Способ получения -аминокислот

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИяК АВТОРСКОМУ СВИДЕПЛЬСТВУ(61) Дополнительное к авт. свид-ву Союз Советских Социалистических Республик) 1980998/04 1) М 1;ла С 07 С 101/О с присоединением заявкиосударственный комитетСовета Министров СССРпо делам иэобретенийи открытий53 ен, В, Э. Калис, Д, Я,куран, В. А. Фелднере,и Е, С, А. К,2) Авторыизобретения 1 атвийский филиал О научно-исслепэватол ена Трудэвэгэ Красного Знамени всесоюзногэгэ института химических реактивов и особоистых химических веществ 1) аявите 54) СПОСОБ 11 ОЛ Изобретение отно ВЕР 5 ПЕНСГНО - ; М 5 ИЭКПСз инэьа 55цугом гизнческие свопства кот я при эксплуатации.С целью интенсификации процесса по пре л:.гаемок 5 у способу непрерывный или многократный ассиметрический гидролиз рацемич 5:скпх апиламипокислог при рН 7-8 и 15- 40 С эсуществляюг, используя в качестве кат ли, тора легко получаемые препарагы аппллзы, сорбированпэй на отечественных неорганических сорбептах с повыщеннэй удел ной пог 5 ерхностью (таких, как силикагель или сплохром). Сорбпию ацилазы на указанных сорбенгах осуществляют при темперагу ро от 0 до 25 оС, причем силикагель предварительно приготавливают кипячением с кис логой, Поскольку получаемые в реакции -ампнокислогы ингибируют ацилазную активность, го препараты иммобилизованной на силикаголе или силохроме ацилазы при перерывах в работе отмываюг и хранрт в буфере рН 7 при 2-6 оС, Сорбировавший ацилазу силохром после потери каталитической активности в результате использования регенерируют прокаливанием при 200-700 оС тся к усо чення - нин, аснари других особу полукак мети ванному лот, так 1 Дм-ацилаюшокислэг. 5 ия Ь - мино емических ацеиммобилнзован сорбцией ацила ен способтем гидрислог с олуче кисло и ом ощьчемойксе. тиламино ной ацил зы, получ АЕ-сефаде ы Недходим остатком этого способа явЬется неость сильного сгущения реакционнэяхпри выделении продуктов реакции,я с те 4, что гидролиз осуществляазбавленных растворах ациламинорастворами, концентрация которыхет 0,2 М; ацилаза быстро вымываДЕ АЕ-сефадекса),смесей связанется в кислот ( превыша ется из1 2 отов- Е-сеКром.ления имфадекс я органиче нымфи г)5 ителем, химически ким того, необходимый для при мобилизованной ацилазы ДЕ ляется малодоступным импо Лауциниеце, 3, В. МикелсонеД. Я. Спэлиге, О. М, Полто ухрай3и снова использ уют дл рбции новой гор- без снижения ее каталитической активностиЯ со бции ацилазы,П еипроцесс получения-аминокислоты м ожреимуществами предлагаемого способа но вести непрерывно (не менее 20 иней),является: возможность неп рерывного или При осуществлении процесса в массе В сомногократного асимет иче кр р ч ского гидролизасуд с препаратом иммобилизованцой ациларацемических ациламинокеслот при повышен- зы наливают раствор рацемической ацилных концентрациях последних (до 0,5 М) а . к слоты и г ;едерживают при темперааминокис отболее высокая скорость асиметрического ги- туре до ЛООС изрдка перемешивая содердролиза рацемических ае и гр ьламинокислот на жимое, до завершения рс)акции получения1 мл объема работающей иммобилиз)ванной 1 е) е -аминокислоты (о чем судят, как вацилазы (до 3000 мкмоль 1. -аланина и предыдущем случае), Затем отфильтровываютдо 625 мкмоль-метионина в 1 час)а ), Кро- препарат иммобилизовацной ацилазы от поме того, необходи ые лям д, приготовления им- лученной реакционной смеси и иммобилизомобилизовацной ацилазы неорганическиено- ф- -, н гмванныйфермент промывают 01 М фосфатнымсители (например, силикагель или сцлохром)б фе иуфером с рг) около 7, после чего его можпредставпяот собой легко доступные выпус- но снова использовать для получения 1каемые отечественной промыш,ценностью -аминокислоты из новой порции рацемическойСОР ЕЦГЫ, ОтгячаКНЦЕЕОСЯ ХИМИЧЕСКОЙ СтОйКО- аЦИЛаМИНОКИСЛОт (к слоты такое использование безстью и посгоянством хорошей фильтруюпей СНИжЕНИя т)Ер),ЕНтатИВНОй аКтИВНОСтИ ПрЕПаата и жцо повторять це менее 5 раз,способности и других физических свойств. ( К рата можно повтоПредлагаемый способ позволяет с помо- Растваствор получаемой реаесееио 1 ой смесищыо препаратов ич,(Об 5)езовццое. аеелазы сушак)т в вакууме при 40-500 С зеадсорберовс)ццой паример на снликагелеи )разовавшуюся , -аминокислоту выделяеот доили силохромеполучать белковые н другие б 1 л т.)сЕВГЕЕтЕМ СПИРта К СГУЦГЕ 11 НОМУ ОСТЙТКУС)Игт 51) )ОГ(т (гтг) УСгг)СЦ) 1051: фг )у- А ацил- В -аминокислоту из соединенных фильчс)СГм 1 "-41)01ыч" с с - с, тиО гс 1 ов после огфнльтровация 1- -аминокис 11 С 1(011(1 ): Г)0, й )11.ело Гы 1. се тес гы.,Е(. с ь выделяют Ец)п г(омощи колонки с каги 0 ри ))Лей)нт 5 питом КРСв водородной форме,тг 1 гС 1111 П " (Зр НС)1 Гг)0(гС)ЕЕ ацИщ П )к,0"; ;,:,., ", .. - р н м е р 1, 10 г ацегонового порошЛа Л Г;РСи)т (. 1; (ЗГф,.Ги.,1 ЬУЗГ)Е С 3) Ка, )ка свиных почек суспендируют в 50 мл ох;т,ьЛа ЖДЕ ) Е 10 Й ЕИС ГЕЛЛЕ 1) ОВ(аНОЙ В СЕ 5 Ь и ВЬДЕ рщ ф:те 1 .).)(10)100 для евра 1 с-)е 5о .;. , с- ". жее)сс)т при 2-4 С, периодически пе емешиКО 1 И г) т в; р,(це 1 Чес.О (1 ЕтЕМПО)1 ИСДОТЪ В,(Я,) ) тОЕ и ОГфЛГРОВЫВДг)Г На ВОРОНКЕ БНЭХЕЕРа.кое, .)1,слс)ты, О 1)-0,5 М) СОГ)гкое,Н). Г,з .: .) , , ".;, 0" - сучс)це в с)1;ьтр)Те экс"гракт (с ацилазВС)ТС:Т.)О-; КОЕт(ЕС)0 С)Л 1 КС)15 )ЕШ С;иве3 ,"г,.0,) ..лг. ф." н:;1 акт)ИОсте0 ОНОПО 20)0 мк 0)еэ/часЛХгв Г,С ,) )1;)З)С 11;С ",)Р 00ЬЕО (ХРДЯ- (5 ацЕа ц 1 м л р с)те) Орс и ) Ь ОколоЕеЙ.:. ):с .- (г "С 11 О,1 г)С)ТНО.( бу О 7, С)лс г;., (СРДЗУ СТ(огтЬ;)УН)т ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕ(ег)д с.)50;О 7) сс) зу)г для з(0)е.-и ЙТОВ 11 ммоб ЕтлизОВ 3(нОи ацее)есезе(Е,ПЕНИЯ СН)5,Ч.) ХЕЭОНЛЗ ГО( г)фПЧС)СКОИ С" 2 г силохрома Ссуспендируют с 10 млЛОНКИ С трс,"(б(;Е)т)501) ПГСЕИ)СС)5 С 1 Н ОбОГг)Ева- екстракта и выдерживаютпериогеически переопсй ВО)ь 1 Цлл 1(с(преец)Ого п9 есса) или ме 11 ивая 20 ч)с при 2-40(.". 3., и,атем силеОефе 1 трог).В/к) г на ВорОпке Бохеег и еще ф х)ом тф 5 .хром ОтфеьгрОвьвают на Воронке БюхнераВ)ЕП)Е;ЕЕЕМ Е) Ет)С и Г тС С)С)(Е ДЛЯ П С 5 ДЕНСЯ Еа.)е)-; , Е, . )с):,с, т р.- аргИ(ЫВах)Т 1 ц, ХПОрНСГЫМ НатрИЕМ В О 1 МаКЕ,(И ,т(1 С(ВС/5(З 1 Я П)ОСЕГ)с(1 В МЙССО) р- 01:." с)т:," " Ь рН 72 дооиутствиябелковвпромывнойжицса че )з косу с п)епглр:1 гом и 41(обил 13 з( ктЕ. то 0 . у,;.; .т,. ЕЗ - КОСТИ. КОЕтрОЛЬ За СОдЕржаНИЕМ бЕЛКОВ ВВаццзй гПЛЛЗЫ Гвр.ЕОС )ат;.50 вацц Ю Па ГЕМ- г,;,.,1, ,г, , .;)г исхОднОм екстраесте фильтрате и поомыВцых1 ер 1)ъ,(0 - 1: (С Г )омоге н) уль 1 иермо жидкОстЯх ОсущестВлпОт 1 О /о ной тееихло ) ао-но . трихлор:, г -с".-.- -,; . ",;)".; :,.,об е актевность (обееаруттаемая тонкослойнойВС О, " ССт)С) СтГЛ - .",ЯГЛЕНС" Лити УСПЕ- ХРОМатОГРафИЕй ПО ГИДРОЛИЗУ ИСПЫтУЕМОйц(глй сл); ки.,1, м 0; НСая концен;,.:)с:т - с гомоно ницгидрина по концентрации воэГ)1 ИЕ .)т РйЗУ)0" (С . "ф(1(.НЕОКИС ЛОГИг . . . 1т , ( ,тИКСЕ 01 В)т В рЕ,(КцщМЕНОКИСЛООт-т;ГЫоколо 1000 мкмоль/час освобождаемого иРВЕЕ)(ИЧЕ( Кой г)1)г,(ВХЛИЕСОЕИСЛг т,т), Я КОЛОНне с пг)е .:з)атее .м;Р) илие Овец н Ои неи)аз523 Составитель Л. ИоффеРедактор 3, Бородкина Техред Г, Родак Корректор А. Лаккда Заказ 4897/385 Тираж 575 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская набд. 4/5филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Полученный препарат сорбированной на силохроме ацилазы загружают в колбу с 300 мл 0,5 М раствооа рацемического Й- -ацетил-аланина, рН которого устанавливают концентрированным аммиаком на 7,2 и выдерживают в термогтате при 37 оС в течение 24 час. По окончании реакции иммобилизованной фермент отфильтровываюти,промыв 0,1 М фосфатным буфером с рН 7;2,используют вторично. Полученный в резуль- ц) тате прошедшей реакции раствор упаривают в вакууме до сиропа при 45 ОС. После охлаждения до комнатной температуры добавляют 30 мл этилового спирта и оставляют на 16 час при 4 оС для кристаллизации, За д тем кристаллы А -аланина отфильтровывают, промывают спиртом и высушивают при 50 оС до постоянного веса,Выход идентифицированного тонкослойной хроматОграфией на силикагеле (в системе бутанол:уксусная кислота:вода, 4:1;1 по объему) хроматографически однородного ( -аланцна 4,7 г (70%),с.1.1. 14,1 о (с = 1 5 , НСфцльтрат после отфильтровыванця - -ала-ц нина упаривают на вакуумном роторпом испарителе прц 45 ОС до небольшого ( около 50 мл) объема и рН раствора добавлением 2 н. соляной кислоты доводят до 2,5-3.Подкисленный раствор пропускают через ко попку со слоем 0,9 х 30 см катцопцтаКРСв водородной форме, через которую затем пропускают дцстиллцровпнпую воду, Далее собирают фракции и проверяют на отсутствие свободных аминокислот реакцией с нингц дрином, Объединенные кислые фракции упа 1ривают в вакууме на роторном испарнтеле до сиропообразпого состояния и оставляют на холоду кристаллизоваться, Перекрцсталлиэовывают из ацетона. Выход ацетил - 40 892-аланина 1,1 г; т,пл, 125 оС; (.д 3 р 62, 2 ( с = 1, вода) .П р и м е р 2, Экстракт ацетонового порошка почек (с активностью 1800 мкмоль/ /час Ь -аланина на 1 мл) получают по примеру 1, Сорбцией ацилазы из 50 мл экстракта на 10 г силохрома С-"80, как в примере 1, получают препарат сорбирован ной на силохроме ацилаэы с активностьюоколо 900 мкмоль/час 1 -аланина на 1 г исходного силохрома, Этот препарат в виде суспензии в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,2 загружают и снабженную рубашкой колонку (20 х 2 см), избегая пузырей воздуха в массе сорбента, Затем промьвиот колонку 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,2, После этого через слой иммойцлцзованной ацилазы в колонке, термостат;ванной на 37 оС с помощью ультратермо;:та, пропускают 500 мл 0,1 М раство 1 п рацемцческого ацегилаланцна с рН 7,-74, уста 1новив скорость протекания, обеспе чц ваюшую завершение реакщ 1 ц дезацетнлпрованця, за кото 1 рой следят при полющи нингидриновой реакции.1 Йалео цз раствора выделяют и характеризую" роматографцческц однородный- аланиятак же, как в примере 1, Выход 1,8 г (80,1;1.) +14,2 (с = 2,5 нНС ). Ф ормула и зобрете ния Способ получения . -аминокислот путем асил 1 летрцческого гцдролиза рацемпческцх М -ациламицокцслот с помощью иммобилизованной ацнлаэы в качестве к:.- талцзатора, о т л и ч а ю щ и й с я те., что, с целью интенсификации процесса,;,О- следний ведут в присутствии ацилазы, цммобцлцэованной неорганическим носителем, таким, как сцликагель или силохром.