Способ выделения аминокислот из белковых гидролизатов

ТЕН КДЕТЕДЬСТВУ ВТОРСКО 61) Дополнительное к авт. свид-ву22) Заявлено 24.02.72 (21) 1752083/23-4(51) М Кяз С 07 С 9 присоединением заявкиосУЮаротвенныи комитет (2 З) Приорит авета Министров СССРОпубликовано 15.01.76, БюллетеньДата опуоликования описания 09.06.76 по делам изобретений и открытий72) Авторы изобретения ич и С. М, Андрее С. В. Рогожин, Ю. А, Дав ементоорганических соединений АН СССР 1) Заявите стит Л КОВЬ 1) СПОСОБ ВЪДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТГИДРОЛ ИЗАТОВ Изобретение относится к усовершенствованому способу выделения и очистки аминокисот из белковых гидролизатов. тель амин а также а путем.Получе типа лег имодейст ступными безводны рующего ровок, с группами ные обла честью и хорошей полярных окислот природн минокислот, пол о происхождения, енных химическим ние производных а ко и просто осуще вии аминокислотпромышленными х условиях. Из-за влияния триалкил вязанных с амино аминокислот, пол дают, вероятно, з всех производнь растворимостью в растворителей,ия аминокислот из щих аминокислоты, фией, Сорбция ис сорбента длиго выделения всей шим выходом и вынеобходимо приментов и соответствуи повышения делять аминоидролизатов вй. еся нен ительности к гиднными свойствами крайне ценны при ия и очистки амиБлагодаря высокои чувствролизу в сочетании с указадисилильные производныеиспользовании для выделеннокислот.На индивидуальных аминокислотах найдено, что реакции силилирования и гидролиза полученных производных идут с количественными выходами, с полным сохранением оптической чистоты взятой для силилирования аминокислоы, Для силилирования можно использовать ряд силазанов, таких как гексаметилдисилазан (СНз) з Я - НЫ51 (СНз) з, триметилсилилдиэтиламин (СН;) з - Ь 1 щении всейся в гидрох гексаалкий формулы сумлиза лди 11- 81-НИ- С 11-0 с.; р изшии алкил - метил, этил;род или любой другой сс-замеи ти где КрУ/ Известен способ выделенразличных смесей, содержаионообменной хром атограэлюирование аминокислоттельны, так как для полносуммы аминокислот с хоросокой степенью чистотынять несколько типов сорбеющих растворителей.С целью упрощения процстепени чистоты предлагаеткислоты из любых белковьвиде их силоксановых соедин Способ основан на преврамы аминокислот, содержащихтах, в смесь соответствующисилильных производных обиде минокислот такого ствляется при взас силазанами, допродуктами, в высокого экранисилильных группии карбоксильной ученные пронзводнаивысшей летух аминокислот и большом числе не4470333- К - (С 2 Н 5) , бис- (триметилсилил) ацета- мид СН - С - 0 - Й - (СН 33Х СН 7 3 и т. д. 50 55 б 0 б 5 Количественное замещение атомов водорода в обеих функциональных группах аминокислот происходит при использовании триметилсилилдиэтиламина и бис-(триметилсилил)- ацетамида, в случае гексаметилдисилазана реакция, в основном, заканчивается после силилирования одной карбоксильной группы.Исходные силазаны получают с высоким выходом при взаимодействии триалкилхлорсилана с диэтиламином или ацетамидом.В случае триметилсилилдиэтиламина силилирование аминокислот идет с выделением диэтиламина, что обеспечивает простой контроль за ходом реакции. Очистка полученных дисилильных производных аминокислот от примесей достаточно просто осуществляется фракционной дистилляцией или экстракцией не- полярными растворителями полученной после силилирования реакционной смеси.Превращение выделенных дисилильных производных в смесь аминокислот легко осуществляется гидролизом водой или спиртом при добавлении их к раствору производных в органических растворителях. Образующиеся в результате гидролиза аминокислоты выпадают и легко отделяются от растворителя, а второй продукт гидролиза - дисилоксан - остается в растворе. Дисилоксан представляет собой целевой продукт в синтезе кремнийорганических соединений и может быть достаточно просто превращен обратно в исходный силазан.Возможность регенерации исходных силазанов позволяет создать замкнутый цикл использования вспомогательных веществ, что увеличивает экономичность предлагаемого метода выделения и очистки аминокислот из белковых гидролизатов.Предлагаемым способом извлекают все аминокислоты из любых белковых гидролизатов и ферментолизатов практически с количественным выходом. Используя точную фрак ционную дистилляцию полученных производных, получают конечный продукт с высокой степенью чистоты.Способ выделения и очистки аминокислот заключается в следующем, Сухой гидролизат или ферментолизат белоксодержащих материалов обрабатывают силазаном, например триметилдиэтиламином, при нагревании до 80 - 120 С в течение 1 - 2 час, Температура реакционной смеси устанавливается несколько выше температуры кипения выделяющегося диэтиламина, чтобы при кипении диэтиламина происходило достаточное перемешивание ре 5 10 15 20 25 30 35 40 45 аукционной массы. По мере завершения реакции температура смеси постепенно повышается в указанных пределах и реакция заканчивается с прекращением выделения диэтиламина. При этом часть силазана расходуется на силилирование функциональных групп примесей, содержащих подвижные атомы водорода. Однако различная летучесть и растворимость образующихся производных аминокислот и сопутствующих примесей позволяет выделит; аминокислотную фракцию, как показано в приведенных ниже примерах.Пример 1. Суспензию 3 г 1.-валина в 9,65 г триметилсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере при 120 С (температура бани) в течение 1 час до прекращения отгонки диэтиламина. После стояния в течение ночи реакционную массу фракционировали в инертной атмосфере. Собирали фракцию с т. кип, 91 - 93 С 10 мм рт. ст. Выход 5,41 г (81/о). Полученное производное крайне легко гидролизуется в парах влагой воздуха. При гидролизе к 1,15 г дисилильного производного добавляли 0,08 мл воды в 1,5 мл эфира. После встряхивания выпавший 1.-валин огфильтровывали и промывали два раза по 5 мл эфира, Выход 0,49 г (95 ). Угол вращения исходного 1.-валина арт равен +6,42 (С=1 в воде), угол вращения выделенного после гидролиза 1.-валина а 6 = +6,86 (С=0,5 в воде), что указывает на полное отсутствие рацемизации.П р и мер 2. Суспензию 3,33 г 1-аспараги. новой кислоты в 14,2 г триметилсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере в течение 1 час. При 135 - 145 С (температура бани) отгоняли 7,3 мл диэтиламина, Из реакционной смеси фракционной перегонкой в инертной атмосфере выделили 6,24 г силилпроизводного аспарагиновой кислоты с т. кип. 80 - 90 С/1 мм рт. ст. В результате гидролиза с 97 -ным выходом получена аспарагиновая кислота. Угол вращения исходной аспарагиновой кислоты а" равен +25,25 (С --- 1 в воде), для кислоты, полученной после гидро. лиза, ар 4 = 26,52 (С = 1 в воде). П р и м е р 3. Суспензию 1,32 г 1.-триптофа. на в 2,4 г триметилсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере, При достижении температуры бани (120 С) наблюдалось быстрое растворение триптофана, закончившееся в течение 5 - 10 мин, отогнано 1,6 мл летучих, Разгонку реакционной смеси прово. дили при остаточном давлении 10-з мм рт. ст, Отбирали 1,72 г фракции с т, кип, 135 140 С. После гидролиза выделили триптофан с выходом 95/о с углом вращения а" рав. ным +10,93 С = 0,4 в 1 н. НС 1). Угол вра. щения исходного триптофана а = +10,93 (С = 0,4 в 1 н. НС 1).П р и м е р 4, 3 г ферментолизата дрожжей нагревали в инертной атмосфере с 11,45 г три.корректор Е. Хмелева Редактор Е. Хорина Заказ 1026,9 Изд. Ме 030 Тп 1 аж 575 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 5метилсилилдиэтиламина 2 час при 100 - 105 С при перемешивании, при этом отгонялся весь диэтиламин. После окончания реакции избыток триметилсилилдиэтиламина отгоняли при 50 С/20 мм рт. ст. Смесь разбавляли 40 мл сухого эфира и центрифугировали при 3000 об/мин, Осадок промывали в 40 мл серного эфира, К объединенному раствору производных аминокислот в эфире добавляли 8 мл воды при перемешивании. Выпавший осадок аминокислот промывали эфиром и бензолом. Промытый осадок суспендировали в бензоле и лиофилизовали. Выход 2,34 г (767 о).П р и м е р 5. Суспензию 2,04 г сухого ферментолизата в 7,67 г триметилсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере при 100 - 105 С 2 час при перемешивании, После отгонки избытка триметилсилилдиэтиламина 150 С/20 мм рт. ст.) реакционную смесь перегоняли в вакууме 10- мм рт. ст. Получили 4,73 г светлого прозрачного продукта, который смешивали с 50 мл эфира и гидролизовали добавлением 6 мл воды. Выпавший белый осадок смеси аминокислот обрабатывали аналогично примеру 4. Выход 1,07 г. Способ выделения аминокислот из белковыхгидролизатов, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения степени чистоты целевого продукта, указанный 10 гидролизат подвергают взаимодействию с силазаном общей формулы где Я - низший алкил,и полученные при этом гексаалкилдисилиль ные производные очищают путем фракционнойдистилляции или экстракции неполярными растворителями и гидролизуют добавлением воды или спирта в реакционную смесь.