Способ получения полипептида со свойствами проурокиназы и штамм бактерий еsснеriсна coli продуцент полипептида со свойствами проурокиназы (варианты)

вым М-конц в положе лутамин;ожении 157 изобрет бильнос Целью вляется по ия полип ептида.нию предлагается билизированного азо-подобногоо аминокислотную шение сСоглспособчелов ецполипепформулу(МеСгде Мес аминокисло л сно изобрете олучения ста ско-проуроки ида, имеющег ентичнуюнокислотноой человеоо о чес е РНК.ани, замочают в смеОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР(71) Сегами Кемикал Рисерч СентСентрал Гласо Компани, Лимитед,Ходогая Кемикал Ко, ЛТД, НиппонКомпани, Ниссан Кемикал ИндастрЛимитед, Тойо Сода МануФакчуринЛтд, (ТР)(72) Тосио Мияке, Ясуо ХиЕити Кобаяси, Кен Ватабе,Омори, Тецузои Мики, МидоРейко Мацумото, Казуо Вати Наганори Нумао,(56)Р, А,59-51300, кл.С 12 И 15/00, 24.03.84. тение относится к биотехноожет быть использовано притромболитических средств. О 1 (5 ТБег - Х - У.- необязательно присутствующий щетионин;(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИЖПТЩА СОСВОЙСТВАМИ ПРОУРОКИНАЗЫ И ШТАММ БАКТЕРИЙ ЕеЫСНЕК 1 СНЕА С 011 - ПРОДУЦЕНТ,ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАЖ ПРОУРОКИНА"3 Ы (ВАРИАНТ 11)(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использованопри создании тромболитических средств.Целью изобретения является повышениестабильности целевого продукта. Согласно иаобретению генно-инженернымиметодами конструируют рекомбинантныеплазмидные ДИК рМ 11 Р 1 рш, р 1 ЯП 1 Ьрш 2,рйгрцК 2, кодирующие синтез проуроки-,назы, трансформируют ими штаммы бактерий ЕзсЬегжМа со 1После культивирования штаммов выделяют полипептид, обладающий свойствами проурокиназы, с аминокислотной последовательностью Ме-Бег-Х -У ,где Мерц Бег 35 167аминокислоты метионин и серии,Х-.-либо глутамин, либо треонин,7-фенилаланин. 2 табл. Бег - расположенный первой серии;.Х - либо находящийся135 треопин или гУ - находящийся в полйенилаланин,ошная линия обозначаетпоследовательность, идтветствующим частям амиследовательности природкой проурокиназы.П р и м е р 1, Получен20 г клеток почечной то,енных при -80 С, измел20 1695827 19рул и после разбавления надосадочнои жидкости инкубирувт в течение ночи при комнатной температуре. Смесь диализируют, как описано вьши. 5Мутантную (РРш 3) урокиназу очищают подвергая результирующий сырой экстракт аффинной хроматографии с исполь зованием сефарозной колонки, с которой связаны антиурокиназо-моноклональные антитела.П р и м е р 28. Экспрессия проурокиназо-подобного полипептида.Плазмиды рггрПК 2 (0135 Д 157) и рггрПК 2 (Е 135 Д 157) полученные и примерах 22 и 23, трансформируют в Е.со 1 Ы 03110, трансформанты инкубирувт. иидуцируют добавлением ХАА (индолуксусная кислота) до конечной концентрации 50 мкг/мп, когда поглощение на 550 нм достигает 0,5, и ,дальнейшее культивирование проводятаЭ ч при 37 С для экспрессии урокиназного гена.Из жццких сред экстрагируют и очи щают 5 мл среды на основе плазмиды ргрПК 2 (0135 Д 157) с получением мутантного проурокиназо-подобного полипептида (Ц 135 Д 157), Часть полипептида обрабатывают трипсином следующим 30 образом.После определения Ферментной активности по методу синтетического субстрата пробы разбавляют раствором, содержащим 50 мИ трис-НС 1 буфера (рН 7,4), 0,15 М хлористого натрия и 0,1% тритона Хдо конечной концентрации 100 МЕ/мп. К 50 мкл добав лявт 3 мкл водного раствора трипсина до окончательной концентрации 1 мг/мл,40 2 мг/мл и 3 мг/мл и смеси инкубирувт при 37 С в течение 60 мин. Затем ре акцию прекращают добавлением 5 мкл соевого ингибитора трипсина. В качестве контроля аналогично обрабатывавт 45 пробы, содержащие вместо трипсина воду..Пробы подвергают электрофорезу в градиентном полиакриламидном геле(10-26%). Гель погружают в 2,5% три тон Хи инкубирувт в течение часа при комнатной температуре, наслаивают на Фибрино-агаровув пластинку и инкубируют 2 ч при 37 оС. Молекулярную, массу оценивают на основании положения зоны растворения на Фибрин"агаровой пластинке.Также обрабатывают проурокиназоподобный полипептид природного типа,и мутантный проурокиназо-подобный полипептид (0135), полученный экстракцией и очисткой жидкой среды, полученной в примере 25, с помощью методики примера 27. Молекулярная масса проурокиназы природного типа на основе р 1 ШР 1 составляет около 50.000, диссоциация трипсином снижа" ет ее до 30.000. С другой стороны никакой конверсии до низкомолекулярного материала не происходит при обработке трипсином в случае полипептидов на основе соответственно плаз мид рМПИрш и рггр 1 Ж 2 135 Д 157)Характеристика штаммов хозяев. Общие. свойства.1. Длинные стержни размерами 1, 1 1,5 на 2,0-6,0 мкм (живые) или 0,4- 0,7.на 1,0-3,0 мкм (высушенные и окрашенные).2. С+С содержание ДНКй 50-51 моль.7 (плавучая плотность +Т );3. Биохимические характеристики приведены в табл.1 и 2.4. Генотип.(1 ас рго), СМ, згг А, зцр Е, епд А, зЬе А, зЬе В, изй К, Уф гга й 36, рго АВ,. 1 ас 1, Х Ь М 15Специфические свойства Е зсЬегзсЬа со 1 х /.рМПР 3 рш 2 (ЕЕКМ ВР) - проду- цент полипептида, обладающего свойствами человеческой проурокиназы, со следующей аминокислотной последовательностью: (Мег) - Бег - Х - У-, где Х - глутамин в положении 135 и 7-фенилаланин в положении 157.ЕзсЬепсМа со 1 х / рМПТ 41.рг,2 (ЕКРМ ВР"970) - продуцент полипептида, обладающего свойствами человеческой йроурокиназы со следующей аминокислотной последовательностью, (Мес) - Бег- Х - У-, где Х представляет собой треонин в положении 135,а У - Фенилаланин в положении 157.ЕзсЬегьсЬха со 1 х / рггрУК 2 (ЦИ 57)(ИМ - 3623) - продуцент полипептида, обладающего свойствами чеповеческой проурокиназы, где Х представляет собой глутамин в положении 135, а У- аспарагиновув кислоту в положении 157.Проурокиназа, полученная с помощьюЕ,соЫ 03110 и трансформированная спомощьв рМОР 1 рв, составила примерно 2мкг/мл, полученная с помощьв Е.со 1Ж 703, трансформированной с помощьвРИЧТ 41 рш 2, составляет от 5 до10 мкг/мл, а полученная с помощьвЕ,со 11 У 3110 трансформированной суч 1695827 Таблица 1 Признак (1) Наличие (+),отсутствие (-) (11) Подвижность ИндолНБ на ТБ 1 Р.-ГалактозидазаЛактоэаМукат+ помощью рМИр 1 рш, составила примерноот 1 до 2 мкг/мп,Формула изобретения5 1. Способ получения полипептидасо свойствами проурокиназы, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей синтез проурокиназы, трансФормацию рекомбинантными ДНК штамма бактерий ЕзсЬегсЬа со 11, отбор клонов,культивцрование штаммов, индукциюобразования полипептида, выделениеи очистку целевого продукта, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения стабильности полипептида,конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК рМцр 1 рю, трансФормирувт полученной ДНК штамм бактерий Е.со 103100, культивируют трансФормировано,ные клоны при 30 С с последующей индукцией при повышении температурыо,до 42 С образования полипептида со 25следующей аминокислотной последовательностью:Ме - Бег - Ип - РЬеВ 5 1572, Итамм бактерий ЕзсЬегсп а со 1 гЕЕКМ ВР- продуцент полипептидасо свойствами проурокиназы и аминокислотной последовательностью:Мег - Бег - С 1 п - РЬе135 1573. Способ получения полипептидасо свойствами проурокиназы, предусмаТГГинавщий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей синтез проурокиназы, трансФормацию рекомбинантной ДНК штамма бакте.рий Езсйег 1 с 111 а со 11, отбор клонов,культивирование штаммов, индукциюобразования полипептида, выделениеи очистку целевого продукта, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения стабильности полипептида, 45конструируютрекомбинантную плазмиднув ДНК рГКТ 41.рш 2, трансФормирувтполученной ДНК штамм бактерий Есо 11.П 103, культивирувт трансФормированные клоны при 37 С и путем прибавлео,ния изопропил-Р-П-тиогалактопиранозида индуцирувт образование полипептида,со следующей аминокислотной последовательностью:Ме( - Бег - Пг - РЛе4 ЭУ 1574. Итамм бактерий ЕзсЬегьсМа со 1ГЕКМ ВР."970 - продуцент полипептидасо свойствами проурокиназы и аминокислотной последовательностью.Мес - Бег - ТЬг- РЬе.5 . Способ получения полипептидасо свойствами проурокиназы, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей синтез проурокиназы, трансФорма"цию рекомбинантной ДНК штамма бактерий ЕзсЬег 1 сЬ 1 а со 1 х, отбор клонов,культивирование штаммон, ицдукциюобразования полипептида, выделениеи очистку целевого продукта, о тл и ч а в щ и й с я тем, что, сцелью повышения стабильности полипептида, конструируют рекомбинантнувплазмидную ДНК рггрУК 2 - (0135 Р 157),трансФормирувт полученной ДНК штаммбактерий Е,со 1 х 03110, культивируюттрансФормированные клоны при темпеоратуре 37 С и путем прибавления индолуксусной кислоты индуцирувт образование полипептида со следующей аминокислотной последовательностью:Мег,-Бег-С 1 п - Азрб. штамм бактерий Езс 11 епсМа со 1РБМ- продуцент полипептида сосвойствами проурокиназы и аминокис- .лотной последонательностьвС 1 Э 5157Приоритет по пунктам:25.0185 по пп 1 и 2;20,04.85 по пп 3 и 4,-Галактоэидаэа Газ из глюкозы при ЗУОСКСН (роста)Иукат (кислота) Восстановленный нитратС-С, мол. %АдонитолАрабинозаЛактоза.МальтозаИаннитСалицинСорбит. ТрелалозаБлизкие углеродные источникиЦитратМалонатМ. 1 С.У.Р.Гидролиз желатина НБ из ТБ 1ИндолДекарбоксилированный лизинГидролизованная мочевинаГлутаминовая кислота Фенилаланин Продолжение табл,1сителе в жидком азоте и суспендирувтв 80 мл 5 М раствора гуанидинизоцианата (5 М гуанидинизоцианата, 0,5/ И,лауроилсаркозина-натрия, 25 мМ тартрата натрия, 0,1 М меркаптоэтанола и0,1 Е анифоума А). Суспензию гомогенизирувт н тефлоновом гомогенизатореи нуклеиноную кислоту выделяют с помощью центрифугирования н хлористомцезии.РНК растворяют в 2/-ном растворе,ацетата калия, добавляют два объемао,этанола, оставляют на ночь при (-20) Си центрифугирувта 5Поли(А) РНК выделяют и очищаютс помощью олиго ЯТ) целлюпозной хроматографии. 10 г-клеток почечной ткани дают около 3 мг РНК в целом, из(Т) о в качестве затравки, проводятреакцию с 40 единицами обратной транскриптазы в течение 2 ч при 42 С для,синтеза первой цепи и после удаленияматричной РНК путем щелочной обработкисинтез второй цепи проводят с использованием 100 единиц фрагмента Кленоваполимеразы 1.После обработки нуклеазойцепь(с С) освязывают с 3 -концом двунитеной кДНК с помощьв концевой девок;синуклеотидилтрансферазы и получаютоколо 400 мг кДНК с (ЛС)-хвостом.Этот материал клонирувт в рВК 322и получают кДНК-библиотеку, состоящую из 2 х 1 Ф тетрациклин-резистентныхи ампициллин-чувствительных трансфор "мантов,П р и м е р 3, Получение синтетических ДНК-олигомеров для использова-ния в качестве зондов для классифика-ции кДНК-библиотеки.С использованием фосфотриэфирногометода синтезируют следующие 16 ДНКолигомеров, состоящих из 14 нуклеотидов, которые комплементарны, и РНК,соответствующей аминокислотной последовательности человеческой урокиназыАзп , С 1 п, РгоТгр, РЬеб 9, 73,ААССААССТТСАТТААССЛАССТТССТТЛЛССАСССТТСАТТЛАССАСССТТСАТТ ЛАССАСССТТССТТААССАТССТТССТТЛАССАТССТТССТТААССАЛСССТСАТТЛАССЛАСССТССТТААССАССССТСАТТААССАССССТССТТЛАССАССССТСАТТААССАССССТССТТААССАТСССТСАТТААССАТСССТССТТААССАСССТТССТТЭти 16 ДНК-олигомерон именуют какзонд 1.Дпя использования н качестве подтверждающих зондов тем же путем синтезированы следующие 8 ДНК-олигомеров,состоящих из 14 нуклеотидовкоторыекомплементарйы, и РНК, соответствующей Мей , Тгу, Азп, Аэр, Ргогеэ 787;5 ССАТСАТТАТАСАТ 3ССАТССТТАТАСАТССАТССТТСТАСАТССАТСАТТСТАСАТСССТСАТТАТАСАТСССТССТТАТАСАТССДСОТТТАСАЭти 8 ДНК-олигомеров именуют какзонд 11:.С использованием Т 4-полинуклеоти;докиназы, 200 кг каждого из зондов1 и 11 метят радиоактивностью на 5 -конце с помощьюрАТР получениязондов гибридизации колоний.П р и м е р 4. Классификация кДНКбиблиотеки.1. Классификация,Нитроцеллвпоэный фильтр помещаютна 1,В-агарнув среду,содержащую15 мкг/мп тетрациклина и средуинокулирувт трансформантами, полученными в примере 2, чтобы обеспечитьрост 2000 колоний трансформантов.По прошествии 8 ч инкубирования при37 бС колонии реплицирувт на два нитроцеллюпозных фильтра, которые далееинкубируют в течение 3 ч при 37 ОС.Исходный нитроцеллюпозный фильтр используют н качестве эталона, тогдакак два вторых фильтра переносят наЕВ-агарнув среду,.содержащув 15 мкг/млтетрациклинаи 100 мкг/мп хлорамфени."кола,и подвергавт инкубированив. при37 фС в течение ночи. Фильтры затемпомещают на 3 мин на 0,5 М ХаОН и1,5 М ЮаС 1 для осуществления лизисаколоний и денатурации ДНК, и посленейтрализации на 0,5 М трис-НС 1 рНи 1,5 М ИаС 1 сушат на воздухе и затемв печи при 800 С в течение 2 ч.После промывки Фильтров в 4-х5ББС в течение 30 мин каждый раз прибОС, предгибридизарв проводят в4 хБЯС, 1 ОхДенхардт и 50 мкг/я дена. турированной ДНК Е.со 1 в течение часа при 60 С, и после добавленияо,100,1 мМ АТР и меченного зонда гибриди,зацию проводят в течение 16 ч прио37 С. После промывки Фильтры сушат навоздухе и классифицируют в отношениитрансформантов, гибридизирующихся с 15зондом 1, что дает 21 клон, Плазмидыэтих клонов в дальнейшем именуютсяплазмидами рКЮ 1-рКУЮ 1 . Полученные21 клон обрабатывают описанным вышепутем и получают клоны, гибридизирую Ощиеся с ПК их зондам 11.1 лазмиди в этих,клонах в дальнейшем именуются плазмидай рКЖ 2 .2. Характеристики ДНК плазмидырКТБ 21. 25После переваривания НК плазмидырКУ 021 с различными рестрикционнымиэндонуклеазами и субклонирования ихв М 13 щр 8, определение нуклеотиднойпоследовательности проводят с помощью 30О,методики завершения дидезокси-цепиПутем контрастирования этой последо,вательности с известной аминокислотной последовательностью урокиназыподтверждают, что хотя к/НК содержитполную кодирувщую область низкомоле-35,кулярной урокиназы, отсутствует Фрагмент ДНК длиной около 100 п.о. на5 -конце кодирувщей области высокомолекулярной урокиназы.П р и м е р 5, Построение кДНК"библиотеки 01 ) с помощьв реакциипродления затравкиОсновываясь на нуклеотиднай последовательности, определенной в п.2. 45примера 4 с помощьв Фосфотриэфирногометода получают ДНК-олигомер5 СТСААСАССАТСАтЛ 3состоящий из15 нуклеотидов, которые комплементарны мРНК-последовательности, соответствующей Бег, Азр, А 1 а, 1.ец, С 1 ц.89З 5 ОИспользуя 100 мкг поли (Л) +РНК вкачестве матрицы. синтезируют первуюкДНК-цепь с использованием 100 единицобратной транскриптазы и 1 мкг Рмеченной затравки с последующим син 55тезом второй цепи 100 единицами Фрагмента Кленова ДНК полимеразы 1 Е .со 1 ьЗатем однонитевув ДНК расщепляют Р:-нуклеазай и цепь (ЙС) добавляютна 3 -конце, используя концевую дезоксинуклеатидилтрансферазу. Послеотпуска этой вставки Ф;-хвостом(рВК 322), трансфарарувт Е,. со 1 Хс получением кДНК-библиотеки, состоящей из приблизительно 5 х 10 трансфарФмантов,П р и м е р 6. Классификация кДНКбиблиотеки.Полученные в примере 5 трансформанты подвергают гибридизации по методике примера 4, В этом случае в качестве зонда используют Фрагмент РзС 1В 81 115 Плазм рКУ 121 . Гибридизациюпроводят при 60 С, Клоны, гибридизирующиеся с указанным зондом, выявляют с помощью ауторадиографии и получают 8 паловжтельных клонов, Плазмидыэтих клонов впоследствии именуютсяплазмидами рРЕ 1-рРЕ 8. После переваривания этих плазмидных 1 НК рестрикционным Ферментом Рвг 1 подтверждают,что плазмида рРЕЗ содержит кДНКвставку длиной приблизительно 420 п.о.Фрагменты, полученные перевариванием ДНК плазмды рРЕЗ рестриктазойРз 1, субкланируют в М 13 рн 8 . В результате подтверждено, чта кДНК содержит не только достаточно длиннуюобласть кодирования са стороны 5 -(и нетранслируемув область 5 -конца,длиной бб п.а. перед кодовом ЛТС инициации трансляции,П р и м е р 7, Построение проуракиназного гена,5 мкг ДНК плазмидь рКУП 21, содержащей полную область кодирования нцзкомалекулярной урокиназы, дважды переваривают 1 О единицами рестриктазыВ 81 11 и Нп( 111 и вьдслявт Фрагментдлиной 5,7 т.п.а. Затем 1 НК плазмидырКУ 21 переваривают дважды 10 единицами В 81 11 и Мсо 1, а затем выделявтфрагмент размером 66 п.о. После этого5 мкг ДНК плазмиды рРЕЗ, полученнойв примере б, переваривавт дважды 10единицами 1 с 01 и НЫ(1 111 с получением ДНК-Фрагмента 1,1 т.па. Этитри ДНК-Фрагмента повторно экстрагируют Фенолхлорофармам, осаждают 22 объемами этанала, осадок выделяюти очищают. Эти три разных ДНК-Фраг-мента связывают между собой с помощьвТ 4 ДНК-лигазы и трансформируют клеткиЕ.со 11 Х , Трансформанты к(:ассифи(776827 1695П р и м е р 11. 1. Получение однонитевой ДНК.По 1 мкг плазмиды рКУП 22 и Х 13 рш8-фаговой двунитенои ДНК переваринаютв 20 мкл раствора, содержащего 10 иМтрис-НС 1 (рН 7,Я, 7 мМ фС 1, 7 мХ-меркаптоэтанола и 50 мХ Ха(;1 втечение часа при 37"(. с использованием 5 единиц Рз 1 . Фрагменты ДНК выделяют, лигируют и трансформируют10клетки Е,со 11 ЛМ 103, Трансформантывысевают на агар, содержащий 0,02 ХХ-еа 1 и 1 мМ РТС, культивируют во,течениеночи при 37 С. Однонитевую15ДНК получают из белых бляшек, образованных рекомбинантом.Однонитевую ДНК используют в качестве шаблона, определяют последовательность оснований и подтверждаютпоследовательность клонированной од 20нонитевой ДНК.2.;(интез. двунитевой ДНК,Используя клонированную цепь однонитевой ДНК в качестве шаблона и син1тетической олигонуклеотид5 САТ(САСААААСССС 3в качестве затравки (1), проводятреакцию полимеризации с помощью ДНКполимеразы Кленова,3. Переваривание с помощью 81 нуклеазы.Переваривание с Б 1-нуклеазой проводят для устранения из результирующей двунитевой ДНК непрореагировавшей35однонитевой ДНК, служащей н качествефона. 2 мкл реакционной смеси гидролизуют Я 1-нуклеазой, инкубируют прио,26 С в течение 30 мин, Реакцию завершают добавлением 10 мкл 0,25 Х трисНС 1 (рН 8, О) .4. Трансформация Е.со 1 з(Х 103.10 мкл указанной реакционной смеситрансформируют Е.со 13(Х 103,5. Классификация мутантов.С использованием зонда - олигонук-",пеотида, использовавшегося н качествезатравки, Фаговые бляшки классифицируют гибридизацией бляшек для определе.ния мутантного Фага. Бляшки переносят50с мягкой агаровой среды на нитроцеллюлозный Фильтр, нагревают н вакуумев течение 2 ч при 80 С и гибридизируютв течение ночи и растворе. Фильтр55промывают и мутантно-Фагонь(е бляшки,дающие положительные сигналы, изолируют, Мутантный Фаг дает мутантно-Фаговую ДНК днунитевого типа. (рп 1 ) .П р и и е р 12. Введение мутации в кодон 135-й аминокислоты с использованием Фага М 13 (2),В качестве шаблона с использонанием новогоолигонуклеотидного мутагенапроводят введение сайт-специфическоймутации. В этом случае в качестве затравки (2) использован синтетическийолигонуклеатид5 ССААСААА(СССТССТСТ 3Этот олигонуклеотид из 18 оснонаний комплементарен урокиназному генув однонитеной шаблонной ДНК, измененолишь одно основание, как это можновидеть по изменению кодона ААА лизинана кодон АСА треонина.)2 пмоль 5 -Фосфорилированной затранки добавляют к 0,5 пиоль шаблоннойоднонитевой ДНК и инкубируют н 10 мклраствора, содержащего 7 иМ трис-НС 1(рН 7, Я 0,1 мМ ЭДТА, 20 мХ аС 1 и7 иХ М 8 С 12 в течение 20 мин при 60 С,Дальнейшее инкубирование проводят втечение 20 мин пРи 23 оСд К Реакционнойсмеси добавляют ИМАТР, 4 СТР, Й ТТР ий СТР до концентрации 0,5 мХ и 2 единицы ДНК-полимеразы Смесь инкубируют20 мин при 23 С, а после добавления1 мкл 10 мХ АТР и 1 единицы Т 4 ДНКлигазы инкубируют н течение ночи при12 С. Смесь трансформируют в Е,со 1ЛХ 03.Бляшки переносят с агара на нитроцеллюлозный Фильтр, прогревают при80 ОС 2 ч, гибридизируют с затравочнымолигонуклеотидом. Затем Фильтр промывают и мутантные Фаговые бляшки, дающие положительные сигналы, изолируют.Из мутантного фага получают двунитеную ДНК (рш 2), определяют нуклеотидную последовательность и подтверждаютналичие требуеиой мутации в виде замещения одного основания,П р и м е р 13, Построение плазмиды р 1 ШР 1, содержащий ген человеческой проурокиназы.Используя плазмиду рУТЛ, содержащую Р 1.-промотор и БВ-последовательность и С 230 в качестве вектора, строят плазмиды, содержащие урокиназную кДНК, полученную на основе человеческой почечной ткани. Для этого 10 мкг плазииды рУТ(1 1 переваривают 10 ед. Ба 1 Е и Аа( 11 в 100 мкл раствора, содержащего 10 иХ трис-НС 1 (РН 7,4), 7 иХ Х 8(;1 и 150 иХ ИаС 1, в течение 2 ч при 37 (, и нь(г(еляютфрагмент ДНК Ба 1 1 - Аа 11 длиной около 4,5 т.п.о.10 мкг плаэмиды рКМЦ. 1 перевариваот 10 ед. 1)га 1 в 100 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-НС 1 (рН 7,4),.5 7 мМ МяС 1 и 60 мМ ИаС 1 в течение 2 ч при 37 оС, добавляют АТР в концентрации 0,66 мМ, После добавления 1 мкм На 1 1 - ликерной ДНК (5"ССТС(АСС 3) и 100 ед. Т 4 ДНК-ли,газы смесь инкубирувт при 12 ОС в ,течение почи. ДНК-фрагменты вьделявт с помощью обработки фенолом и этанольного осаждения и переваривают 10 ед. Аас 11 и Ба 1 1 в 100 мкл раст- вора, содержащего 10 мМ трис-НС 1 (рП 7,4), 7 мМ М 8 С 1 и 150 мМ ИаС 1 в течение 2 ч при 37 оС и с помощьв электрофореза в агароэном геле вьделяют ДНК-фрагмент человеческой уроки назы длиной около .2,2 т.п.о. По 1 мкг, каждого из фрагментов смешивают и лигирувт в течение ночи в 20 мкл раствора, содержащего 66 мМ трис-НС 1 25 (рН 7,4), 7 мМ МС 1, 0,66 мМ АТР и 10 мМ дитиотреитола при 12 ОС с ис пользованием 100 единиц Т 4 ДНК"лигазы, Лигаэной смесью трансформируют Е.со 1 НВ 101, отбирают клон, несущий плазмиду рМПР 1П р и м е р .14. Построение плазми ды рМУР 1 ршИспользуя мутантнув М 13 шаговую двунитевув ДНК, содержащую кЦНК- фрагмент, в котором кодон ААА, опре 35 деляющий лизин в положении 135 рт И-конца урокиназы, мутирован в кодон САА, определяющий глвтамин, и ппазми ду рЮРХ, имеющую проурокиназный генниже РЬ-промотора и С 230 ЗВ-последова-, тельности, строят плазмиду, содержа-, щую мутированный ген, Для этого10 мкг мутантной М 13 - двунитевой ДНК переваривают с помощьв Рзй 1 и вьделяют фрагмент длиной около 1,2 теплое10 мкг плазмиды рМБР 1 частично переваривают с помощью Рзй 1 и выделяют фрагмент длиной около 5,4 т.п.о, из которого удаляют лишь фрагмент длиной около 1,2 т.п.о. Фрагменты вьделявт и лигирувт. После трансформации получают клон,.содержащий плазмиду рМБР 1 рш.Плазмида рМПР 1 рш содержит область, 55 кодирующую человеческо-проурокиназоподобный полипептид в сайте ниже РЬ-промотора,и С 230 БП-последовательности. В этой области кодированиякодоны, определяющие шесть И-концевыхаминокислот указанного полипептида,заменены кодонами, которые экспрессирувтся в Е,со 1, и кроме того, кодонААА, определяющий Ьуз в положении135, заменен на кодон САА, определяющий глвтамин.П р и м е р 15. Построение плазмиды рМБТ 4 Ьрш 2 со структурным геномпроурокиназы и точечной мутацией нижеСас"промотора.10 мкг М 13"."мутантнои двунитевойДНК гидролиэувт рестриктазой Рз.1,вьделяют фрагмент длиной около1,2 т.п.о. 10 мкг рМБТ 4 Ь .частичнопереваривают с помощьв Рзй 1 и вьделяют Фрагмент длиной около 4,6 т.п.о.Фрагменты смешивают, лигирувт и транс"формируют в Е.со 1 НВ 101. Трансйорман.ты классифицируют по методике щелоч-:ного лизиса и получают клон, содержащий плазмиду "рЮТ 4 Ьрш 2 .П р и м е р 16 ,Введение мутациив кодон 157-й аминокислоты.Получение однонитевой шаблоннойДНК.По 1 мкг плазмиды рКУП 22 и фаговой;Форманты высевавт на мягкий агар,содержащий 0,02% Х да 1 и 1 мМ ИПТГ.Пластинкиинкубирувт при 37 С в тече;ние ночи, Однонитевую ДНК получаютиз белых бляшек, образованных рекамбинантом.2. Введение мутации.С использованием результирующейрекомбинантной М 13-аговой однонитевой ДНК в качестве матрицы введениемутаций проводят с помощьв другогоолигонуклеотидного мутагена. В этомслучае. в качестве затравки используют,синтетический.олигонуклеотид5 ССтССССИХтАЯАСАТТА 3Хотя этот олигонуклеотид иэ 18 оснований комплементарен урокиназномугену в однонитевой шаблонной ДНК, дваоснования изменены, Кодон ТТТ, определяющий Йенилаланин, заменен на кодон САТ, определяющий аспарагиновувкислоту.С использованием упомянутого олигонуклеотида в качестве затравки двунитевую ДНК синтезирувт п чуго,Для этого 2 пмоль 5 -Фосфорилирован./ной затравки добавляют к 0,5 пмоль .матричной однонитевой ДНК, инкубируютв 10 мкл раствора, содержащего 7 мМтряс-НС 1 (рН 7,5), О, 1 мМ ЭДТК, 20 мМ,НаС 1 и 7 мМ М 8 С 1, в течение 20 мин (0при 60 о(: с последующим инкубированиемспрн 23 С в течение 20 мин, к реакционной смеси добавлявт по 0,5 мМ Л АТР,Й СТР, ЙТТР и АСТР до объема 20 мкл.и 2 единицы ДНК-полимеразного Фрагмента Кленова. Смесь инкубируют при23 С в течение 20 мин и после добаволения 1 мкл 10 мМ АТР и 1 единицы Т 4 ДНК-лигазы еще в течение ночи при12 С. Реакционнув смесь трансформируют и Е,со 11 Л 103 и получают около10.000 Фаговых бляшек на микролитруказанной реакционной смеси.После переноса блявек с мягкогоагара на нитроцеллвлозный Фильтр 25офильтр нагревают в вакууме.при 80 Св течение 2 ч, гибридизувт с затра,.вочным олигонуклеотидом, меченымс помощьвр, промывавт в бхББС при52 С и бляшки мутантного Фага, даюощие положительные сигналы, вьделявт. ауторадиографически. Из мутантногофага получавт мутантно-Фаговув ДНКдвунитевого типа (рнЗ) .Можно заменить кодон ТТТ, опреде"35ляющий фенилаланин в положении 157,С 1 ц-определяющим кодоном (АА с использованием олигонуклеотида5 СССССС(С(АААА(БРАТТА 3в качестве мутагена.П р и Й е р 17. Построение плазмиды рМУТ 4 ЬрщЗ, в которой структурныйген урокиназы, имеющий точечную мута цию, вставлен ниже Е,со 1 х Сас-промотора. 4510 мкг М 13-мутантной двунитевойДНК (р(чЗ), с помощьв Рзс 1 вьделявтфрагмент длиной около 1,2 т.п,о,1 О мкг плазмиды рЮ 5 Т 41, частично переваривают с помощьв Рзг 1 и вьделяют50фрагмент длиной около 4,6 т.п.о.Фрагменты смешивают, лигирувт ииспользуют для трансформации Е.со 1 з.НВ 101, Получают клон, содержащийплазмиду рЖТ 41.АЗ .П р и м е р 18. Построение плазми 55ды рКК игр.,5 мкг плаэмиды рКК 223-3 гидролизуют 30 единицами ЕсоК 1 и 20 единицами Рчц П в 100 мкл буфера (10 мМтрис-НС 1, рН 7,5, 10 мМ М 8 С 1, 50 мМНаС 1 и 1 мМ ДТТ) в течение 1 ч при37 С. Реакционнув смесь подвергаютэлектрофорезу в 0,7 Х агарозе и вьу-ляют ДНК-Фрагмент длиной около2600 п.о содержащий ген ампицилин- резистентности, область инициированиярепликации в область ггп ВТ У окончания транскрипции,Фрагмент обрабатывают ДНК-полимер"азой в 25 мл буфера (50 мМ трис-НС 1(рН 7, 2), 10 мМ МАМБО+, О, 1 мМ 1)ТТи 80 мкМ ЖТРБ в течение часа при25 оС и обозначают как (А) .10 мкг плазмиды рБТИ 16 и по 20 ед.гидролизуют рестриктазами С 1 а 1 иРчи 11, вьделяют Фрагмент длиной около 300 п.о., содержащий промотор.,оператор и рибосомо-связывающий сайттриптофанового оперона.Фрагмент обрабатывают ДНК полимеразой и обозначавт (В).Далее по 0,5 мкг ДНК - Фрагментов(А) и (В) лигирувт и продукт реакциииспользуют для трансформации Е.со 1.НВ 101. Ампицилин-резистентные трансФорманты отбирают для вьделения колоний, несущих плазмиду рКК игр, и требуемую плазмиду вьделявт.П р и м е р 19. Построение плазмиды рТгрБК 2,1 мкг плазмиды рКК игр гидролизувтрестриктаэой и вьделявт требуемыйДНХ-Фрагмент (С) .10 мкг плазмиды рЮ 1 Т 41. гидролизуютрестриктазой, вьделявт Фрагмент размером 640 п.о содержащий М-концевуюобласть гена человеческой урокиназы.Этот фрагмент обозначен (1.ЛНК-Фрагменты (С) и (Д) лигируюти используют для трансформации Е.со 11НВ 101, Отбирают колонии, несущиеплазмиду р 1 грКХ, и вьделявт требуемую плазмиду.1 мкг плазмиды рСгрЦК расщенрестриктазойРзС Е и вьделявт требуемый Фрагмент ДНК (Е).10 мкг плазмиды рМ 11 Т 41, расщепляютрестриктазой и вьделявт Фрагмент (Е)длиной 1,2 т,п.о содержащий Сконцевую область гена человеческойурокиназы. Фрагменты (Е) и (Р) лигирувт ииспользуют для трансформации Е.со 1.НВ 101, Из ампицилин-резистентныхтрансформантов отбирают колонии, не 15 1 б 95827сущие плазмиду ртрУК 2, и выделяюттребуемую плазмиду.П р и м е р 20. Построение нлазми,(ы ргрЦК 2 (1135),Двунитевой мутантный Фаг М 13 И(1135), в котором вставлен ДНК"ВрагМент, кодон ААА которого, определяю,щий лизин в положении 135, мутационнозаменен на кодон АТА, определяющий,(эолейцин, получают по методике при-(ера 11, за исключением применения.следующего синтетического олигонукле-отида в качестве затравки:5, САСАТССААТАААССС 310 мкг Фаза М 13 КР (1135) полностьюереваривают с использованием .Рз 1выделяют ДНК-Фрагмент длиной около1,2 т.п.о. 1 мкг плазмиды рйгрБК 2полностью переваривают с помощью Рз 11 20выделяют ДНК-Фрагмент длиной около,4 т.п.о и используют в качествевектора. Фрагменты лигируют с испольэованием Т 4-ДНК-лигазы и реакционнувсмесь используют для трансФормации 25Е.со 1 х НВ 101. КлассиФицируют ампици-лин-реэистентные колонии и получают,(1135). Все условия проведения этойпроцедуры соответствуют описанным.в примере 4.П р и м е р 21. Построение нлаэмиры рСгрБК (Е 135).Двунитевой мутантный Фаг И 13 КР.(Е 135), в котором вставлен ДНК."Фрагмент, кодон ААА которого, определяющий лизин в положении 135, мутационноизменен на кодон (АА, определяющийглютаминовув кислоту, получают по ме"тодике примера 10, за исключениемприменения следующего синтетическогонуклеотида в качестве затравки:5 САТССАСААААСССТ 3Затем по методике примера 20 изфага М 13 КР (135) и плазмиды Негр(Я 2 45получают плазмиду регрПК 2 (Е 135),П р и м е р 22. Построение плазмиды ргрОК 2 )135 Д 157),Двунитевой мутантный Фаг, в котором вставлен ДНК-Фрагмент, кодон АААкоторого изменен на кодон САА, опре 50делявщий глвамин, получают по методике примера 11за исключением применения синтетического нуклеотида вкачестве затравки:5(САТССАСАААА(ССС 3Затем по методике примера 11 иэуказанного Фага получают однонитевуюшаговую ДНК и по описанной выше мето дике получают двунитевой мутантный Фаг М 13 КР (Ц 135 Д 157), в который вставлен ДНК-фрагмент, кодон ААА которого, определяющий лизин в положении 135, мутационно изменен на кодон САА, определяющий глютамин, и кодон ТТТ, определяющий Фенилаланин в положении 157, аналогично изменен на кодон САТ определяющий аспарагиновую кислоту, за исключением использования синтетического олигонуклеотида 5 СССССССССАТААСАТТА 3 в качестве затравки, в результате чего меняют кодон ТТТ,. определяющий Фенилаланин в положении 157 на кодон САТ, определяющий аспарагиновую кислоту.Плазмиду йгр 11 К 2 (0135 Д 157) получают из М 13 КР (0135 Д 157) и плаэмиды рСгр 11 К 2 по методике примера 20.П р и м е р 23, Построение плазмиды грОК 2 (Е 135 Д 157).Двунитевой мутантный Фаг М 13 КР (Е 135 Д 157), в котором вставлен ДНКФрагмент, кодон ААА которого, определяющий лизин в положении 135, мутаци- онно изменен на кодон САА, определяющий глютаминовую кислоту, а кодон ТТТ, определяющий Фенилаланин в положении 157, изменен на кодон САТ определяю щий аспарагиновую кислоту, получают .по методике примера 22 эа исключением использования синтетического нуклеотида 5 САТССАСААААССССТ 3для мута:ционного изменения кодона ААА, определяющего лизин в положении 135, на кодон САА, определяющий глютамино" вую кислоту.Далее по методике примера 20 плазмиду сгр 11 К 2 (Е 135 Д 157),получают иэ И 13 КР (Е 135 Д 157) и грОК 2 .П р и м е р 24. Экспрессия проурокиназо-подобного полипептида./Плазмиды рМОРТ и рИЦРр, полученные соответственно в цримерах 13 и 14, трансформируют обычным путем ,в Е.со 1 х У 3110 и результирующие транс,Форманты культивируют лри 3(1 ОС в 50 мл Ь-бульона,Температуру культурального .бульона повышают до 42 О(;, когда поглощение на 600 нм достигает 0,3, и дальнейшее инкубирование проводят в течение 3 ч при экспрессии урокиназного гена.П р и м е р 25. Экстракция генного ; продукга из Е.со 1 и его свойства.Клетки Е.со 11 3110 собирают иэ 5 мл жидкой среды, описанной выше, и .после суспендирования клеток в1695827 0,5 мл раствора, содержащего 7,5 Мгуанидин гидрохлорида и О,О 5 М трисНС 1 (рН 7,5), суспензию оставляютстоять на 90 мин при комнатной температуре. Затем суспензию центрифугиру 5ют при 1 ООО об/мин и после разбавления надосадочной жидкости в 5 мл раствора, содержащего 1 М гуанидин гидрохлорида, О,О 5 трис-НС 1, рН 7,5.2 мМ глутатиона, смесь инкубируютв течение ночи при комнатной температуре. Затем диализируют 4 ч при 4 Сотносительно 100-кратного объема раствора, содержащего 1 О мМ трис-НС 15(рН 7,4) и 0,4 М ИаС 1, и дальнейшийдиализ проводят 2 ч относительно 10 Ократного объема раствора, содержащего10 мМ трис-НС 1 (рН 7,4) и О,1 М ВаС 1 .К части результирующего сырого20экстракта добавляют трипсин до конечной концентрации ЗО мкг/мл и смесьинкубируют 1 ч при 37 С. В качествеконтроля аналогично инкубируют смесь,содержащую воду вместо трипсина. 25Указанные смеси подвергают электрофорезу в геле, содержащем 12,5%полиакриламида, Гель погружают в 2,5%тритон Хи инкубируют 1 ч прикомнатной температуре. Затем гельнаслаивают на фибрин-агаровую пластинку и инкубируют 1-2 ч при 37 С.После этого оценивают молекулярнуюмассу по расположению раствореннойзоны на фибрино-агаровой пластинке,Для сравнения проводят электрофорети 35ческую миграцию стандартной пробыурокиназы, полученной на основе человеческой мочи.Полученный на основе плазмиды40рМБРХ генный продукт имеет молекулярную массу около 5 О.ООО, часть продукта преобразована в низкомолекулярныефрагменты молекулярной массой около30.000 в результате трипсиновой обра 45ботки. Полученный на основе плазмидырМОР 1 рш генный продукт также имеетмолекулярную массу около 5 О.ООО, ноне преобразуется в низкомолекулярныйматериал в ходе трипсиновой обработки. Молекулярная масса этих продуктов несколько ниже, чем у высоко- инизкомолекулярных урокиназ, полученных из человеческой мочи, 5 О.ОООи 30.000 в сравнении с 54.ООО и33.00 О, что связано с неприсоединением гликоэидных цепей в клетках Е.со 1П р и м е р 26. Экспрессия проуро-,киназо-подобного полипептида,Плазмиду р 1 ШТ 41,рг 2, полученнуюв примере 25, трансформируют в Е.со 13.Л 1103 и трансформант культивируютв 5 мл 1-бульона при 37 С. Экспрессию индуцируют добавлением ИПТГ (изопропил-"В-тиогалактолиранозид) доконечной концентрации 1 мМ, когдапоглощение на 550 нм достигает О,5,и дальнейшее культивирование проводяти течение 3 ч,при 3 С для экспрессииурокиназного гена.Сырой экстракт получают после обработки 5 мл указанной жидкой средыпо методике примера 25 и часть сырогоэкстракта обрабатывают трипсином.Эти препараты подвергают электрофорезу в геле, содержащем 10% полиакриламида, гель погружают в 2,5%тритон ХОО, после чего инкубируютпри комнатной температуре в течениечаса. Гель наслаивают на фибриноагаровую пластинку и инкубируют 2 чапри 3 С. Молекулярную массу оценивают по местоположению раствореннойзоны ча фибриноагаровой пластинке.Для сравнения осуществляют такжеэлектрофоретическую миграцию стандартного образца урокиназы из челове.ческой мочи и обработанного трипсиномпрепарата, полученного в примере 25Продукт плазмиды рМБТ 41,рш 2 с трудом преобразуется до низкомолекулярного компонента, как это происходитв случае генопродукта на основе плазмиды рЮИрш, Молекулярная масса этого продукта несколько ниже этого показателя для высоко- и низко-молекулярных урокиназ из человеческой мочинапример, 5 О.ООО и ЗО.ООО в сравненияс 54.000 и 33.000, что возможно связано с неприсоединением гликозидныхцепей в клетках Е.со 1 зП р и м е р 27. Экспрессия проурокиназо-подобного полипептида,Плазмиду рКЗТ 4 ЬршЗ, полученнуюв примере 17, трансформируют в Е.со 1 ь.,3 М;ОЗ, трансформант инкубируют в5 мл 1.-бульона при 37 С. Экспрессиюо,индуцируют добавлением ИПТГ до конеч"ной концентрации 1 мМ, когда поглощение на 550 нм достигает О,5, и дальнейшее культивирование проводят 3 чпри 3 С для экспрессии урокиназногогена,Клетки Е.со 11 ЗИ 1 ОЗ собирают.После суспендирования клеток ихоставляют стоять на 9 О мин при комнатной температуре, затем центрифуги