Способ получения вещества, обладающего гормональным действием

Совоэ СоеетсюаСоцналмстмцееанхреса ублм нц 624562 ИЗОБРЕТЕН ИЯ. Кл Прио А 6 С 0 5/4 5/О Гееуааустевевй ееиетет овеете Мввввтеее ССР ее двин езебретеее м еткеьте) Дата оп новавпа онисания 17.09.78 72) Лвторы аобретеИностранецЛасло Фойер(ВНР) остранное предприятие ЕШ Ведьесетя Термекен Дьяр ( ВНР) 3) Заявтел Хнн(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕШЕСТВА, ОБЛАДАЮШГОРМОНАЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ2 Способ осуществляетзом. следу ови луч гируполучматеняюткульа товиИ ратпо.(водрошо тиче Э ее активные прбиологически акконцентрироваме и дезактивирактивный гормо риготавливают бол , которые содержат вещество в более более чистой фор тствующий кальции тив ной ратыноеилисопу Водные экстра ков и полинептид бавляют осадител луч ен н ы й раствор кты освобождают от белов причем к экстракту доь белка и применяют. по- после отделения осадка(43) Опублиовао 15,09.7 Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается получения лекарственных препаратов.Известен способ получения гормонального препарата из околощитовндной железы путем экстракции водой и прн необходимости проведения очистки с использованием методов гель-фильтрации, хроматографии н фракционироваиия растворителями 11,Однако препарат, полученный известным способом, является полипептидом, повышает уровень кальция в крови.Целью изобретения является получение вещества, обладающего гормональным действием небелкового характера, который повы. шает уровень кремния в крови.Эта цель достигается тем, что околощитовидную железу млекопитающих высуши. вают, измельчают, затем экстрагнруют водой, полученный водный экстракт отделяют от твердых частиц, осаждают из него белки и полипептиды трихлоруксусной кислотой, затем удаляют избыток трихлоруксусной кислоты серией экстракций водным раствором диалкилового эфира и целевой продукт подвергают очистке, кроме того водную экстракцию ведут при температуре 20 - -60 С. ыделеииую из млекопитающих околощиную железу сушат и размалывают, в е необходимости обезжиривают, экстрают водой и подвергают лиофилизации енный раствор. В качестве исходного риала для получения вещества приме.также культуры вещества и клеточные уры, которые происходят от околощиной железы млекопитающих. зготовлеиный таким путем концеый раствор) или лиофилизованнык) пригоден для получения фармких препаратов.о 55 В качестве осадителя белка применяют трихлоруксусную кислоту, сульфосалициловую кислоту. Белки можно удалить при по- моши рас:ворителей и высаливания.Отделение белковых веществ, полипептидов и других фракций осушествляют и при помощи гель-фильтрации, вещество получают с высокой чистотой. Очистку концентрата биологически активного вещества осуществляют и другими способами, например, хромотографии, диализа, экстракции, осаждения, адсорбции или комбинации этих способов.Для разрушения кальцийактивного парагормона обрабатывают веществами, которые легко реагируют с белковыми веществами или с полипептидами. Для этого применяют азотистую кислоту, окись этилена, формалин. Содержание биологически активного вешества в препаратах может быть в широких пределах и зависит от ряда условий. Все эти препараты приготавливают известными способами из твердых или жидких концентратов или смесей в форме таблеток, свечек, растворов, мазей, порошкообразных смесей или составов для распыления. Таблетки с содержанием биологически активного вещества 0,05 - 3 мг изготовляют мокрыми методами гранулирования, но применяют и сухие методы. В качестве наполнителей и вспомогательных вешеств применяют неактивные вешества.Инъекционные растворы получают из водных растворов с концентрацией 0,05 - 5 мг/мл, с удалением белковых веществ. Приготавливают инъекционный раствор стерильным фильтрованием. Мази приготавливают с концентрацией биологически активного,вешества 0,01 - 1 г/кг, Для этого используют гидрофильные и гидрофобные основы мазей. Также приготавливают свечи, для которых используют масло какао или для синтетических - карбовакс. Концентрация биологически активного вешества в свечах составляет 0,055 мг в зависимости от чистоты концентрата.Приготавливают также косметические препараты, которые в качестве биологически активного вешества содержат вещество, обладающее гормональным действием. Эти косметические препараты изготавливают из твердых или жидких концентратов вешества с известными растворителями, добавкой присадок, наполнителей, разбавителей и эксципиентов в форме мазей, растворов, кремов, эмульсий; порошкообразных смесей, составов для распыления.Содержание биологически активного вещества составляет 0,01 - 0,5 мг/г.Полученное вещество, обладающее гормональным действием, не оказывает влияния на уровень кальция в сыворотке крови, но повышает содержание кремния и изменяет 15 20 25 за 35 о 45 5 а концентрации других микроэлементов, на. пример, Сц, Г и других.В клинической терапии вещество оказывает благоприятное действие на синдром Сьегрена, на КЬпо-аппдо-рЬаппр 1 з з 1 сеа, склеродермию, кожный грибок, лучевую эритему и другие болезни.Пример 1. 1 О г подвергнутого лиофилизации и размолотого порошка железы обезжиривают известным образом. Порошок перемешивают с 25 мл ацетона при.ко;ч 1 натной температуре и фильтруют на стеклянном фильтре. Затем хорошо отжатый порошок железы опять смешивают с 25 мл хлороформа при комнатной температуре и фильтруют на стеклянном фильтре. Операцию повторяют. Затем отжатое вещество опять суспендируют в 25 мл абсолютного ацетона при комнатной температуре и отсасывают на стеклянном фильтре. Полученный порошок железы сушат в вакууме при комнатной температуре. Вес сухого вещества 7 - 9 г в зависимости от содержания жира в исходном веществе. Затем 10 г обезжиренного, безводного порошка железы трижды экстрагируют в 100 мл дистиллированной воды при комнатной температуре в течение одного часа. Между стадиями экстракции порошок железы отделяют от экстракта центрифугированием.Экстракты до переработки хранят в атмосфере азота при температуре 3 - 5 С. Водные вытяжки имеют положительную реакцию относительно нингидрина, биурета и трихлоруксусной кислоты. Затем водные вытяжки собирают и закапывают водный 50/,-ный раствор трихлоруксусной кислоты при постоянном взбалтывании до тех пор, пока конечная концентрация трихлоруксусной кислоты не составит 15%. После одночасовой выдержки при 3 - 5 С осадок трихлоруксусной кислоты подвергают центри- фугированию.Верхний слой представляет прозрачный бледно-желтый водный раствор, дающий отрицательную реакцию на .биурет и трихлор уксусную кислоту, положительную реакцикпа нпнгидрин.Избыток трихлоруксусной кислоты удаляют последовательной экстракцией при комнатной температуре водным эфирным раствором, Экстракцию проводят 17 - 18 раз, чтобы полностью удалить трихлоруксусную кислоту. После последней экстракции водная фаза должна иметь величину рН 4,5 - 5, Водную фазу освобождают от,эфира при по- моши водоструйного насоса при температуре не выше 30 С в течение 6 ч. Освобождение от эфира контролируют отсутствием запаха. После этого водный раствор подвергают лиофилизации и хранят в закрытом сосуде, Препарат гигроскопичен. Выход в пересчете на общий вес порошка железы (перед обезжириванием) составляет 10 - 15/о (в зависимости от содержания жира),Пример 2. По примеру 1 из водного экстракта обезжиренной околощитовидной жил зы приготавливают экстракт, который не содеркит белка и осадитель, 5 г инертного к трихлоруксусной кислоте лиофилизата подвергают гель-фильтрованио на колонии с сефадексом С - 15. Масса колонны 4,3 х Х 44 см. Элюентом является вода. Скорость потока 6 мл/ч. Размер фракции 15 мл. Основная фракция числа туб 46 - 83 с содержанием 913 мг богата вешеством, обладаюшим гормональным действием и имеет ярко выраженное физиологическое или терапевтическое действие при дозировке 5 - 10 мкг/кг веса тела, Это вешество содержится в двух первых верхних частях гель-фильтрования. Разделение фракций производят следующим образом.Спектрофотометрическое измерение абсорбции при 280 нм, затем при 234 и 360 нм, после этого измеряют электрическую проводимость, затем качественное исследование на хлорид-ион с реактивом - нитратом серебра,Измеряют величину рН соединенных фракций, относягцихся к отдельным вершинам. Затем проводят исследование с реактивом-нингирином и исследуют невооруженным глазом на опалесценцию и окраску.Выход основной фракции числа туб 46 - 83 в пересчете на сухой необезкиренный порошок околошитовидной железы составляет приблизительно 2 - 2,5/о.Пример , Методика примера 2 с той разницей, что оба первых пика улавливают в отдельных основных фракциях. Таким путем получают из 5 г несодержашего белка водного экстракта 302 мг основной фракции 1 и 555 мг основной фракции 11. Затем основную фракцию 11 снова подвергают гель- фильтрованию. 456 мг вешества наносят на колонку, вода применяется как элюент, Размер колонки 4,3 Х 144 см, скорость потока 50 мл/ч, размер фракции 10 мл, сефадекс б - 15. Таким путем основную фракцию 11 разделяют на три других верхних части. Фракции, относящиеся к средней части, соединяются. Вес последней после лиофилизации составляет 237,5 мг. Выход в пересчете на необезжиренный порошок околощитовидной железы составляет 0,6 - 0,8 О/,. Это желтое гигроскопическое вешество с содержанием СНХОЯ или Р. Характерные группы 8 Н - СООН, - ОН. При исследовании массспектрометром получают следующие характерные фрагменты: С 7 НМ;08; С;НХ,О, и С 4 Н,МО. Фракция содержит и другие структуры, Эта фракция имеет физиологическое или терапевтическое действие уже при дозе 1 нм/кг веса тела. Продукт очищают хроматографией или другими методами. Выход вещества 0,3 - 0,4/о в пересчете на сухой порошок околошитовидной железы, суха, Получают 1 г смолистого концентрата.30Пример б. 50 г. лиофилизированного порошка железы обезжиривают по примеру 1.Полученный обезжиренный порошок железы (38 г) смешивают с 40 мл 10 О/о-ного раствора мочевины. После одночасовой выдержЗ 5 ки смесь перемешивают в 400 мл ледяной. уксусной кислоты и 400 мл ацетона. Ее выдерживают в течение 1 ч, затем к раствору добавляют остальные 1200 мл ацетона и 11,2 мл нормального раствора гидроокиси натрия, После осаждения производят фильтрование через слой газа. К содержащему мочевину и ацетон экстракту добавляют 2 л эфира. Смесь оставляют на ночь и затем декантируют. Суспензию центрифугируют, промывают 2 раза по 50 мл в смеси ацетона и эфира (1:1). Полученный осадок смешивают с 200 мл 10 О/о-ного раствора уксусной кис.лоты, осадок растворяют. Затем прибавляют 10 г хлорида натрия, из раствора выпадает осадок, который поглощается в 50 мл водьь Производят диализ 6 раз с 2 л воды, слива ют диализную воду и остаток подвергают 55 5 О 15 20 25 Пример 4. Полученный по примеру 1 лиофилизированный конечный продукт подвергают диализу. 700 мг вещества, растворенные в 33 мл дистиллированной воды, подвергают диализу. Внешнюю водную фазу заменяют каждые 3,5 ч. В следуюшие 3 ночи водную фазу заменяют каждые 16 ч. Диализ проводят при температуре 5 С. Содержание сухого вещества после лиофилизации составляет 35 мг. Внешняя фаза, сконцентрированная в вакууме при 30 С и подвергнутая после этого лиофилизации, дает 662 мг сухого вешества.Пример 5. 20 г порошка железы (подвергнутого лиофилизации, необезжиренного) по примеру 1 растворяют в воде, Затем сгущают освобожденный от белка и эфира водный раствор до 1/3 и экстрагируют путем встряхивания 3 раза 1:1 объемом хлороформа, а водную часть освобождают в вакууме от хлороформа. Не содержащий хлороформа водный раствор сгущают в вакууме до 20 мл и при комнатной температуре добавляют 5 объемов ацетона. Раствор оставляют на ночь на льду. Из почти бесцветной фазы ацетона осаждают желтую маслянистую часть. Ацетоновый раствор отстаивают и желтое маслянистое вещество сушат в вакууме до постоянного веса. Получают 1,1 г желтого смолистого концентрата. Аце- и тоновыи раствор выпаривают в вакууме до лиофилизации. Получают 732 г твердого концентрата. Остаюшеесяв растворе после осаждения хлоридом натрия и центрифугирования вещество (197 мл) обрабатывают 40 мл 45/о-ной трихлоруксусной кислоты и затем центрифугируют. Верхнюю фазу подверга. ют диализу 4 раза по 3 л воды, выпаривают в вакууме и подвергают лиофилизации. Получают 86 г концентрата.1. Способ аолучения Вещества, обладающего гормональным действием, отличающийся тем, что околощнтовндную железу мле. копнтающнх высушинваю, измельчают, за. тем экстрагируют водой, полученный водный экстракт отделяют от твердых частиц, осаж. 8дают нз него белки и полнпептиды трихлор. уксусной кислотой, затем удаляют избыток трнхлоруксусной кислоты серией экстракцнй водным раствором дналкнлового эфира н целевой продукт подвергают очистке.2, Способ по п. 1, отличающийся тем, что водную экстракцню ведут прн температуре 20 - 60 С.Составнтель С. Малютнна Редактор НПотанова Тезред О. Луговая Корректор Н. Тупнца Заказ 603 ЦЬ Тнраж 103 Подписное ИНИИПИ Государственного коннтета Совета Мннистров СССР по делам нзобретеннй н открыт н 303, Москва, Ж.ЗЬ, Рауштная на 6., д. 4/5 Фнлнал ППП Патента, г. Уагород ул. Проектная, 4