Штамм бактерий paracoccus dеniтrifiсаns-продуцент эндонуклеазы рестрикции р 121

(51) 4 С ОСУДАРСТВЕННЫПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТ ОТНРЫТИЯ 9 й 63 Ы СВл., : .ь".дМПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Н АВТОРСКО ИДЕТЕЛ т т Й.дйвц ение относится к биотехастности к получению эестрикции, способной узсщеплять последовательеотидов ССНСС.зобретения является выя го штамма - продуцента,Изобрелогии, в чнуклеазывать и рность нуклЦельюление нов н обеспечивающего целевого продукт человека и нетре тельным средам,Штамм бактери гЫдсапя ВКПМ В- тате поиска штамм оле сок ндо- нагенн а, непа бовател го для . пита но епдгеэуль-Рагас 152 выд ов-про ссцв лен уце(46) 30.12.89. Бюл. Ф 48 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институ биологически активных веществ и Инс тут микробиологии и вирусологии АН КазССР(56) КоЪеггв К.1. Кезггдсдоп ап шодНдсагдоп епзутпея апо г 1 дедг сояпддоп яецепсев. - Мцс 1. Ас Кев, 1985, 13. Бцрр 1. 165-200.Лепгвсй Я., СцпГЬегГ 11 Тга грег Т.А. Мцс 1. Асов Вев. 1981, 12, 2753-2759.Нуфдев Б.С., Вгцсе Т. апй Мцггау К. (1980), ВдосЬеш 1., 1985, 59-63.БцвзепЬасй 1,Б., БгеепЬег 81 д Р.М. Козг 1.А., Чап Эеепптеп Ю.1., Чап ЕпЬйеп 1.П.А.,А яесопй вдйе - вресЫд геяггдсгдоп епйопцс 1 еаве Ггош згар 1 ду 1 ососсцв ацгеця. - Нцс 1 . АсЫв . Кез. 1978, 5, 1153-1163. 2(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ РАВАСОССПБ 0 ЕИ 1 ТК 1 Е 1 САЯБ - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕ АЗЫРЕСТРИКЦИИ Рйе 12 1(57) Изобретение относится к биотехнологии. Целью изобретения является выявление штамма - продуцентаРагасоссцз Йепдг.гдГдсапв ВКПМ В,обеспечивающего получение эндонуклеазы рестрикции Рйе 12 1, являю"щейся изошизомером рестриктазы Бац96 1 и способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидовССИСС, Штамм выделен в результатепоиска штаммов - продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов, обитаю"щих в озере Балхаш, непатогенен длячеловека, нетребователен к питательным средам, легко разрушается ультразвуком, обеспечивает повышенныйвыход целевого продукта, составляющий 3000 ед/г биомассы. Штамм Рагасоссцз йепдггдЕдсапв Впродуцирует эндонуклеазу рестрикцииРйе 12 1, имеет сайт узнаванияССИСС, идентичный сайту узнаванияБац 96 1, 1532583ротриктаз среди микроорганизмов,оитающих в озере Балхаш,Штамм Рагасоссцз йепСгЫсапзВ 4152 характеризуется следующимим рфологическими, культуральными иф зиологическими признаками: клеткис ерические 1-1,1 мкм в диаметре,в тречаются поодиночке, в парах илиа регатах. В молодых культурах могутв тречаться короткие палочковидныек. етки. Неподвижные. Накапливают полиВ оксибутират. Грамотрицательные. Мет болизм дыхательный. Реакции на ок. -с лазу и каталазу положительные. Нег лофилы, нет потребностей в ростов х факторах, яелатину не разжижают.Ш амм хранится в 50 .-ном глицеринев, 1.-бульоне при е -20 С.На рыбопептонном агаре образуетк лонии серовато-белые, блестящие8 9 мм в диаметре с неровными краям , плоские, не врастают в агар. Росто ильный. В РПБ образует равномернуюм ть, осадок, Хороший рост на синтетзнеской среде с минеральным азотом.Продуцируемая предлагаемым штаммомр стриктаза характеризуется следующ ми свойствами: узнает и специфическ расщепляет последовательность нукле 0тидов ССМСС; оптимальное значение рНя действия рестриктазы 7,5-9,0;птимальная температура действия 37 С;я активности рестриктазы требуютсяОны МО Оптимальная концентрация-15 мМ.Для культивирования Раг.реп В рименяют питательную среду следуюего состава, г/л дистиллированной воы; триптон 10, дрожжевой экстракт 40соКультивирование проводят при 30 С( хорошей аэрацией в течение 2 сут.1 ыход биомассы 2-3 г/л культуральнойжидкости. Выход рестриктазы Рйе 12 1: 45:000 ед/г биомассы. П р и м е р , Клетки Раг. Йеп., :ранящиеся в 50 .-ном глицерине в Ь- бульоне при-20 С высевают на чаш- У с 1. А. После 2 сут инкубирования50 1 ри 30 С клетки собирают петлей и носят в 100 мл В и выращивают до плотности 1,5 при 30 С. Затем куль туру вносят в 2 л В выращивают до 1 лотности 2,5 при 30 С. После охлажо 55 ения клетки собирают центрифугироваиием. Выход биомассы 23 г сырого веса с 1 л средыо 4 г клеток суспендируют в 20 мл 0.02 М буффера трис-НС 1 рН 7,5, содержащего 0.001 м р-меркаптоэтанол и 0,1 тритон Х, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (18000 об/мин, 30 мин при 4 С) и надосадочную жидкость наносят на 30 мл фосфоцеллюлозы Р(ЪЪасшап), уравновешенной буфером А (0,02 М калийфосфатный буфер, рН 7.5; 0,001 М ф-меркаптоэтанол, 5 10 М ЭДТА), затем колонку промывают буфером А до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате.Адсорбированный материал элюируют раствором 1 М МаС 1 в буфере А. Затем 60 мп полученного смыва белков с колонки диализуют в течение ночи против 2 л буфера А и наносят на 10 мл ДЕАЕ- целлюлозы (ДЕ, йашап, Англия), уравновешенной буфером А и элюируют 100 мл градиентом 0-1,0 М МаС 1 в буфере А, Объем каждой фракции 5 мл. Аликваты из каждой фракции (1 мкл) инкубируют 1 ч при 37 С с 1 мкл ДНК фагаС 1857 и анализируют в геле агарозы, Фракции, расщепляющие ДНК фага(7-9), объединяют, диализуют 3 ч против 2 л буфера А и наносят на 4 мл фосфоцеллюлозы Р(ЧЬайтап, Англия) и элюируют 40 мл градиентом 0-0,1 М МаС 1 в буфере А. Объем каждой фракции 2 мл. Фракции, содержащие Рйе 12 1, определяют также, как при хроматографип на ДЕАЕ-целлюлозе. Фракции 14, 15, содержащие Рде 12 1, объединяют и диализуют против буфера А, содержащего 0,1 М МаС 1 и 50%-ный глицерин. Полученный препарат фермента (1 мл) имеет удельную активность 12000 ед/мл. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, не.-:бходимое для полного расщеплениямкл ДНК фага Р в течение 1 ч приоЭ 7 С. Ферментный препарат хранят при -20 С. Из 1 г биомассы получают 3000 ед. рестриктазы Рйе 12 1.Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Рйе 12 1, проводят гидролиз ДНК фаза М и рВК 322 рестриктазами Рйе 12 1 и Бац 96 1 по отдельности, а также совместный гидролиз ,этими рестриктазами. Наблюдается ,картина полного совпадения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами Рйе 12 1 и Бац 96 11532583 6ный выход целевого фермента, составляющий 3000 ед/г биомассы (в 12 раэбольше, чем в прототипе).5Формула изобретения Составитель Н. ХодаревРедактор Т. Лазоренко Техред Л,Сердюкова Корректор В. Кабаций Заказ 8070/36 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета. по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,01 5порознь и совместно, указывает на то, что рестриктаза Рде 12 1 является изомером рестриктазы Бац 96 1, узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов ССНСС,Полученный штамм непатогенен для человека; легко разрушается ультразвуком, а также обеспечивает повышенШтамм бактерий Рагасоссцв Йепйг- Г 1 сапз ВКПИ В- продуцент зндонуклеазы рестрикции Рйе 12 1.