Штамм бактерий вrеviвастеriuм iммотuм продуцент эндонуклеазы рестрикции в 1
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Номер патента: 1532584
Авторы: Галимбаева, Дегтярев, Новожилова, Речкунова, Семенченко
Текст
, аве Его г 1 цш.423-426 1 Ъасгегдцш ьшлен в результа ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ И АВТОРСКОМУ СВИ(71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ и Институт микробиологии и вирусологии АН КазССР(56) Се 11 паз К.Е., Муегв Р.А Чеяя С.А Мцггау К. КоЪегг.з К.1 1,Мо 1. В 1 о 1., 1977, 114, 433-440.йе Маазун А. апй ЭцучеяСеуп М., А гсЬ. ЖсгоЬдо 1, 1980, 128, 242-247.ЯппгЪ Н.О ЙагЪап О., 1. Мо 1- В 1,о 1., 1973, 81, 419-423.ЭцучеяСеуп М.С. С., йе Уаагй А.еяцепсе - яресНс епйопцс 1 еш а гЪегшорЬ 11 дс суапоЪасеРЕВЯ 1.ег.вбегя, 1980, 111,Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению эндонуклеазы рестрикции В 1 ш 1, изошизомера М 1 а 1,Целью изобретения является выявление штамма-продуцента, нетребовательного к питательным средам и синтезирующего эндонуклеазу рестрикции,способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов ТТССААс высоким выходом.Штамм бактерий Вгечшогцш ВКПМ Ввыде 2(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВКЕ 71 ВАСТЕК 111 М 1 ММОТЦМ - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ В 1 М 1(57) Изобретение относится к биотехнологии. Целью изобретения является выявление штамма - продуцента Вгеч 1 Ъасг.ег 1 цш дшшогцш ВКПИ В, обеспечивающего получение эндонуклеазы рестрикции Впп 1, являющейся изошизомером М 1 а 1. Штамм выделен в результате поиска штаммов - продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов, обитающих в озере Балхаш, практически не патогенен для человека, растет на дешевой доступной питательной среде. Из 1 г сырой биомассы выделяют 2500 ед. фермента с удельной активностью 10000 ед/мл. Штамм В.1 шшосцш Впродуцирует эндонуклеазу рестрикции Впп 1 и имеет сайт узнавания ТТССАА, идентичный сайту узнавания М 1 а 1. те поиска штаммов - продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов, обитающих в озере Балхаш Предлагаемыйштамм обладает следующими морфологи 1ческими, культуральными и физиологическими признаками,В молодых культурах (18-24 ч)правильные .неразветвленные палочки,длина 2-8 мкм, диаметр 0.8 мкм, Старые культуры состоят нз кокковндныхклеток. Эндоспор не образуют. Грамположительные, каталазоположительные,оксидазоотрицательные, не восстанав1532584 50 3 левают нитраты. Аэробы. Хороший рост в присутствии 4-б%-ного ИаС 1, Не обр зуют кислоту из углеводов.На рыбопептонном агаре после 48 ч нкубации при 28-30 С образуют круге с ровными краями колонии, гладкие,лестящие, плоские консистенция пастообразная.Цвет колоний желтый, Клетки обрауют пигмент типа каратиноидов.В мясопептонном бульоне образует ть.На синтетической среде с минеральщ азотом рост скудный, колонии тоечные, серовато-белые.Полученная рестриктаза Впп Т харакеризуется следующими свойствами: узает и специфически расщепляет послеовательность нуклеотидов ТТССАА; оп имальное значение рН для действия естриктазы 7,5-9,0; оптимальная темература действия 37 С; для активноти рестриктазы требуются ионы М 82, птимальная концентрация 5-15 мМ, 25Рестриктаза из Вгетл.Ъасгегдцв вогцв 19 названа Вып 1 согласно общеинятой номенклатуре Натана и Смита,Штамм также содержит рестриктазу ш 11, которая является изошизомеом Взр В. Т.Ферменты Вып 1 и Впп 11 хорошо тделяются друг от друга при хроатографии на фосфоцеллюлозе Р, то позволяет получить препараты бонх ферментов без взаимных примеей.Сравнение электрофоретической одвижности фрагментов, получаемых ри гидролизе ДНК фага Ь рестриктазой 40 ып 1 с электрофоретической подвижностью фрагментов известной длины ,(Игц 1 гидролизат ДНК фага ) позволяет определить длину фрагментов Мв 1 гидролизата. Получаемый набор врагментов совпадает с набором фрагМентов, соответствующим гидролизу ДНК фагапо последовательности ТТССАА.Таким образом, фермент Вш 1 , узнает и гидролизует пбследователь,ность нуклеотидов ТТССАА и являетсяизошизомером М 1 а 1.Дпя подтверждения последовательности узнавания рестриктазы Впв Т проводили совместный гидролиз ДНК фага Л рестриктазами Вхв 1 +Наг 1, а также Вдш 1 + ХЬц 1, Получающиеся при совместном гидролизе дополнительные фрагменты ДНК соответствуют расчетным.П р и м .е р . Клетки ВгечЬасгегдцв дввогцв, хранящиеся в 50%-ном глицерине в Т,-бульоне при -20 С высевают на чашку с Т,А.После инкубирования при 30 С клетки собирают петлей и вносят в 100 мл В и выращивают до плотности 1,5 при 30 С, Затем культуру вносят в два литра Т.В и выращивают до плотности 2,5 при 30 С в течение 12-18 ч. После охлаждения клетки собирают центрифугированием. Выход биомассы 2 г сырого веса с 1 л среды, 4 г клеток суспендируют в 20 мл 0,02 М буфера трисНС 1, рН 7,5, содержащего 10М р - меркаптоэтанол и 0,1% тритон Х, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (18000 об/мин, 30 мин при 4 С), и надосадочную жидкость наносят на 30 мл фосфоцеллюлозы Р(Жайшап), уравновешенной буфером А (0,02 М калийфосфат, рН 7,5; 0,001 М р-меркаптоэтанол, 5 10 4 И ЭЦТА), затем колонку промывают буфером А до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. Адсорбированный материал элюируют раствором 1 М ИаСТ в буфере А.50 мл полученного смыва белков с колонки диализуют ночь против 2 л буфера А и затем наносят на 10 мл ДЕАЕ-целлюлозы (ДЕ, Жагвап, Англия), уравновешенйой буфером А и элюируют 100 мл градиента 0-1,0 М ИаС 1 в буфере А. Объем каждой фракции 5 мл. Аликвоты из каждой фракции (1 мкл) инкубируют 1 ч при 37 С с 1 мкг ДНК фага 3 и анализируют в геле агарозы. Фракции (10-1 б), расщепляющие ДНК фага , объединили, диализовали 3 чпротив 2 л буфера А и наносили на 4 мл фосфоцеллюлозы Р(ЯЬасвап, Англия) и элюировали 40 мл градиентом 0-1,0 И ИаС 1 в буфере А. Объем каждой фракции 2 мл. Фракции, содержащие рестриктазную активность, определяли также как при хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе. Фракции (8,9), содержащие рестриктазу Виа 1, объединили и диализовали против буфера А, содержащего 0,1 М ИаС 1 и 50%-ный глицерин. Полученный препарат фермента (1 мл) имел удельную активность 10000 ед/мл.За единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления1532584 6культивирования биомассы составляетвсего 12-18 ч вместо 3 недель попрототипу, устойчив при хранении в. различных условиях. 1 мк ДНК фага Л в течение 1 ч при37 С.Ферментный препарат хранят при-20 С. Иэ 1 г биомассы получают2500 ед. рестриктаэы Въш 1.Полученный штамм обеспечиваетв 5 раз больший выход эндонуклеазырестрикции Вдш 1, нетребователен кпитательным средам, длительность Формула изобретенияШтамм бактерий ВгечдЪасСегцш 1 шшойиш ВКПМ В- продуцент эндо нуклеазы рестрикции Вдш 1. Составитель Н; ХодаревРедактор Т, Лаэоренко Техред Л.Сердюкова Корректор Н. Король Заказ 8070/36 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина, 101
СмотретьЗаявка
4392192, 15.03.1988
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ КОНСТРУКТОРСКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ АН КАЗССР
ДЕГТЯРЕВ СЕРГЕЙ ХАРИТОНОВИЧ, РЕЧКУНОВА НАДЕЖДА ИВАНОВНА, НОВОЖИЛОВА МАРИЯ ИВАНОВНА, СЕМЕНЧЕНКО ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА, ГАЛИМБАЕВА РАМИЛЯ ШАРИПОВНА
МПК / Метки
МПК: C12N 9/14
Метки: iммотuм, бактерий, вrеviвастеriuм, продуцент, рестрикции, штамм, эндонуклеазы
Опубликовано: 30.12.1989
Код ссылки
<a href="https://patents.su/3-1532584-shtamm-bakterijj-vrevivasterium-immotum-producent-ehndonukleazy-restrikcii-v-1.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Штамм бактерий вrеviвастеriuм iммотuм продуцент эндонуклеазы рестрикции в 1</a>