Способ получения щелочной или аммониевой соли инсулина

(45) Дата опубликования описания 31.03,13,(51) М, Кл. А 61 К 37/26 Государственный комитет Совета Министров СССР оо делам изобретений и открытийИностранецРичард Ли Джексон (США)(72) Автор изобретения Иностранная фирма(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШЕЛОЧНОЙ ИЛИ АММОНИЕВОЙ СОЛИ ИНСУЛИНАИзобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к получениюлекарственных препаратов для лечения сахарного диабета.Известен способ получения препаратовинсулина путем смешивания щелочной илиаммониевой соли инсулина с цинком, протамином в соотношении на каждые 00 ед инсулина 0,2 - 1,5 мг протамина при рН раствора 6,58,0 1. Однако известный способне обеспечивает высокого качества целево- Ого продукта,Целью изобретения является повышениекачества целевого продукта.Эта цель достигается тем, что соль двухвалентного металла инсулина растворяют вводно-кислой среде, добавляют соединениещелочного металла или аммония в хелатообразующем агенте, например в этилендиамин-Х,Х,Х,Х-тетрауксусной кислоте в количестве 0,0002 - 0,05 М при рН 7,68,6,Двухзалентный металл включает элементь Л В, Л 11 1 В, и 11 В групп периодической системы элементов, например марганец,же,зсзо. кобальг, никель, медь, цинк и кадмий, предпочтительно двухвалентным металлом я гл яется цинк, елочной металл включает элем енты группы 1 А до 5-го периода включительно. Предпочтительны литий, натрий, калий.Водный гцелочной раствор инсулина содержит двухвалентный металл, хелатообразующпй агент и ионы шелочного металла и аммония, рН раствора может меняться от 7,6 до 8,6, предпочтительно рН 8,2. Концентрация инсулина с двухвалентным металлом может меняться от 1 О до 00 ед/мл. 1 рсдпочти гельная концентрация такого инсулина составляет приблизительно 500 ед/мл. Хелатообразуюшим агентом может быть, например, этилендиамин-Х,Х,Х.Х-тетрауксусная кислота, 1,2-диам иноп ропан- Х,Х, Х, Х -четырех- уксусная кислота, 1,3-диамино-оксипропан- -Х,Х,Х,Х-четырехуксусная кислота, диэтилентриаминчетырехуксусная кислота, диэтилентриаминопятиуксусная кислота, гексаметилендиа мин-Х,Х, Х , Х -четы рехуксусная кислота, Х-бутилэтилендиамин-Х,Х,Х,-трехуксусная кислота, Х- (2-оксиэтил) этилендиамин-Х,Х,Х-триуксусная кислота, этилендиамин-Х,Х,Х,Х -тетрапропионовая кислота и другие. Лучшими хелатообразующими агентами являются полиметилендиаминчетырехуксусные кислоты, самым предпочтительным624563 рацией является 0,2% 3хелатообразующим агентом является этнлендиамин-М,М,Ы,Ж-четырехуксусная кислота,Хелатообразующий агент используют ввиде свободной кислоты, либо в виде ее солисо щелочным металлом или аммонием. Еслиберут соль, катион соли должен быть тем же,что и катион требующегося щелочного металла или аммония в инсулине. Следует учитывать количество добавляемого катиона врезультате применения такой соли при определении количества требуемых ионов щелочного металла или аммония.Для того чтобы удалить двухвалентныйметалл из инсулина и осуществить быструюкристаллизацию. инсулина на базе щелочного металла или соединения аммония, молярное соотношение между хелатообразующнмагентом и двухвалентным металлом в инсулине должно быть 3:1. При более низкихсоотношениях скорость кристаллизации инсулина на щелочном металле или на соединении аммония из щелочного раствора понижается. При более низких соотношенияхрастет вероятность того, что двухвалентныйметалл остается связанным с инсулином.Концентрация хелатообразующего агентадолжна составлять приблизительно 0,0002 Ми может доходить до 0,05 М. При концентрации инсулина иа базе двухвалентного металла приблизительно 500 ефмл предпочтительная концентрация хелатообразующего агента 001 М.Щелочной водный раствор инсулина надвухвалентном Металле может также содержать ионы щелочного металла или аммония.Концентрация ионов щелочного металла илиаммония может меняться от 0,2 до 1,0 М.Ионы щелочного металла или аммониямогут поступать из любого (или любых) водорастворимого соединения, которое не оказывает вредного действия на инсулин.Часть требующихся ионов щелочного металла или аммония может быть получена прииспользовании хелатообразующего агента вформе соли щелочного металла или аммонияили при использовании основного щелочного металла или соединения амМония для регулировки рН раствора. Ионы могут быльполученц из хлорида, бромида, фторида,йодида, ацетата, сульфата, фосфата. Лучшими являются хлоридные и фосфатные соли,предпочтительны хлориды.Шелочные водные растворы инсулина надвухвалеитиом металле можно приготовитьразличными способами; Предпочтительныйспособ заключается в растворении инсулина на двухвалентном металле в кислой водной среде и подгонке получающегося раствора до щелочного рН при помощи подходящего основания. Хелатообразующий агентили дополнительные ионы щелочного металла или аммония можно добавлять в любоевремя в виде твердых частиц или в виде водных растворов. Кислый водный раствор инсулина на двухвалентном металле имеет рН 2,5 - 3,5, Кислотность раствора обеспечивают любой неорганической кислотой, предпочтительна хлористоводородная кислота,При необходимости в кислые водные растворы инсулина на двухвалентном металле добавляют консерванты, например фенол, метилпарабен, а также изотоническне агенты, например глицерин, глюкозу.Количество консерванта составляет 0,4% но весу на объем, предпочтительной концентЗатем кислый водный раствор инсулина с двухвалентнцм металлом делают щелочным при помощи основания, в основном используют гидроокись щелочного металла или аммония, карбонат аммония и другие аналогичные щелочиые соединения,Другой способ получения щелочного водного раствора инсулина с двухвалентным металлом заключается в растворении инсулина с двухвалентным металлом в водной щелочной среде с рН, равным приблизительно 8 - 9,5, рН конечного раствора 7,6 - 8,6. Щелочность исходного водного раствора обеспечивают за счет гидроокиси щелочного металла или аммония,Восстановление щелочности достигают добавлением разбавленной неорганической кислоты, соляной нли фосфорной,Концентрированные растворы в инсулине на двухвалентном металле являются более трудными для приготовления, чем разбавленные растворы из-за пониженной растворимости инсулинов на двухвалентном металле в щелочном растворе,Хелатообразующий агент и ионы щелочного металла или аммония можно вводить в любое время, обычно их вводят перед стадией окончательной доводки рН.После приготовления водного раствора инсулина с двухвалентным металлом, инсулина на щелочном металле или аммоний инсулин начинает кристаллизоваться из раствора, обычно нри температуре окружающей среды, но при необходимости можно использовать более высокие или низкие температуры. Предпочтительна температура кристаллизации киже 30 С.Затем полученные кристаллы инсулина на щелочном металле или соединенИи аммония отделяют известными способами.Обычно кристаллы отделяют центрифугированием и промывают последовательно разбавленным, раствором соли щелочного металла или аммония (обычно около 0,5 М), ацетоном, абсолютным спиртом и простым эфиром. Затем кристаллы сушат под вакуумом,При,яер. Цинк-инсулин в количестве 8 г, состоящий приблизительно на 70% из инсулина, получаемого от быков и коров, и на 30% из инсулина от свиней растворяют в 400 мл воды с фенолом и кислотой, которую624563 Формула изобретения Способ получения щелочной или аммониевой соли инсулина путем смешения водного раствора инсулина с двухвалентным металлом, отличающиися тем, что, с целью повышения качества целевого продукта, соль двухвалентного металла инсулина растворяют в воднокислой среде, добавляют соедине. ние щелочного металла или аммония в хелатообразующем агенте - этилендиамин-Х,М, Ж,Я,-тетрауксусной кислоте в количестве 0,0002 - 0,05 М при рН 7,6 - 8,6.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:. Патент США50862,кл. А 61 К 17/02, 1972. готовят растворением 0,8 г фенола в 400 мл0,01 М водного раствора соляной кислоты,Полученный раствор делят на четыре равныепорции и добавляют к каждой порции 2 гхлористого натрия. ь 1 етыре порции обозначают как пробы- 4.5К трем пробам добавляют четырехнатриевую соль эти,"енлнамннтетрауксусной кислоты. Затем рН кажлого растворд устанавливают 8,2 путем добавления 40/,-ного водного раствора гидроокисн натрия. В пробах 2 в О4 сразу начинаитобраэовываться кристаллынатрий-инсулина. В пробе 1 кристаллы необразуются даже после перемешивания втечение 3 ч.Пробу 1 титруют 0,1 М водным раствором этилейдиаминтетрауксусной кислоты (в15виде четырехнатриевой соли). При концентрации этилендиаминтетрауксусной кислотыприблизительно 0,006 М начинается кристаллизация натрий-инсулина. Каждую пробу перемешивают в течение всей ночи. Затем кристаллы натрий-инсулина отделяют центрифугированием, промывают олин раз ацетоном,дважды абсолютным спиртом и один разпростым эфиром.Затем сушат под вакуумом.Пример 2/Очищенный натрий-инсулин вколичестве 2 г (полученный из поджелулоч:.,ой железы быков и коров), имеющий активность 27 ед/мг и содержащий минимальныеколичества кислых протеиновых примесей,растворяют в 400 мл 0,5 М уксусной кислоты. К получающемуся раствору лОбавляют20 мл абсолютного спирта н 0,4 мл 20%-ногораствора хлористого цин,.а, причем последний раствор соответствует 40 мг хлористого цинка наг инсулина. Затем рН раствора доводят до 5,95 добавлением 200/0-ной З 5гидроокисн аммония и раствор выдерживают в охлажденном состоянии прн 5 С 72 ч.Образовавшиеся кристаллы цинк-инсулинасобирают центрифугированием, промываютодин раз дистиллированной водой и растворяют в 50 мл кислой фенольной воды, Раствор разводят до 100 мл кислой фенольной водой, К полученному раствору добавляют 2 гхлористого натрия и 0,208 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (в виде четырехнатриевой соли). Затем раствор доводят до рН 8,2 45400/0-ным водным раствором гидроокиси натрия. Начинают образовываться кристаллынатрий-инсулина.,Кристаллизация идет при температуреокружающей срелы. Кристаллы натрий-инсулина выделяют центрифугированием, промывают и сушат, как описано в примере 1,Выход натрий-инсулина 1,864 г, что соответствует 93,2/0.Пример 3. Повторяют все процедуры попримеру 2, но исходным матеоиалом является натрий-инсулин, выделенный из поджелудочной железы свиней, с активностью25 ед/мг. Окончательный выход 1,862 г, чтосоответствует 93,2/0. 6Пример 4. Кристаллы цинк инсулина (70/0 иэ поджелудочной железы быков н 30/0 иэ поджелудочной железы свиней) растворяют в 300 мл кислой фенольной воды, К 100-миллилнтровой аликвоте этого раство ра добавляют 2,5 г хлористого. калия, рН раствора устанавливают 82 добавленнем 3,5 мл 10%-ного водного раствора гидроокнси калия. К полученному мутному раствору добавляют 0,3 г этилендиаминтетрауксусной кислоты. Затещ рН раствора снова устанав. ливают 10%-ной гидроокисью калия до 8,2. Раствор перемешивают при температуре ок. ружающей среды (около 25 С) 48 ч. Крис.- таллизация начинается в течение первых 12 ч, Получающийся калий-инсулин отделя. ют центрифугнрованием, промывают дважды абсолютным спиртом, а затем один раэ простым эфиром и сушат под вакуумом. Выход калий-инсулина 1,736 г (86,8/0),Пример 5. К 100-миллилитроной аликвоте раствора цинк-инсулина по примеру 3 добавляют 1,4 г хлористого лития. рН раствора устанавливают 8,2, вводя 6,2 нл 1 М гидроокиси лития. Мутный раствор обрабатывают этилендиаминтетрауксуснои кислотой и рН устанавливают 8,2 при помощи 1 М гидроокиси лития по методике примера 3. Затем проводят кристаллизацию, как в примере 3, получая аналогичные результаты. Образующийся литий-инсулин выде. ляют, как описано в примере 3, получают 1,234 г (61,6%) продукта,Пример 6. Повторяют методику приме. ра 4, но хлористый литий заменяют 1,8 г хлористого аммония,. а гидроокись лития заменяют 60 мл 1 М гидроокиси аммония, После добавления этилендиаминтетрауксусной кислоты и установления рН при помощи 1 Мгидроокиси аммония кристаллизация не происходила после 24 ч. Добавляют дополнительно 1,8 г хлористого аммония. Кристаллизация происходила после перемешивания в течение дополнительных 24 ч. Полу. чающийся аммоний-инсулин выделяют, как описано в примере 3, выход 1,018 г (50,9%) продукта.