Штамм бактерий тнеrмus тнеrморнilus продуцент днк полимеразы

9) ЯУ (11)1) РЕТЕН К АВТОРСКОМУ ОЮЗ СОВЕТСКИХОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)(71) Научный центр по разработке и внедрению современных методов молекулярной диагностики;Всесоюзный научно-исследовательский институт гриппа; Научно - производственный кооператив "Аква культура"(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ТНЕЯМОЗТНЕВМОРНЗШЗ - ПРОДУЦЕНТ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ(57) Использование: микробиология, биохимия ибиотехнология, в частности изучение высокоочи-ц ных препаратов ферментов. Сущногть изобре-те я: штамм Тпегпы ВеггпорЬцв ВКПМ В, выращивают в среде, содержащей мас%: дрожже-вой экстракт 0,2%; триптон 0,3%; глюкоза 0,3%; ИаС 0,5. За 5 - 6 ч культивирования при 72 С с 20 л среды получают 55 - 60 г биомассы. В результате хроматографической очистки ДНК-полимеразы осуществляют последовательно на ДЭАЭ-целлюлозе, фосфоцеллюлозы, гидрокилаппатите достигают удельную активность 35000 ед/мг. Фермент сохраняет свою активность в течение 1,5 ч при 92 ОС и в течение 1 ч при 95 ОС. Ятамм Тпеггпцв тпетпорйцв ВКПМ Ввыделен из горячих вод Камчатки (Долина Гейзеров) и обладает следующими биотехнологичеаами характеристиками: способностью продуцировать ДНК-полимеразу с оптимальной температурой функционирования свыше 75 С и отсутствием в штамме рестриктаз. В связи с этим данный штамм-продуцент можно использовать как источник термостабильной ДНК-полимеразы, которую можно эффективно использо - вать в реакции циклической амплификации при ДНК-диагностике различных заболеваний. 3 табл.Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных препаратов ферментов,Известен штамм ТЬегаоз ФегаорЫ 1 оз Н 88 - и роду цент терм оста бил ьной ДН К- полимерэзы (1.Недостатком данного штамма является то, что помимо ДН К-полимераэы Т,йегаорЫ 1 оз НВ 8 содержит рестриктазу ТйНВ 81 (2, которая в процессе очистки соочищается с ДН К-полимеразой, так, что и репараты ДНК-полимеразы после 3 - 4 хроматографических стадий очистки содержат примеси рестриктазы Тй НВ 8 1. Так как субстратом ДН К-полимеразы и рестриктазы является ДНК, то присутствие в препарате рестриктазы может привести к деградации субстрата и искажению результатов ДНК- полимераэной реакции, Дальнейшая очистка препарата ДН К-полимеразы от 5 10 15 20 рестриктазы ведет к увеличению числа хроматографических стадий, уменьшению выхода целевого продукта и его удельнойактивности.Вторым существенным недостатком известного штамма является то, что оптимальные условия функционированияДНК-полимераэы не превышают 63 С, тогда как при использовании фермента в реакции циклической амплификации 30генетического материала требуется фермент с оптимальной температурой функционирования в области 75 - 80 С,Таким образом, использование известного штамма ТЬегаоз йегаорЫ 1 оз НВ 8 не 35позволяет получить препарат ДН К-полимеразы с высоким выходом, свободный от нуклеаз и обладающий способностьюнормально функционировать в диапазоне75-80 С. 40Наиболее близким к предложенному является штамм бактерий ТЬегаоз зрез 1 езВКПМ В, продуцирующий термостабильную ДНК-полимеразу на С. питательной среде. После отделения клеток из 5-6 ч 45культуры получают 50 г клеток. Удельнаяактивность сырого экстракта составляет 12ед/мг белка, общая активность 48 10 ед.После очистки фермента хроматографиейна фосфоцеллюлозе и аффинной хроматографии на ДНК-целлюлозе и гидроксилапатите получают ДНК-полимеразу с удельной,активностью 25000 ед/мг белка, общей активностью 27000 ед (2.55Целью изобретения является получениештамма-продуцента, не содержащего рестриктазы и содержащего ДНК-полимераэус оптимальной температурой функционирования свыше 75 С. Поставленная цель достигается использованием в качестве продуцента ДНК-полимераэы штамма ТЬеггпоз тЬегаорЫ 1 оз КТП, Используемый штамм ТЛЬегаорЫ 1 оз КТП выделен из горячих вод Камчатки (До-. лина Гейзеров). Штамм обладает следующими признаками, Морфологические признаки; клетки прямые, палочковидной формы, толщиной 0,5-0,8 мкм, длиной 5 - 10 мкм, Образуют нити длиной от 20 до 200 мкм, неподвижные, эндоспор нет, грэмотрицательные. Культуральные признаки; хорошо растут на простых питательных средах с содержанием дрожжевого экстракта и пептона не выше 1 г/л, При росте на агаре колонии круглые, край ровный, прижаты, имеют желто-коричневый пигмент. При росте в жидких средах образуют ровную интенсивную муть, в невстряхиваемых жидких культурах образуется поверхностная пленка, физиолого-биохимические признаки: температурный оптимум 70 - 90 С, оптимум рН 6,7 - 7,9, Облигатные ээробы. Хороший рост на средах с триптоном 0,1-0,3 и дрожжевым экстрактом 0,1 - 0,3;. Плохой рост на средах с содержанием триптона и дрожжевого экстракта свыше 1%. Рост на среде с гидролизатом казеина (0,1), свободным от витаминов, и с добавлением глутаминовой кислоты (0,5 оь) в качестве источников углерода, азота и энергии. Растет на синтетической среде с сульфатом аммония или глутаматом, используемыми в качестве источников азота, и с углеводами или солями органических кислот - глюкозой или сахарозой, ацетатом, сукцинатом, цитратом, нет роста на среде с нитратами, используемыми в качестве источников азота. Чувствительна к антибиотикам - ампицилину, тетрациклину, канамицину,П р и м е р 1. 1.Штамм ТЬегаоз 1 ЬегаорЬоз КТП, являющийся продуцентом термостабильной ДНК-полимераэы, выращивают в среде, содержащей, мас,6: дрожжевой экстракт 0,2; триптон 0,3; глюкозу 0,3; 1 чаС 0,5. За 5 - 6 ч культивирования при температуре 72 С с 20 л среды получают 55 - 60 г биомассы.2,Хроматографическая очистка термостабильной ДНК-полимеразы из штамма ТЬегаоз ОегаорЫ 1 оз КТП.2,1.Начальная плотность засева культуры 0,1-0,2 ед/мл, по поглощению среды при А 56 о. Температура инкубации 73+2 С, Выращивание культуры ведут до плотности 3 ед/мл. После центрифугирования с 10 л среды получают 30 г биомассы. К 30 г биомассы добавляют равный обьем буфера, содержащего 10 мм трис-НС 1, рН 7,8 и далее биомассу разрушают на ультразвуковомезинтеграторе с амплитудой 18 мк в тече, ие 30 мин с 30 с паузами, охлаждая льдом. атем гомогенат центрифугируют для осажения дебриса при 100000 д 1,5 ч. В супернатанте определяют активностьНК-полимераэы, которая составляет 45 д/мг белка.2.2,Супернатант после центрифугироания наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлоой (Чк = 50 мл). Элюцию проводят , инейным градиентом (400 х 400 мл) 0,01 - ,25 М йаС в 10 мм трис-НС, рН 7,8. Собиают фракцию, выходящую при 0,15 М йаС. змеряют активность ДНК-полимераэы, алее белковую фракцию наносят на колону с фосфо-целлюлозной (Чк = 37,5 мл), уравовешенную КФ буфером (10 мм гН Р 04-КНгР 04 рН 7,0, 1 мм ЭДТА), Провоят элюцию градиентом (200 х 200/мл) 0,1 - ,6 М МаС на КФ.Собирают фракцию, выходящую при ,33 М йаС, измеряютактивность ДНК-полмеразы. Далее фракцию наносят на колону с ГАПом (гидроксилаппатит) (Ч = 9,6 мл), равновешенную КФ, и проводят элюцию радиентом(50 х 50 мл) 0,02 - 0,2 М КФ. Собиают фракцию, выходящую при 0,33 М йаС, змеряют активность ДН К-полимеразы. Даее фракцию наносят на колонку с ГАПом ( идроксилаппатит) (Чк = 9,6 мл), уравновеенную КФ, и проводят элюцию градиен(50 х 50 мл) 0,02 - 0,2 М КФ, Собирают:цию, выходящую при 0,15 М КФ, Иэмеяют активность ДНК-полимеразы, Далее ракцию диализуют в течение ночи при темературе+4 С против буфера, содержащего 0 мм КФ рН 7,0, 100 мм ИаС, 0,5 мм ЭДТА,мм ДТТ, 50 глицерол. Измеряют актив- ость фермента, которая практически не изеняется по сравнению с активностью осле очистки на ГАПе,Стадии очистки и значения активности НК-полимеразы суммированы в табл.1.З.Изучение термостабильности ДНК- олимеразы из ТЬегвцз ФеггпорЬцз КТП.Фермент прогревали в течение различого времени при температурах 92 и 95 С и измеряли его активность. Результаты приведены в табл.2.Как видно иэ табл,2, фермент сохраняетсвою активность в течение 1,5 ч при 92 С и в течение 1 ч при 950 С, что позволяет более эффективно использовать его в методе ПЦР.П р и м е р 2. Проверка температурногооптимума функционирования ДНК полимеразы из ТЬегпцв йеггпорЬцз КТП, 10 10 г биомассы ТЬеггпцв йеггпорЫцзКТП суспендируют в буфере, содержащем 25 мМ МаС, 25 мМ трис-НС, рН 7; 9,2 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,001 М ЭДТА, клетки разрушают ультразвуком при охлаждении 15 льдом, клеточные стенки осаждают центрифугированием при 160009, Из надосадочной жидкости ДНК-полимеразу очищают хроматографией на ДЕАЕ-сефарозе, фосфоцеллюлозе, оксиапатите. Тестирование фермента во фз 0 акциях проводят по включению деэокси ( Н)9 ТТФ в ДНК, "активированную" ультразвуком, в реакционной смеси (20 мкл), содержащей 0,25 о.е. ДН К, 1 мкм деэоксинуклеотидтрифосфатов, 5 пико моль ( Н)9 ТТФ, 25 мМ Трис-НС рН 8,3, 10мМ М 9 Сг, 5 мМ ДТТ и фермент. После завершения реакции кислотонерастворимый продукт переносят на фильтры, радиоактивность подсчитывают в сцинтилляционном 30 счетчике.Результаты эксперимента изложены втабл.З.Данные эксперимента показывают, чтооптимум температуры функционирования 35 ДНК-полимераэы лежит выше 70 С,Таким образом, как показано, предлагаемый штамм ТЬеггпцэ йеппорЫцэ КТП не содержит рестриктазы, что облегчает выделение и очистку ДНК-полимеразы.40 (56) 1.ЕцгВослеп. - 1985, ч,149, М 1, р.4146. 2,РЕВЯ .еи. - 1980, ч,109, М 1, р.156563. 45 З,Авторское свидетельство СССР М 1830944, кл. С 12 й 9/12. 1989.1839189 Таблица 1 Таблица 2 Таблица 3 ВКПМ В- продуцент ДНК-полизы,Формула изобретенияамм бактерий ТЬегеоз йеггпорЫ Составитель И. ПриваловаТехред М,Моргентал КТираж Г-ПО "Поиск" Роспатента3035, Москва, Ж, Раушская наб орректор Л, Филь Редактор Заказ 3404 подписное Производственно-издагельский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гага