Способ получения кислой дезоксирибонуклеазы

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности икасается производства Ферментныхпрепаратов, а именно к способу получения кислой дезоксирибонуклеазыДНК-азы ) из животного сырья. 5Известен способ выделения и очистки кислой ДНК-азы из селезенкисвиньи, который заключается в приготовлении кислого водного экстрактаиз свежей селезенки, подкислении 10экстракта до рН 2,5, двухступенчатого высаливания белна, содержащегокислую ДНК-азу, сульфатОм аммония споследующей хроматографической очисткой обессоленного сырья ферментногопрепарата, которая включает,трипоследовательные стадии: хроматографию на диэтиламиноэтил-сефадекс,хроматографию на гидроксилапатите,хроматографию на карбоксиметил-сефадексе. Этим способом достигаетсяочистка двух ферментных препаратовДнк-аз (,13, Выход по активности 4,9и 19,3; выход по белку 0,018 и0,07 соответственно,Недостатками этого способа выделения являются низкий выход целевогопродукта, длительность и многостадийность очистки, а такжеиспользование на второй стадии очистки Фермента хроматографии на гидроксилапати" ЗОте, Метод хроматографирования ферментов на гидроксилапатите являетсясложным, трудоемким, плохо воспроиз"водимым и поэтому не применяется вширокомасштабном биохимическом 35производстве.Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности являетсяспособ получения кислой ДНК-азы изсеменников лосося, который заключается в экстрагировании животной ткани кислым водным раствором, фракционировании экстракта сульфатом аммония, обессоливании, после чего фракции, обладающие Ферментативной актив ностью, собирают и после добавленияк ним дитиотреитола (1 мМ 1 лиофилизируют. Лиофилизированный препаратфермента растворяют в разбавленномрастворе ЙаОН таким образом, чтобырН Ферментного раствора равнялся6, 7. Препарат фермента наносят наколонку с гидроксилапатитом (2,5 х11 см , уравновешенным 0,04 М Мо-фосфатным буфером, рН 6,7. После отмывкиколонки этим же буфером осуществляют ступенчатую хроматографию, постепенно повышая концентрацию фосфатаМц в элюирующем растворе. КислаяДНК-аза элюируется в 0,15 м Йа -фосфатном буферном растворе. На этом " 60этапе конечный целевой продукт концентрируют, диализуют в течение ночипротив водного раствора, содержащего2,5 мМ 2-меркаптоэтанола, 5 мМ ЭДТА,рН 7, и оставляют храниться при -30 С 65 Известным способом получают 1,4 мг ДНК-азы из 2 кг семенников лосося, что составляет 11 от активности сырого ферментного препарата в экстракте. Достигнута очистка фермента по активности в 5920 раз, Длительность способа 14-16 дней 123Недостатками известного способаявляются его длительность и сложность, Кроме того на одном из этапов очист"ки ферментного препарата используютгидроксилапатит, что свидетельствуето сложности процесса, связанной сострогим соблюдением технических условий хроматографии. Способ не обеспечивает достаточного выхода целевого продукта (выход ДНК-азы по белку составляет 0,00191,Цель изобретения - увеличение выходЬ целевого продукта и упрощениепроцесса.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу получениякислой ДНК-азы, включающему экстрагирование животной ткани кислым водным раствором, фракционирование экстракта сульфатом аммония, обессоливание и выделение целевого продукта с помощью хроматографии, экстрагированию подвергаЮт печень минтая, а хроматографию обессоленного ферментнОго раствора осуществляют на фосфоцеллюлозе с элюцией .буфером рН 7,1-7,2, а затем на анионообменнике с элюцией тем же буфером, содержащим 0,3- 0,35 м масг.В качестве анионообменника используют ДЭАЭ-целлюлозу или ДЭАЭ-сефадекс, или ТЭАЭ-целлюлозу, или АЭ-цел-. люлоз у.Удельная активность кислой ДНК-азы,полученной данным способом составляет 50 ед. на 1 мг белка, степень очистки по активности 29,4 раза, выход Фермента по активности 31. Конечный целевой продукт не содержит интерферирующих примесных активностей."Фосфатаз и Фосфодиэстераз. Длительность процесса очистки 4-5 дней. П р и м е р г. 35 г свежемороженной печени минтая мелко измельчают и экстрагируют кислым водным раствором (дистиллированная вода, физиоло- . гический или буферный раствор, под" кисленные серной кислотой до рН 2,5 ) в скоростном электрогомогенизаторе, центрифугируют при 8000 хв течение 30 мин при 4 С. Супернатант собирают и операцию повторяют еще раз для полного извлечения фермента из ткани. К объединенному супернатанту добавляют сульфат аммония 30 насыщения при 20 С, перемешивают до полного растворения соли и оставляют на 5-6 ч при 4 С для формирования осадка белка, который затем фильтруют через двойной бумажный Фильтр1100308 31 9,4 0,9 0,2 8,2 1,38 1,26 1,31,5 ДЭАЭ-сефадексТЭАЭ-целлюлозаАЭ-целлюлоза 66 66,872 30,4 32,7 при 4 С. К фильтрату добавляют сухойсульфат аммония (85 насыщения ) приперемешивании и оставляют на 5-6 чдля полного осаждения белка. Осадокфильтруют через двойной бумажныйфильтр или центрифугируют при 8000 х 5в течение 1 ч , растворяют в минимальном объеме 0,05 М аммоний-ацетатного буфера, 0,002 М ЭДТА, рН 5,35, 4 и затем обессоливают на колонкес сефадексом Г, уравновешенной 10этим же буфером со скоростью 220240 мл/ч,Обессоленный сырой ферментныйпрепарат наносят на колонку (1,1 х6,3 см) с фосфоцеллюлозой, уравновещенной 0,05 М аммоний-ацетатным бу"фером, 0,002 М ЭДТА, рН 5, 3-5, 4.Колонку промывают этим же буферомдо исчезновения Уф-поглощения вэлюате при Анм. Десорбцию ферментного препарата, содержащего наряду с кислой ДНК-азой кислуюРНК-азу, осуществляют 0,2 М Йа -фосфатным буфером с 0,001 М ЭДТА,рН 7,1-7, 2. Выход ферментного препарата из колонки контролируют поУвикорду (можно использовать Увикорд и самопйсец любого типа),Полученный после хроматографиина фосфоцеллюлозе ферментный препа- З 0рат разбавляют дистиллированной водой в 10-12 раз и наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (1 х 10 см)уравновешенной О, 02 М Иа-фосфатнымбуФером. 0,001 М ЭДТА рН 7 1 По е 35предварительной отмывки колонкиэти же буферным раствором, содержащим 0,1 М ММ, кислую ДНЮ-аэу де"сорбируют 0,02 М йа -Фосфатным буфе-.ром, содержащим 0,001 М ЭДТА и0,3 М МАПСР, рН 7,1.40На этом этапе происходит отделе"ние кислой ДНК-азы от кислой РНК-азы( кислая РНК-аза в условиях, приве,денных в примере 1, не сорбируетсяна анионообменнике), и полученный 45препарат кислой ДНК"азы (конечныйцелевой продукт ),не содержит интерферирующих примесных активностей:фосфатаз и фосфодиэстераз. Из 35 гпечени получают 1,38 мг кислой, 50ДНК-азы (по белку), удельная активность фермента увеличивается в 29,4 раза по сравнению с исходной в сыром препарате.П р и м ер 2Хроматография ДНК-азы на колонке с ДЭАЭ-сефадексом. Полученный после хроматографии на фосфоцеллюлозе ферментный препарат (как в примере 1) разбавляют дистиллированной водой в 10-12 раз и наносят на колонку с ДЭАЭ-сефадексом (1 х 10 см ), уравновешенным 0,02 М М-фосфатным буфером, 0,001 М ЭДТА, рН 6,9-7,2. После предварительной отмывки колонки этим же буферным раствором, содержащим 0,1 М МаП, кислую ДНК-азу десорбируют 0,02 М Ка -фосФатным буфером, содержащим,001 М ЭДТА и 0 35 М РЬС, рН 6,9-7,2.П р и м е р 3. Хроматография ДНК-азы на колонке с ТЭАЭ-целлюлозой. Препарат ДНК-азы, полученный после хроматографии на фосфоцеллюлозе (как в примере 1 ), наносят на колонку с ТЭАЭ-целлюлозой (1 х 10 см ) уравновешенной 0,02 М йа -фосфатным буфером, 0,001 М ЭДТА, рН 6,9-7,2.После предварительной отмывки колонки этим же буферным раствором, содержащим 0,1 М Иай, кислую ДНК-азу (конечный целевой продукт десорбиру" ют 0,02 М Йа -Фосфатным буфером, содержаЩим 0,001 М ЭДТА и 0,3 М )ЧюС 6, рН б, 9-7, 2.П р и м е р 4. Хроматография ДНК-азы на колонке с АЭ-целлюлозой. Препарат, полученный после хроматографирования на фосфоцеллюлозе (как в примере 1), наносят на колонку с АЭ-целлюлозой (1 х 10 см ), уравновешенной 0,02 М М -фосфатным буфером, содержащим 0,001 М ЭДТА, рН 6,9-7,2. После предварительной отмывки колонки этим же буферным раствором, содержащим О,." М МеС 1, кислую ДНК-азу ( конечный целевой продукт ) десорбируют 0,02 М М-фосфатным буфером, содержащим 0,001 М ЭДТА и О, 3 М МаСС, рН 6,9-7,2.Сводные . количественные данные очистки кислой ДНК-азы на последней стадии очистки с использованиемразличных анионообменников приведены в табл. 1.Т а б л и ц а 1, Выход ДНК-азы по активности сос" тавляет 31,3. Исследования свойств препарата кислой ДНК-аэы, получаемой по предлагаемому способу, показывают, что: оптимум рН фермента находится в области 5,0-5,5; Фермент стабилен в широком диапазоне рН 4,08,0 для проявления активности препарат фермента не: требует ионов двухвалентных металлов; фермент расщепляет дНК по эндонуклеазному типу с образова нием 3- концевых фосфатолигонуклеотидов; фермент проявляет высокую специфичность по отношению к ДНК, ,среди продуктов гидролиэа преобладаТ а бл и ц а 2 Выход % по Общаяферментнаяактивность,ед. Удельнаяферментная активностьед. на1 мгбелка Общийбелок,мг Очисткапо активности Процедураочистки,белку активности Обессоленный сыройферментный препаратфосфоцеллюлоза 1,7 10025 6050 31,3 100 130 220 5, 27 132 14,7 4,05 ДЭАЭ-целлюлоза 1,38 69 1,06 29,4 Ферментного препарата фосфоцеллюлозы и анионообменника приводит к уве" 4 О личению выхода целевого продукта,сокращению длительности очистки фермент- ного препарата, упрощению процесса. Составитель О. СкородумовРедактор Т.Веселова Техред Ж. Кастелевич Корректор А,Ильин Заказ 4543/23 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий . 113035, Москва, Ж, Раушская наб. д, 4/5филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул. Проектная, 4 Таким образом, использование В данном способе в качестве источника ,сырья для получения кислой ДНК-азы печени минтая, а в качестве сорбентов для хроматографической очистки от крупные олигонуклеотиды с молекулярной массой более 40 тыс.дальтон. В табл. 2 представлены количественные данные процесса хроматограФической очистки кислой ДНК-азы из печени минтая от стадии получе- ния сырого ферментного препарата до выхода целевого продукта. За единицу активности фермента принимают такое коЛичество ДНК-азы, которое за 1 ч инкубации при 37 С приводит к образованию 1 ОЕ 20 нкислоторастворимых продуктов гидролиза ДНК.