109/р 1 Т 507, приготовленных как описано в примере 3 Л, повторно суспендирова 30 35 с использованием 0,28 мМоль пенициллина40 й 60 мМоль а-нетоглутарата (а-КО), 0,06 мМоль сульфата железа (двухвалентного),50 55 . вался методом жидкостной хроматографии высокого давления следующим образом, Ак 5 10 Ф 15 20 25 лись в ТрисЕОА буферном растворе (15 мМоль Трис. НС 1, рН 7,5; 10( глицерин;10 Я, этанол; 10 мМоль дитиотрситол; 10 мМоль аскорбат) в общем объеме 20 мл. Клетки разрывались путем пропускания звука при 4 С или ниже тремя 30-секундными импульсами полной мощности, В ходе пропускания звука осуществляли многоократный ввод фенилметилсульфонилфторида (рМЯЕ) до тех пор, пока окончательная концентрация не становилась равной 2 мМоль. Вводили декоксирибонуклеазу и сульфат магния до тех пор, пока не достигались концентрации соответственно 1 мкг/мл и 2 мМоль. Подвергнутая пропусканию звука суспензия подвергалась центрифугированию со скоростью 40000 Ь в течение 30 мин. Поверхностный слой заключал в себя сырой экстракт фермента ОАСЯ/ОАОСЯ,Этот сырой экстракт объемом 13 мл вводился в 50 миллитровую колонну ДЕАЕ-Тризакрил, предварительно уравновешенную с 15 мМоль Трис-ОЕОА, рН 7,5. Колонку промывали 4-мя объемами 15 мМоль буферного раствора ТрисЕОА и затем линейным градиентом от 0,015 мМоль Трис-ОЕОА до 0,3 мМоль Трис-ОЕОА. Пятимиллилитровые фракции собирали при скорости потока 15 мл/ч. Фермент элюировался как один основной пик активности,Активности ОАОСЯ (экспандоза) и ОАСЯ (гидроксилаза) элюировались с тем же временем удерживания,Ферментную активность определяли, осуществляя анализ, основанный на жидкостной хроматографии высокого давления. Катализированная экспандазой реакция осуществлялась в течение 15 мин при 30 С 0,67 мМоль аскорбата, 1 мМоль дитиотреитола, 0,05 мМоль АТР. и 0,000-0,00 ед. фермента в 1 мл 50 мМоль Трис. НС 1, рН 75. Катализированная гидроксилазой реакция осуществлялась при 360 С в той же среде с деацетоксицефалоспорином С концентрацией 0,05 мМоль вместо пенициллина й,Ферментные реакции прерывались путем добавления 1 мл этилового спирта. Осажденный продукт отделялся путем центрифугирования при 4000 х 9 в течение 5 мин. Поверхностный слой, содержащий ферментные продукты реакции, анализиротивность экпланлазы была определена путем измерения образования как ОАОС, так и ОАС из пенициллина ввиду явной бифунк183 Ь 413 Частичная очистка ОАОСЯ и ОЛСОН от 14 г Е.соП К 12 М 109/р Т 511. й продукта в минуту на миллилитр экстракт милли и = наном Не определено. циональности фермента, Активность гидроксилазы определялась путем измерения образования ОАС из ОАОС.Аликвоты (от 20 до 100 мкл) поверхностных растворов анализировались на ОАОС и ОАС посредством жидкостной хроматографии высокого давления (НР.С) с использованием внешних стандартов. Предпочтительная система ПР С включала два компонента: систему регулятора модели 721 модуль данных модели 730, насосы модели 510 ЕР, водяной артикуляторный процессор образца модели 710 В и спектрофотометр лямбдамакс модели 4811 С (Юатегв АпосМНог, М.А.) ВАС и РАОС разделялись предпочтительно с помощью колонки с радиально упакованными опрессованными микроБондпэк(ОЯ х 10 см) (И/а 1 егз Лззос.) с подвижной фазой 2 уксусной кислоты; 0,47 ь метилового спирта,.6 - 7% ацетонитрила; 87 - 92( воды; рН 8, Скорость потока составляла 1,5-2,0 мл/мин, детектирование осуществлялось при 260 нм (цефалоспоринхромор), Результаты анализа были воспроизводимыми с 2 отклонениями при дубликатных анализах 5 катализированных как экспендазой, так игидроксилазОй, и гидроксилазой реакций.Для анализа экспландазы количественная оценка на ОАС (в дополнение к количественной оценке ОАОС) корректировалась на пе нициллин М виду совместного элюирования.Рсзультаты анализа приведены ниже. формула и зоб рете н и я 15 Способ экспрессии ОАСИЭАОСЯ активности в клетках Езсйег сЫа соП, заключающийся в том. что осуществляют трансформацию штамма-реципиента Е. соП К 12 1 щ 109 рекомбинантной плазмидной 20 ДНК рТ 507 с последующим отбором клонов, экспрессирующих ОЛСОН/ОЛОСЯ-активность.1838413 Есор рангсюУ 1 Рюа р КЕМИЕст Нр АХ 950 др НраЭБгаутегйЖи 1ядр АЬ 1 Ргаумп 1ЕсаР 1 г.Жег7 БгузкиеЕса Р 1 юл 11 4 ОБр сюР 1Л армвР юХ РраХ КаЧ ЕсоР 1 ФЯа,Ы 7 е Рйтрйа 1 ааев высокой степени гомологичны в своей нук- На фиг,1 показана рестрикционная илеотидной ОАОСЯ последовательности сое- Функциональная карта плазмиды р 1 Т 503; надинениям ДНК, кодирующим активность Фиг,2 - рестрикционная и функциональныеОАОС и/или ОАС 5 в других продуцирующих карты, производные и взаимосвязь плаэмидцефелоспорин организмах. таких как 5 рКЕМШ (101), рВ В 322(102) и 103, промежуЯсгерсоеусевсачи 119 ег 1 ез. Ввидуэтойгомо- точных плаэмид в построении плазмидылогии отвечающие настоящему изобрете- рСЕВ 336; на фиг.З - рестрикционная и фуннию соединения ДНК, кодирующие кциональные карты, производные и взаимоОАСЯ/ОАОСБ, могут быть мечены и исполь- связь плазмид 103, 104 и 105,зованы для отбора геномных библиотек ор промежуточных плаэмид в построенииганизмов, которые продуцируют плазмиды рСЕВ 336; на фиг.4 - рестрикционцефалоспорин С или аналогичные соедине- ная и функциональные карты, производныения на присутствие либо ДНК, кодирующей и взаимосвязь плазмид рКЕИ 021 (106 и 107)ОАСБ, либо ДНК, кодирующей ОАОС, Мно- и рКЕ (101), промежуточных плазмид в погие организмы включают ДНК,.кодирующую 15 строении плаэмиды рСЕВ 336; на фиг.5 - реактивность ОАСЯ/ОАОСЯ, которая может стрикционная и Функциональные карты,быть идентифицирована и выделена с ис- производные и взаимосвязь плаэмид рсгрпользованием соединений ДНК, отвечаю- ЕО 50 сЬ ОН 800 (,108), рВВ 322 (102 ищих настоящему изобретению. РИМ 575), (109), промежуточных плазмид вОтвечающие настоящему изобретению 20 построении плазмиды рСЕВ 336; на фиг,6 -соединения ДНК, кодирующие рестрикционная и функциональные карты,ОАСБ/ОАОСЗ, были выделены в сочетании производные и взаимосвязь плазмидсрегуляторнымипоследовательностями,ко- р 1 чМ 575 (109), рКЕМ 021 (107) и рИМ 702торые контролируют транскрипцию и в ко- (р 1101), промежуточных плаэмид в понечном итоге выражение активностей 25 строении плазмиды рС 2 В 336; на фиг.7 - реОАОСЗ/ОАСЯ. стрикционная и функциональная картаНастоящее изобретение включает так- плазмиды р 1108, промежуточной плазмиже регуляторные сигналы гена ды в построении плаэмиды рСЕЯ 336; наОАСЯ/ОАОСЯ, расположенного у 3-конца фиг. 8 - рестрикционная и Функциональкодирующей области гена ОАСИРАОСЯ 30 ные карты, производные деривитизации иСерЬа 1 озрог 1 оп аегегпопав, Эти 3-регу- взаимосвязь плазмид рЕ 110, р 1110 А, иляторные последовательности кодиру(от р 110 С и бактериофагов п 13 и гр 18,транскрипционную терминацию и полиаде- в 13 Т сЗ и р 1108, промежуточных векнилированиетРНК,исигналы процессинга, торов в построении плаэмиды рСЕВ 336;гена ОАСЫОАОСЯ, 35 на фиг, 9 - рестрикционная и функциональОАС-диацетилцефдлоспорин С ная карта плазмиды р 1 Т 160; на фиг,10 - рестрикционная и функциональная карта плазмиды рСЕВШ; нафиг. 11 - рестрикционная и функциоОАСЯ-деацитилцефалоспорин С синте нальная карта плазмиды рСЕВЗЗ 6; натаза, ферментная активность, которая ката- Фиг.12 - . рестрикционная и функциолизирует конверсию ОАОС в ОАС. нальная карта плазмиды рТ 507.ОАОС-деацетоксицефалоспорин Скн, о Последовательность ДНК гена45 ОАСЯ/ОАОСЯ (гена зкспандаза/гидро 1 11 нвой к-,1 ( 1 лиза)я.Онасо,он 20 ЗО . О5 5-Л ЛОС ТГО ТЛС ГСЛ ГЛЛ ТТА ЛОО СТТ ОСЛ СОЛ ТТС САТ ;С ООТ СТС(0 гО80слс 1 лт сло осл ссл тс)С лсо АТл слт лп. стс сто ГГл лсс лл(з ллс100 Т 40 20 30 140ОЛ 0 ЛЛО ЛОА ЛСТ С(лЛ ГГО СТТ ГТТ ЛТ 0 ЛТТ ГОТ ТСЛ ГАА ЬЛС ТТС ЛГЛ10 1 О СО - 70 ИО 1 ЗОЛОЛСЛС ТСО ТСО ГГ ТЛС АЛТ СС 1 АСА ТТС ЛСС ТГ; 0 С( ОСС ЛЛО ОГТ200 210 220 230ОЛ(; (ОС АЛО СЛС (;ОС (ТС ЛСТ ТЛС (ОС ТАЛ ОТА ССЛ ОТТ ОТГ ГЛЛ АЛА20 2.) о 260 270 28015 0 ОЛ ГГТ СС Г СОО С 6 Т ЛЛО СТЛ СОЛ 00 Т (СО ("ГТ ТОА 1 ЛГ ЛЛ ГХ ЛТЛУйХЙУ ФигЯ Составитель Н, БурбелТехред М, Моргентал Редактор С, Кулакова ре. Шулла Заказ 2905 Тираж ВНИИПИ Государственного комитета по изо 113035, Москва, Ж, РаПодписноетениям и открытиям при ГКНТ СССРская наб., 4/5(,Л ОС ГАС 4 О ЛГТ ТСС ЛА 6 ТНВ Я(,"В 1 УБТОЛ АТС7 ОЛЛ С4 )6 ТТТЧЛ 1. РНЕ ОТС ССС ЧЛ 1, РВО 5 о ГЛ 6 СГС 61.И .ЕИ 440 6 лс 6 лс Гтс ААО ЛЫР ЛКР 1.ЕЦ 1,УЯ450 76 ЛЛЬ 6 ТС СТС АСС .У 5 ЧЛЕ. 1.ЕЦ Т(й20 47 ОАИС (;(СЕВ ("1,У 50АС ТТСГ.Е РВЕ ГСС 6 СЛГ.А ЧЛ 1.25о6 ЛС САСЛЬР АЯР 480 АСС АСС тнк тнв 49 АЛ 6 66 Т 1 УБ 61.Узо 510 52 СА 6 Л 6 С 66 С СТ 6 6 ТС 61,Ц БЕК 61.У 1.ЕЦ ЧА 1.40 5 оотлс тт 6 АссГуй 1 ец тнв35550(;ш тик суь50 560 ьт сдс ттт ЧА 1, ЛБР РНЕ5 Зо6 АС СЛС АСС ТС 6АяР ны тнв яей580Л 6 С 6 А 6 6 Л 6 СА 6БЕВ 6 ЕИ 61,И 61.Ц60 54 О Ссс ат А 1.Л ЛИС 570 АДС ГГД АЫ( 61.У ТТС ЛЛ 6 РНЕ 1,У 551 О С 6 Т ААС АВ 6 ДКК 590 600 6ЛЛ 6 А 66 ьС 6 Т 6 АС 6 СТС 6 СС 6 АС1 уБ лвс л(,А чл 1, тГВ 1.ец А 1.л АБР65 70640 650.с тс 6 А 6 т 66 СА 6 л 6 с лсс СссЛ 1.Л 1,ЕО 6.И ТКР ГГ,Ц ЗЕВ ТНВ А 1;А80 .85690 700тс 6 6 Ас тлс тс 6 Асб тбс тлс тсс."Ей ЛБР ТУВ БЕВ ТНВ СУБ ТУК ЯЕВ95 100 620 6 СС С 6 С Л 1,Л ЛВС660 670 СТС 6 ТС ЛСС ГЛ 6 ЧЛ 1. ЧЛ 1. ТНВ Г 1,Ц90 630 ТТС ТСТ РНЕ 5 ЕВ С 6 Г. 66 СЛВ 6 61,У75 680 АЛ 6 ТАС 1,УЯ ТУВ710А 16,Г 16 С АТС 66 С 1(ЕТ 61 У 11.Е 61.У105 ЛС 6 66 С ТНВ 61 Л 20 Х-ПОВ720 730 , 740 750 . 760СЬС ЛЛ(. (.Т 6 1 ГС СС.Ь ЛА(. ССь Г 1( С 1 ТС ЬЛ 6 6 ЛС ь(. ТСЬ СЛ 6 6 ЛС, АС61 у лвм 1.ец Рне Рйд ля Аво (1 у Рве 6.ц лыР чл. В 1 Гш л 81 туй110: 115 (20770 , 780 . 790 800 8 ОТТС 6 АС ГОС А 6 ТА 66 ССА .С ЛЛ 6 САТ ОТС 66 6 СС (;" СРНЕ Л 1 АВ 6 ИЕ 1 УЙ. (3 У А.А Л.Л .Х 8 А.Р ЧЛ 1. Л 1,Л АВ 6 . Л ЧЛ 1. .Ец125 30 , 35820 830870 850 86010 ААС ТСТ (Г 6 (6 С 6(.С СС( Ст(. (СС ь.",6 (Ль 6 ЛС ЛТТ ОЛТ ЬАС Ттс 6 СА 8 и 5 ев чл 1 (1.х А 1.А РВО (еО А 1.А 61.У 61.И М 1 11,е А 81 АЯ 1 Рне чл 1.140 45 , 150 "870 880 890900 . 9106 Л 6 6 С СЛТ СГС С(. СТС (:Я; СТА С 66 ТАС Т 1 С ССС 6 ЛА С 6 СС 6 6 ЛС61 И СХ 5 ЛР РВО 1.Е( 1.ЕИ АВЬ 1.ЕЦ Л(6 ТУВ РНЕ РВО 61.Ц ЧА 1 1 О 61.Ц155 160:. 165 1 70920 930 940 9506 АС СОС Ь"С СГС 6 ЛА 6 Л( СЛА ССС СТС С 6 С АТ(э 66 А СССАС ЛС (юАСЛдР ЛВ 6 ЧЛ 1. Л.Л 61,( 61,И С 3,Н ВО Ц.Ц АВ 6 ЕТ 61.Х РВО Н(8 ТУВ Л)Р175 180185960 97 О 980990 1000стл с 6 л(.:с лтс А 6 стс стс слс ГА 6 АсА 6 сс тбс (асс ААс Сьс ттс1 ЕЦ 8 ЕВ ГНВ 11,Е ГНВ 1.ЕЦ ЧЛС Н 15 Ь 1.К ТНВ Л 1.А СЛ А(.Л АЯ С.У РНЕ190 , 195 2001838413 25 1010 1020 1030 1 ОСО 1050СТС ЛСС СТС ГЛС ТСГ СЛС СТС СЛГ Л СЛЛ ТТС СС СЛС (.ТС ССС ЛССЧЛ 1. БЕВ 1.Е 0 ЯЛ СУЙ (1 Л ЧИ. ЛЬР (ф 1,У СЛЗ Е ЧЛЕ МР .ЕИ РВО 1 В205 215, . 1060 1070 1080 1090 1100СТС С(; ССС ССС АТ С 1 С СГ(: ТС ТСС ССС ССС СТО ССС ЛСС СТС ССС1.Е 1 РВО СЛ Л 1.Л НЕ ЧЛ 1. ЧЛ 1, РНЕ ГЛ С 1,У Лг.А ЧЛЬ С 1 Л НВ ЫЮ АИ220 225 2301110 1120 1130 1140 1150АСС ССС ССС ЛЛС С(: ЛЛС И,6 ССС ЛЛС СЛС ГСС СТС ЛАС ТОТ ССС СССТНВ СГЛ С 1 Л 1 ЛБ ЧА 1. 1 ЛБ ЛИ 1 ВО 1.УЯ Н 13 ЛВС ЧЛ 1. ТЛЯ ъЕВ РВО С 1.У235 240 245 2501160 1170 , 1180 1190ССС СЛС СЛС (:СС СТО ССС ЛС(. ЛСС ССС АСС ТСС ЛСС СТС ТТС ТТС СТСЛЙС ЛИР С 1,ЛВС ЧА 1. СТЛ Я. 8 ЕВ ЛВС ТНВ БЕВ ЗЕВ ЧЛ 1. РНЕ 1 НЕ ЕЕЦ255 260 26512001210 1220 1230 1240ССС ССС ЛЛС ССС САС ТТС Л: ТС ААС СТС ГЛС СЛС ТСС ЛСС СЛС ТССЛЙС РВО тлз РВО АЯ РНЕ Ы РНЕ ЛЯ ЧЛ 1. С 1 Л С 1.1 ЯЕВ ЛВС СЬЦ ТВР270 275 2801250 1260 ГП 0 1280 ф 1290ССТ ТТС ЛЛСЫС ССГ: АГС (:(:( ТСС СЛС ССС.ЛСС ЛСС ТТС ЛСС СЛС ТСССТЛ РНЕ ЛИК ЧЛ 1. АВ( 11.Е Р 0 БЕЙ С 1 Ц ЛВГ ТНВ ТНВ РНЕ ЛВС С 1,Ц ТЙР285 290 295 30 40 Х1300 3 О1320 1330С 1 Т ССС 606 АЛО ТЛТ СТГ АЛО ЛТС (.(С ЛС (ЛТ АЛС СГС ССС ССЛ1.Е(1 (1 Я Г 11.У Л 1 ТЪВ ЧА 1. АЯ НЕТ АВС А(С ЛЯР 1,УБ РЮ А 1.Л Л 1.Л300 305 . 3101350 1360 1370 1380СЛС (СС СГТ СГС ССС Ы,С С(:1 ССС ( СТ СТС ТСТ ЛСГ СЕЛ ССТ СОТСЛЯ Л 1.А Л 1.Л ЧЛ 1, РКО А.Л А(.Л ЛГ.Л РКО ЧЛ 1, 58( П Л 1.Л А.Л РВО31 320 3251400 4 О 1420430:С ЛСТ ТЛС ССЛ АГ(, СС(. ССА ТГС АС ЛАТ АДА ТОТ Ас( С(Л СТТЛГЛ ТНВ1440 1450 460 14/О 480СЛЛ САЛ ААА 1 ТС ССС ТЛТ ААЛ ТТС .ОЛ ААТ ТТТ ТЛЛ ЛЛС АСЛ АЛС1490 500 15101 с; САС СТ. СЛА СЛС ТТТ САА СТТ ТСА Л-З. 1340 ССС Л 1 Я 1390 ЛТЛ 11,Е 330 ГЛЛ51015 20 25 30 35 40 50 55 группа метионина; РНЕ - группа фенилаланина; РВО - группа пролина; ЯЕЯ - группасерина; ТНЯ - группа треонина; ТВР - группа триптофана; ТУВ - группа тироэина; ЧА 1- группа валина,Показанная последовательность ДНКсодержит примерно 63 0 и С и кодируетполипептид с рассчитанным молекулярнымвесом36, 462 дальтон и измеренным молекулярным весом 40,000 дальтон,Указанная последовательность можетбыть синтезирована обычным образом путем модифицированнго фосфоротриэфир, ного способа с использованием полностьюзащищенных деоксирибонуклеотидныхблоков. Такие способы синтеза хорошо известны и ыогут осуществляться в соответствиИ .с методикой ЯаМцга и др 1977 г,Ясепсе 198:1056 и с методикой и др., 1978г., Ргос. Нас, Асад. Яс.ЯА, США, 75, 5765.Кроме того, особенно предпочтительныйспособ описан в работе Нзцп 9 и др 1963г., Мцсес Асс ВезеагсЬ 11, 3227 и в работейагапц и др., 1980 гМейодз и Епгутттоо 9 у,68, 90. Кроме способов, описанных в справочных руководствах данная последовательность ДНК может быть синтеэирована вавтоматизированном синтезаторе Д-К, таком как Яузтес 1450 А или АВЯ (АррестВозузтетпз, 850 .псои Сеп 1 ге Огче, ГоыегСПу, ХА 94404) 380 А, синтезаторы ДНК.Ввиду вырожденности генетическогокода, который является результатом нали-чия более чем одного кодона для большинства аминокислотных групп итрансляционного стоп-сигнала, последоватетьность аминокислот указанного фермента ОАСЯ/ОАОСЯ может быть кодированамножеством других последовательностейДНК, Так как эти альтернативные последовательности ДНК будут кодировать ту жеф поСледовательность аминокислот, отвечающтю настоящему изобретению, то данноеизобретение будет охватывать также и этиалЬтернативные последовательности и способы, в которых используются эти альтернатийньте последовательности.Ввиду различного числа видовСерЬа озрогцтп и даже различных штаммовв пределах одного вида существуют генетические,варианты ДНК, кодирующейОАСЯ/ОАОСЯ, отвечающей настоящемуизобретению. Эти генетические вариантывключают основные последовательностиДНК и аминокисЛоты, гомологичные соединениям, отвечающим данному изобретению, и кодируют белки с аналогичной, еслине полностью идентичной, активностью, нонесколько отличаются от фактических соединений, отвечающих данному изобретению. Эти генетические варианты эквиваленты также соединениям, отвечающим настоящему изобретению, и могут использоваться в способах данного изобретения.Отвечающие настоящему изобретению соединения ДНК, кодирующие активность ОАСЯ/ОАОСЯ, выделены из штамма СерЬаозрогцтп асгетттопцпт, общеизвестного как штамм Вгоиц, который имеется в коллекции культур американского типа, Роквилл. Мерилэнд, где он хранится под номером АТС 11550. Геномная библиотека общей геномной ДНК штамма Вго 1;ц была построена в бифункциональном космидном векторе рКСг 462 А (существующим в Е,со К 12 под номером ЯВЯМ В) и была исследована на наличие последовагельностей, гомологичных ряду иэ 32 рлэличтых деоксирибоолигонуклеотидов, Этот ряд раэличных деоксирибоолигонуклеотидов был построен сотласно информации. полученной от частичной аминокислотной последовательности фермента С. асгеп 1 опцттт ОАСЯ/ОАОСЯ и на основе знания этого генетического кода, Были идентифицированы различные векторы, которые гомологичпы одному или нескольким из 32 различных деоксирибоолигонуклеотидов, Последовательность ДНК раскрывает, какие векторы кодируют фермент С, асгеаоттгцтп ОАСЯ/ОАОСЯ,После идентификации векторов, которые кодируют фермент ОАСЯ/ОАОСЯ, был выделен рестрикционный фрагмент 7 кб ВатпН, включающий ген ОАСЯ/ОАОСЯ и он был вставлен в коммерчески доступную плазмиду рцСЗ, образуя плаэмиду рТ 503, которая затем трачсформируется в клетки хозяева К 12 А 221. Эти трансформанты Е.со К 12 А 221/рТ 503 были депонированы и составили часть коллекции культуры Северной региональной научно-исследовательской лаборатории (МЯВОМ) Пеория,61604, под номером ЙВЯ В. Рестрикционная и функциональная карта плазмидырТ 503 представлены на фиг,1. Плазмида рТ 503 может быть выделена из Е.со К 12 А 221 способом, описанным в примере 1, и используется в качестве исходного материала для построения плазмиды рТ 507, которая обеспечивает высокую степень выражений активности ОАСЯ/ОАОСЯ в Е.со. Порядок проведения операции для построения плазмиды рТ 507 представлен в примере 2 (смотри 2 К), и включает сшивку кодирующего щ 2,2 кв Яз-ВапзН ОАСЯ/ОАОСЯ рестрикционного фрагмента плаэмиды рТ 503 с 5,8 кв ЙОе-Ватп Н фраг 183841350 55 кентом плазмида рС 2 В 336 и синтезированным Фрагментом .60 Ьр ЯзтТ-Мбе 1.Плазмида рС 2 В 336 оключаетЛр промо. тор, трансляционную активирующую последовательность, оператор с 1857, первую функциональную единицу наследственности (."пистрон"), кодирующую. небольшой пептид, который предшествует представляющему интерес гену, и последовательность ДНК, кодирующую производноеОН (гормон роста человека), При низкой температуре, составляющей примерно 30 С, белок, экспрессируемый с использованием плазмид рС 2 В 336 и р 1 Т 507, лоляется активным и способен подавлять активность промотора Лр 1, но при повышении температуры примерно до 42 С белок с 1857 инактивируется, промотор инициирует транскрипцию большого количества мРНК, кодирующей ЫН (рС 2 В 336) или БАСЯ/ОАОСЯ (рП 507). Рестрикционная ифункциональная карта плазмиды рС 2 В 336 представлены на фиг,2.Плазмида р 1 Т 507 включает тот же первый цистрон с.1857 ген; промотор Лр и трансляционную актиоирующую последовательность, что и плазмида рС 2 В 336, но включает кодирующую последовательность гена ОАСЯ/ОАОСЯ от плазмиды рТ 503 вместо кодирующей последовательности ЫН, Рестрикционныйфрагмент - 2,2 кв ,Яв 1-ВапН плазмидЪ рТ 503 включает .большую часть кодирую 1 цей последовательности ОАСЯ/ОАОСЯ остальная часть этой кодирующей последовательности содержится в синтезированном фрагменте " 60 Ьр Ибе-Яв 1 с йебольшой модификацией последовательности ДНК дикого типа, что облегчает последующук работу, Распознавательная последовательность рестрикционного фрагмента Мбе 1, которая представляет собой 3-ОТАТАС включает 5-АТС(/ .3-ТАС, которал кодирует аминотерминальную метионильную группу ОАСЯ/ОАОСЯ. Плазмида рТ 507 построена таким образом, что промо",.орЛр. и трансляционные активирующие последовательности расположены так, что вызывают экспрессию ДНК, кодирующую ОАСЯ/ОАОСЯ. Рестрикционная и функциональнал карта плаэмиды рТ 507 представлены на Фиг,12, В примере 2 описывается построение плазмиды р 1 Т 507 более подробно,5 10 15 20 25 При температуре примерно 420 С Е.со 1 К 12 М 109/р 1 Т 507 выражает высокий уровень активности ОАСЯ/ОАОСЯ, приближающийся к15 от общего клеточного белка. Сырые клеточные экстракты от этих трансформантов Е,со К 12 1 М 109/рТ 507 способны катализировать конверсию пенициллина М в РАОС и ОАС, в то время как клеточные экстракты от нетрансформированных клеток Е,со 1 К 12 М 109 не могут катализирооать эту конверсию, Данный способ анализа и результаты анализа реакции конверсии представлены в примере 3.Многие штаммы Е,соН К 12 включают активность эндогенной цефалоспориназы, вероятно, кодированной локусом аврС, По этой причине желательно осуществлять частичную очистку полипептида ОАОСЯ/ОАСЯ таким образом, чтобы достигалась оптимальная активность ОАОСЯ/ОАСЯ, Для этой цели достаточна очистка фермента посредством ДЕАЕ-тривакрила для отделения активности эндогенной Е,со цефалоспориназы от желаемой активности ОАО С Я/ОАС Я. П ример такого типа частичной очистки описан в примере 3. Другой возможностью использования частичной очистки длл исключения вредных влияний цефалоспориназы является использование штамма, дефектного о продуцировании данной активности. Один такой штамм Е,со К 12 А 85892 находится на хранении в Северном региональном научно-исследовательском центре под номером М В ВВ,Плазмида р 1 Т 507 является эффективным средством продуцирования больших количеств ОАСЯ/ОАОСЯ в Е,со 1. Ввидутого что Е.со р 1 Т 507 продуцирует ОАСЯ/ОАОСЯ в количествах, прибликающихсл к 15% от общего клеточного белка, и ввид/ того что культивация Е.со менее сложна, чем культивация организмов, которые естественно продуцируют ОАОСЯ и/или ОАСЯ, трансформанты Е.со рТ 507 могут быть использованы в способе продуцирования ОАСЯ/ОАОСЯ после эффективно и более экономично, чем "естественные" продуценты ОАСЯ/ОАОСЯ. ОАОСЯ может быть использована для продуцирования ОАОС из пенициллина й в свободной от клеток системе, как описано в примере 3. ОАОС является не только полезным антибиотиком, но также может быть использована в качестве исходного материала для продуцированил таких важных антибиотиков как цефалексин и другие цефалоспорины (см. патент США Ь 4307192). Другим очень важным использованием ОАСЯ/РАОСЯ являетсл использова 1838413ние фермента для трансформации пеници,;- линов иных чем пенициллин И в новые цефалоспориновые производные,Плаэмида р 1 Т 507 особенно предпочтитЕльна для обеспечения экспресииОЙСЯ/ООСЯ в Е.соИ не только ввиду высоких уровней этой экспресии, достигаемыхпри использовании данной плазмиды, но иввиду отобранного маркера, присутствующего на данной плазмиде. Многие векторырекомбинантной ДНК кодируют ф-лактамазу таким образом, что клетки, содержащйеэтот вектор, могут расти в присутствии некоторых 3-лактамовых антибиотиков, такихкак ампициллин. Однако если желательноиспользовать свободный от клеток экстракт,содержащий ОАСЯ/ОАОСЯ для целей построения 3-лактамов, то нежелателен экстракт, который содержит активность/3-лактамаэы. Так, плазмида рТ 507 не кодирует/3-лактамазч в качестве маркера, и использует стойкий к тетрациклину ген,который кодирует белок, который не реагирует с /3-лактамами.Способ экспрессии ОАСЯ/ОАОСЯ и относящийся к нему вектор, отвечающий настоящему изобретению, не ограничиваютсяопределенным отобранным маркером. Специалисты в данной области знают, что многие маркеры пригодны для использования, на векторах экспрессии ОАСЯ/ООСЯ, Такиемаркеры представляют гены, которые придают резистентность к канамицину, хлорамфениколу или к другим антибиотикам.Данное изобретение иллюстрируетсяследующими примерами,П р и м е р 1. Культура Е,со 1 К 121 А 221/рт 503 и выделение плазмиды рТ 503.Лиофил Е.соИ К 12 1 А 221/рТ 508 былполучен из Северных региональных научноисследовательских лабораторий, Неория,шт,Иллинойс, который имеет порядковыйномер ИЯЯ В. Этот лиофил был непосредственно использован как "культура"в описанной ниже процедчре.1 л питательного бульона(10 г триптона, 10 г йаС и 5 г дрожжевого экстрактана литр), содержащего 50 мкг/мл ампициллина, инокулировали культурой Е.соИ.Клеточные осколки удаляли иэ растворапутем центрифугирования при вращениицентрифуги со скоростью 25000 об/мин втечение 40 мин в роторе Яч"ч 27 (Весастап,7360 й,1 псо 1 и Аче, 11 псо 1 паооб 1160646).Поверхностный слой экстрагировали буферным фенолом, В этот раствор вводили примерно 30,44 г СЯС и 1 мл раствораэтилбромида концентрацией 5 кг/мл, затемэтот раствор доводило до объема 40 мл и: 1981, 1. Вас. 145:654 - 656), ПлазмидарКЕИШ могла быть получена из Северного 45 регионального научно-исследовательского 50 ет ген Е,соИ 1 рр см. Йагагпога апс 1,поцуе1979 г., СеИ 18. 1109-1117). В плазмиде рКЕМ 021 рестрикционный 55 5 10 15 20 25 30 декантировали в ультрацентробежную трубку (Бекмана) ЮГ 50. Эту трубку герметически запаивали. раствор центрифугировался в роторной центрифуге ЧТ 50 при скорости центрифуги 42000 об/мин в течение 16 ч, Полученная плаэмида, визуализированная ультрафиолетовым светом, была выделена и затем помещена в трубку Т 175 и роторную центрифугу (Бекмана), где осуществлялось центрифугирование со скоростью 50000 об/мин в течение 16 ч, Любое необходимое регулирование объема осуществлялось с использованием раствора ТЕЯ. содержащего 0,761.г/мл СЯС 1, Затем плазмидная полоса снова выделялась, экстрагировалась насыщенным солью изопропанолом с целью удаления этилбромида и разбавлялась (1;3) буферным раствором ТЕЯ. В расгвор вьодили 2 объема этанола и затем е о; у" г" вали при -20 С в течение ночи. 1 лазмида ДН К, гранулировалась путем цен грифуг ирования данного раствора в роторноо центрифуге ЯЯ 34 (ЯегчаИ) в течение 15 мин нри скорости центрифуги 10000 ор/мон,ДНК плазмиды рИ 503, полученная аким образом, 1 мг суспензировалась вл;д буферного раствора ТЕ (10 ммоль Трос, рН 8 иммоль ЕДТА) и хранилась при"С. Рестрикционная функциональнчд "лп,г плазмиды р 1 Т 503 представлены на фг г.1.П р и м е,р 2, Построение плазмиды р 1 Т 507.А. Построение плазмиды рКЕМ 021 и выделение ее рестрикционного фрагмента-5,1 кв ХЬа 1-Яапа Н 1,В данном разделе примера описывается выделение рестрикционного фрагмента 5,1 кв ХЬа 1-Ваа Н 1 плазмиды рКЕК 021 (106 на фиг,4). Ллазмида рКЕИ 021 получена от плазмиды рКЕМШ (101 на фиг.2 и дополнительное описание приведено в работеее и др., 1981 г 146, 861 - 866. и Ьч 1 еЬе 1 и др центра (ВАЯЯ), служба исследований в области сельского хозяйства, Перория, Иллинойс, 61604, Е.со 1 СС 620, порядковый номер ВАЯЯ.15011.Плазмида рКЕИШ имеет рестрикционный фрагмент 2,8 кб ЕсоЯ 1, который включафрагмент 650 п.о, ЕсоЯ 1-Яа 11 плазмиды рВ 322 был заменен генной последовательностью Е,соИ 1 рр, Эти генные последа вател ьности 1 рр включают фрагмент 462 (Ад), расположенный перед первым триплетом кодирующей последовательнссти 1 рр, Этот5 10 20 25 30 35 50 фрагмент 462 п.а содержит промотор, 5 нетранслируемую зону и сайт, связанный с рибосомой.Уникальный рестрикционный сайт ХЬа расположен в пределах сайта связывания с рибосомой в 16 пл, передтрансляционныминициирующил метиониновым кодоном.Сайт рестрикции РЧП, находящийся,на 105 п.о. выше от трансляционного концевого кодона кодирующей последовательности 1 рр, заменен на сайт рестрикции ВагпН 1 путем ввода синтеэирбванной связующей молекулы ДН К (5-СС 66 АТСССОСоаЬогатче ВезеагсЬ пс., 128 Ярг 1 пц 31 геет,ех 1 п 91 оп, Массагусегпе 02173). Кодирующая последовательность последних тридцати пяти аминокислот липопротеина, трансляционный концевой сигнал и последовательность, соответствующая 3 нетран слируемой зоне информационной РНК, следует за сайтом ВавН 1, Плаэмида рЕМ 021 включает также некоторые независимые последовательности на 850 п.о., расположенные ниже гена рр в хромосоме Е.соИ.Как показано на фиг.2-4, плазмидарКЕМ 021 образована от плазмиды рКЕМШ следующим образом. Примерно 50 мкг плазмиды рКЕИ (101 на фиг,2) рестрицировалась 25 единицами фермента Н ра (если нет других оговорок, рестрикционные ферменты и определения единиц соответствуют Мел Епцапб ВоаЬз, 32 Тоег Воат, Вечегу, Массагусегпс 01915) в 300 мкл буферного раствора 1 Х Нра(10 ммоль, Трис, НС, рН 7,4; 10 ммоль М 9 С 1 ммоль КС 1; и 6 ммоль /3-меркаптоэтанола) при 37 С в течение 2 ч, Смесь экстрагировалась двукратно 300 мкл смеси фенола с хлороформом в соотношении 50:50, извлеченная водная фаза повторно осаждалась 2,5 обьемами этанола и 0,1 объемом 3 моль, адектата натрия (МаОАс), Гранула ДНК растворялась в 100 мкл электрофорезного буферного раствора и фракционировалась на 5 полиакриламидном геле (соотношение акриламид:бис составляло 29:1 во всех полиакриламидных гелях за исключением тех случаев, где оговорено особо). Этот гель окрашивался в растворе, содержащем 0,5 лкг/мл этилбромида, и виэуализировалась ДНК полоса в длинноволновом ультрафиолетовом свете.Ограничительный фрагмент 950 ор Нра 1 был изолирован и извлечен из геля путем электроэлюирования в диализный мешок, После экстракции смесью фенол /СНСз и осаждения этанолом извлеченная ДНК ( 2,5 мкг) растворялась в 25 мкл ТЕМ (10 ммоль йаС 1; 10 ммоль трис. НС 1. рН 7,4 и л ммоль натрийэтилендинитролететраацетат (ЕДТА). Г 1 римерно 2 мкг фрагмента 950 п,о. Нра 1 переваривалось рестрикционным ферментом Ао в 200 мкл буферного раствора ХАо(50 мМоль ИаС 1; б мМоль Трис, НС 1, рН 7,6; б мМмоль М 9 С 12; б мМоль /3-меркаптоэтанол) в течение 2 ч при 37 С. ДНК фракционировалась на б;(,-ом полиакриламидном геле и фрагмент 462 А 1 о извлекался и очиыался как описано выше. Фрагмент 462 ЬрА 1 о 1( 1 мкг) растворялся в 10 мкл буферного раствора Т 4 ДНК лигазы (бб мМоль Трис, НС, рН 7,6; 10 мМоль М 9 С 12 10 мМоль дитиотрентол и 0,4 мМоль АТР), содержащего 150 пикомолей фосфорилироаанного связующего звена Есой (5-бб- ААТТССиэ СоаЬогатче йезеагсЬ) и 2 единицы Т 4 ДНК лигазы. Посла инкубации при 4 С в течение 16 ч смесь нагревалась при 65 С в течение 10 лин и затем разбавлялась до 100 мкл таким образом, что имела состав буферного раствора Х Есой (100 мМоль трис, НС 1, рН 7,2; 50 мМоль МаС 1; 10 мМоль М 9 С 12 и б,ммоль /З-меркаптоэтанол), содержащего 40 ед, фермента ЕсоВ, По прошествии 2 ч выдержки при 37 С образец экстрагировался смесью фенол/СНСз и осаждался этанолом. Затем ДНК растворялась в 20 мкл буферного раствора Т 4 ДНК лигазы, содержащего Т 4 ДНК лигазу и 0,1 мкг обработанной щелочной фосфатазой, вываренной с Есор плазмйды рВВЗ 22 (102 на фиг,2), Г 1 осле сшивки при 4 С в течение 16 ч полученная в результате ДНК использовалась для трансформации обычным образом (Е, Со 1 К 12 НВ 101 КВЯ -15626), Трансформанты отбирались на агаровых пластинах, содержаыих 12 мкг/лл тетрациклина и плазмид, выделенных из стойких колоний путем быстрой щелочной экстракции, как описано в работе ВгпЬогп апс Ооу, 1979 год, Мыс 1 ес Асдз Безеагсб 7;1513-1523, Была выбрана плазмида (103 на фиг,2), содержащая фрагмент 466 Ьр ХЬа 1- Вагп Н и использование в качестве исходного материала для следугзщего описанного этапа.Примерно 2 мкг этой плазгиды (103 на фиг,З) расщеплялось 2 единицами фермента Нпс 11 в 50 мкл буферного раствораХ Нпс 3 11160 мМоль МаС; 10 мМоль Трис, НС, рН 7,4; 10 мМоль Мо С 2 и 6 мМоль /3-меркептоэтанол) в течение 1 ц при 37 С. После того как реакционная смесь экстрагировалась смесью фенол/СНС 13 и осаждалась зтанолом, ДНК растворялась в 200 мкл буферного раствора нуклеазы Х (300 мМоль МаС; 30 мМоль ИаОАс, рН 4,25; и 3 мМоль ЕпС 2), содержащего 200 единиц нуклеазы Я 1 (М езаЬогасогез 30 И/. 475, И,Аыгога Воат, Карегч 1 е, 60566). По прошествии 1 чвыдержки при 5 С реакция прекращалась путем экстракции смесью фенол/СНС 1 з иДНК осаждалась этанолом, Вываренная сН 1 гО 111, обработанная нуклеазой ДНК растворялась в 10 мкл буферного раствора Т 4 ДНК лигазы, содержащего 20 пикомолей ФОСфорилированнььх связующих звеньевВагп Н 1(5-СС 65 АТССО 6-3 из СоаЬога 11 че йеэеагс 11) и 2 ед, Т 4 ДНК лигазы, После 16 чвыдержки при 4 С реакционная смесь нагревалась при 65 С в течение 10 мин с 10 целью инактивации лигазы и затем разбавлялась до 100 мкл с целью получения буферного раствораХ Вагп Н (150 мМоль МаС 1; . 20 мМоль Трис, НС 1, рН 8,0; 10 мМоль МдС 2 15и 6 ммоль меркаптоэтанол). содержащего 20 единиц Фермента Вагп Н 1, После 2 ь выдержки гьри 37 С смесь подвергалась,очистке на 1",-оьл агарозно,ьеле, Это ге.,ь окрашивался этилбромидоьл, и более круп ный Фрагмент (- 4,5 ко) извлекался путем вырезания полосы этого фрагмента из ьелы, элюирования этого фрапьента после замораживания агароэного кремнезема и последующей очистки пу 1 ем экстракции сьлесььо 25 Фенол/СНС 1 з и Осаждения этанолом, Желаемый фрагмент может быть также оььделеьь иэ агарозного геля с использованием мемб- .раны ЫА 45 (Ясгье 1 Сьег апс БСЬьье) согласно рекомендации изготовителя. 30Извлеченный фрагмент имеет липкиеконцы и его растворяли в 20 мкл буферногораствора лигазы Т 4 ДНК, содержащего лигазу Т 4 ДНК. По прошествии 16 ч вььдержки 4 ОС ДНК использовалась для трансформа ции Е, со 11 К 12 НВ 101 (КВК8-15626).Трансформанты отбирались на стойкость к ампициллину (Арй) при 100 мкг/мл и на чувствительность к тетрациклину (Теб) при 10 , мкг/мл, Некоторые плаэмиды, получеьпьые 40согласно описанию ВгпЬОгп из колоний Арй ТСЯ, исследовались на отсутствие сайта Нпб 11 и на присутствие единственного сайта Ва ть Н 1. Последовательное расщепление ЕСОК 1, 3 а приводило к образованию 45 дгух меньших Фрагментов, размером 466 п.о. и 305 п,о. и значительно более широкого Фрагмента, Была выбрана плазмида (104 на фиг.З) с.этими характеристиками, затем она была модифицирована для превращения 50 сайта ЕСОР, расположенного выше промотора 1 рр, в сайт Напс 11.Эта модификация сопровождалась первым частичным расщеплением 2 мкг плазмиды (104 на фиг.З) в 100 мкл буферного 55 растоора 1 Х ЕСОРС ферментом ЕСОЮ, Реакция прекращалась при инактиоации нагреванием при 65 С и экстракции смесь фенол/СНСз реакционной смеси, осуществлялось осаждение ДНК этанолом. Гранула ДН К растворялась в 200 мкл буферного раствора нуклеаэы 1 Х, содержащего 1000 ед/мл нуклеазы 31, и инкубирооалась при 12"С о течение часа, Реакция прекращалась путем экстракции смесью фенол/СНС 1 з и ДНК осаждалась этанолом. Гранула ДНК снова суспензировалась в 10 мкл буферного раствора Т 4 ДНК лигазы, содержащего 20 пико- молей фосфорилирооанного соязующего звена Нпб 11 (5-ССААССТТСС, (из СоаЬогабче ЯезеагсЬ) и 2 единицы Т 4 ДНК лигазы.После 16 ч выдержки при 4 С смесь нагревалась в течение 10 мин при 65 С, раэбаолялась до 150 мкл с получением композиции буфера 1 Х Нпб 111,содержащего 10 единиц фермента Нп 11, инкубировалась о теченис 2 ч при 37"С и затем фракцьлСамая крупная полоса (эквивалеьььная линейной полной длины плазмиде) извлекалась Обычым Образом, очььь.цал ась:, растворялась о 20 л 1 кл буферного раствора Т 4 лигазьь, содержаьдего Т 1 лигазу, инкубировалась о течсчьие 16 ч при 4 С и исполь зовалась для трансформации Е. соЯ 01 ь,ЧЯРд Ы), ТРансфоРмаьт АРБ, СО;. ижащий плазмидную ДНК, анализироа: ся 110 средстоом рестрикциоьььього аь 1 алььа БР- ла отобрана плазмида (105 на фиг,З) с фрагментом 500 вр ЕСОВ 1-пб 11, Эьа плазмида затем была использована как вектор клонирооания зоны 3 гена 1 рр.Примерььо 2 мкг этой плазмиды (105 ььа фиг.4) оываривалось в 50 мкл буферного рас- твора 1 Х Яа (150 мМоль ИаС 1; 6 мМоль Трьс НС 1, рН 7,9; б мМоль Мд С 2 и 6 мМоль Р-меркаптоэтанола) с 2 единицами фермента Яа 1 в теьение 1 ч при 37 С. Затем реакц,ьсчьная смесь раэбаолялась до 150 мкл с получеььием композиции буферного раствора Багп Н 1, содержащего 2 единицы фермента Бап 1 Н 1, После 1 ч выдержки при 37"С добавляли примерно 2,5 единицы щелочной фосфатазы, смесь инкубировалась при 65 С в течение 1 ч. Данный продукт экстрагировался смесью фенол/СНС 1 З, осаждался этанолом, растворялся в ТЕМ и использовался как вектор клонирования для фрагмента 1 рр 3.Для. получения фрагмента 1 ррЗ 10 мкг плазмиды рКЕ (101 на фиг.2) расщеплялись в 200 мкл буферного раствора 1 Х нРа 1, содержащего 10 единиц фермента Нра 1, в течение 2 ч при 37 С, После экстракции смесью фенол/СНС 1 з и осаждения этаыолол ДНК растворялась в 10 мкл буферного р,ьстоора лигазы 74 ДНК, содержащего 20 пьькомолей фосфорилирооаныого сояэуьощаь О звена Яа 1(5-ЙОТСОАССиз Соиа ЬогаОче ЯеэеагсЬ и Т 4 ДНК лигазу, зател инкубиро