Ингибитор репарации двунитевых разрывов днк

(51) 4 С 12 И 15/00 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Институт биофизики АН СССР(56) Вгуапг Р.Е., В 13 сЬег О. ТЬе ЕЕГесгя оГ 9-В-агаЪпоГцгапояу 1 айеп 1 пеоп Ье Кераг ой ЭИА ягапйЪгеа 1 ся дпХ-дггайаСей ЕЬг 1 сЬ Аяс 1:ея ТцшогСе 11 я, 1 пг.1.НасБа. Во 1., 1982,42,4, р, 385-394.(54) ИНГИБИТОР РЕПАРАЦИИ ДВУНИТЕВЫХРАЗРЫВОВ ДНК(57) Изобретение относится к экспериментальной генетике, преимущественнок исследованиям генетически активныххимических соединений, и может бытьиспользовано при изучении характерадействия ряда мутагенных факторов окружающей среды, а также в онкологиидля усиления действия ионизируюшегоизлучения при радиотерапии опухолей.Основу изобретения составляет выявленное авторами новое свойство.кислых Ы-полипептидов (полиглутамата иполиаспартилГлутамата), ранее использовавшихся в качестве ингибиторов репарации однонитевых разрывов ДНК,полностью подавлять восстановлениедвунитевых разрывов, которые возникарют в ДНК под действием т-облучения,Вывод о полном (в пределах ошибки измерения) подавлении процесса репараЯО 1418339 А 1 ции ДР в период контакта клеток (Не 1 а и фибробластов китайского хомячка) с ингибиторами (как в ходе облучения, так и после его завершения) может быть сделан на основании данных: а) о равенстве степени деградации ДНК в опытных образцах и контроле, где восстановление ДР нацело блокировано охлаждением до 4 С сразу после окончания облучения; б) о сохранении в присутствии ПГ и ПАГ достигнутого в результате облучения уровня деградации ДНК, после завершения обработки .-лучами;в) о незначительном уровне (менее ЗЯ от контроля) включенияН-тимидина клет. ками в период их контакта с ингибиторами. Предложенные ингибиторы сами по себе не вызывают образование ДР в ДНК и практически не влияют на вивнеспособность петок; действие обоих ингибиторов обратимо. Максимальный эффект достигается при концентрациях Е ПГ и ПАГ соответственно 20 и 100 мкм (против 400 мкм для прототипа - 9-ф-арабинофуранозиладенина); время, необходимое для достижения максимального эффекта 10-15 мин (против 30-60 мин для прототипа). В отличие от известных ингибиторов восстановления ДРПГ и ПАГ не. обнаруживают токсического Ж действия по отношению к клеткам, находящимся в Я-фазе, и, следовательно .работа с ними не требует синхронизации клеточных культур и перевода их в стационарную фазу. 1 табл.ГюиаийИзобретение относится к экспериментальной генетике, преимущественно кизучению генетически активных химических соединений, и может быть использовано при исследовании характера повреждаюцнх воздействий ряда мутагенныхфакторов окружающей среды, а также конкологии для усиления действия ионизирующего излучения при радиотерапииопухолей,Основу изобретения составляет выявленное новое свойство кислых о-полипептидов (полиглутамата и полиаспартилглутамата), которые ранее использовались для подавления репарации однонитевых разрывов ДНХ, полностью ингибировать восстановление двунитевыхразрывов (ДР), возникающих в ДНК поддействием-облучения. 20В качестве модельной системы приисследовании эффекта полиглутамата(ПГ) и полиаспартилглутамата (ПАГ)используют находящиеся в логарифмической фазе роста несинхронизирозанные культуры клеток Не 1 а и Фибробластов китайского хомячка, которые подвергают воздействию-облучения (вдозе 50-100 Гр) в присутствии ингибиторов. 30Вывод о полном (в пределах ошибкиизмерения) подавлении процесса вос.".становления ДР в период контакта ин/гибиторов с клетками (как в ходе облучения, так и после его окончания)делается на основании данных о примерном равенстве степеней деградацииДНК в опытных образцах и контролегде репарация заблокирована охлаждением до 4 С, а также на основанииданных о сохранении в присутствии ПАГи ПГ, достигнутого в результате облучения уровня деградации ДНК в течение длительного времени (1 ч), Приэтом принимается во внимание, что зпериод контакта ингибиторов с клетками уровень включенияН-тимидина составил не более 3% от контрольного,Присутствие в среде инкубации ПГи ПАГ (в концентрациях, достаточныхдля полного подавления репарации) са мо по себе не вызывает образованияДР и практически не сказывается нажизнеспособности клеток. Действиеобоих ингибиторов носит обратимый характер.55Полное ингибирование процесса восстановления ДР под действием НГ и ПАГнаблюдается при концентрациях, з несколько раз меньших, чем з известномингибитаре (20 мкМ пля ПГ и 100 мкМдля НАГ против 400 мкМ в случае 9-р-арабинофуранозиладенииа); время обработки клеток предлагаемыми ипгибиторами, необходимое для получения максимального эффекта, з 2-4 раза меньше, чем при использовании известногоингибитора (10-15 мин против 3060 мин) .Кроме того, ПГ и ПАГ не проявляютизбирательной токсичности по отношению к клеткам, находящимся з Б-Фазеклеточного цикла, и, следовательно,работа с ними не требует синхронизации клеточных культур и перевода их встационарную фазу роста.П р и м е р 1. Ингибирование репарации дзунитевых разрывов ДНК в клетках Не 1 а, облученных в дозе 100 Гр,полиаспартилглутаматом. Испольэовалинесинхронизованную, находящуюся влогарифмической стадии роста, монослойную культуру дзуднезных клетокНе 1 а, которые культивировали на среде 199 с добавлением 10% сывороткикрупного рогатого скота. Сразу послепосева клеток з среду вводилиН-тимидин (0,5 мкмК/мл), за 16 ч до начала эксперимента среду с меченым тимидином слизали, клетки промывали средой 199 и инкубирозали в среде с сывороткой, В эксперименте использовалидва образца клеток,Первый образец. Клетки облучаемые при 37 С в присутствии ингибитора восстановления, промывали физраствором рН 5,0, добавляли полиаспартилглутамат (Ы-поли-П 1.-аспартилглутамат,статистический полипептид с мол.мас.1,5-3,5 тыс. дальтон) з концентрации10 мкМ з Физрастворе с рН 5,0.Через 10 мин после добавления ингибитора клетки облучали в дозе 100 Грпри мощности дозы 3,3 Гр/мин и через10 мин после окончания облучения вчасти клеток определяли степень дЕградации ДНК. Другую часть клеток отмывали средой 199 от ингибитора и культивировали на среде с сывороткойпри 37 О С з течение 4 ч, Через 1, 2,3 и 4 ч определяли степень деградацииДНК,Второй образец. Клетки, облучаемыепри 4 С, промывали физраствором с рН5,0 и температурой 4 ОС, облучали вфизрастворе з той же дозе при 4 С ичерез 10 мин псле окончания облуче"141833 г Условия обработкиклеток Уровень Уровень вклю"чения через2 ч после отвключения после обмывки клетокот ингибиторов лучения вприсутствии ингибиторов иия в части клеток определяли степень деградации Д 1 К, Другую часть клеток отмывали средой 199 и культивировали на среде с сывороткой при 37 С в течение 4 ч. Через 1, 2, 3 и 4 ч определяли степень деградации ДНК.Степень деградации ДНК во всех случаях измеряли методом элюцип с мембранных фильтров в неденатурирующих условиях с последующим определением радиоактивности в толуольно-тритоновом сцинтилляторе.ДНК, оставшаяся на Фильтре, состав" ляет, 7.: для клеток, облученных в приБ сутствии полиаспартилглутамата, при фиксации сразу после облучения 17,2+ +5,6, зафиксированных через 1, 2, 3 и 4 ч репарации 45,9+3,0; 50,4+4,2;54, 1+4, 2; 65,0 ф 3, 0 соответственно; для клеток, облученных при 4 С и заФиксированных сразу после облучения 21,5+3,0, зафиксированных через 1, 2, 3, 4 чрепарации соответственно 64 4 й 7 8; 72 8 л 3 8; 84, 1 ф 1,9 .и 86,0 й .15,6.П р и м е р 2, Ингибирование репарации двунитевых разрывов ДНК в фибробластах китайского хомячка клона 431, облу епны в дозе 100 Гр, пол лута концентрапиях, Затем вводили тимидин,облучали клетки (в дозе 70 Гр) и определяли уровень включения метки,Часть образцов отмывали от ингибиторов, затем продолжали инкубировать насреде с сывороткойН-тимидином в те-,чение 2 ч.1В таблице приведены результаты измерений. За 1007. принималось включе-.ние в клетки, инкубируемые беэ ингибиторов и соответствовало 20718 +ф 5510 имп/мин/мпн.клеток. исло опытов, из которых представлены нижесредние значения, составило 3-4. Втаблице приведен уровень включениядля нерастворимой в ТХУ фракции(уровень включения кислоторастворимой фракции меченого тимндина близокдля всех вариантов опыта), матом.Методика выращивания клеток, обработки ингибитором восстановления, облучения, отмывки и репарации разрывов,определения степени деградации ДНКаналогична описанной в примере 1.При этом концентрация полиглутаматаЫ-поли-с(-глутаииновая .кислота смол.мас. 2-15 тыс, дальтон) составляла20 мкМ/л,ДНК, оставшаяся на фильтре, состав"ляет, 7.: для клеток, облученных в присутствии ингибитора и зафиксированныхсразу после облучения, 21, 1 л 7,4 зафиксированных после отлщвки от поли 4 бглутамата и репарации в течение 1,2, З.ч 52, 9 л 5, 1; 67,2+4,0, 57,24,7соответственно, для клеток, облученных при 4 С и зафикспрованных сразуопосле облучения, 24,0 ф 5,5, зафиксированных через 1, 2, 3 ч репарации соответственно 81,5 ф 0,2; 76,9+2,8 и79,7+1, 7.П р и м е р 3. Использовали клетки китайского хомячка клона 431. Перед введениемН-тимидина клетки ин- . ббкубировали в течение 15 мин с ингибиторами в указанных в примерах 1 и 2Без ингибитора 578,5187,6 100 ИнгибиторПАГ 62,1+19,4 1,4+0,6 ИнгибиторПГ 83,2+18,5 2,9 ф 1,5 Формула изобретенияПрименение /-поли-Ь-аспартилглутамата с мол.мас. 1,5-3, 5 КД или О -поли-Ь-глутаминовой кислоты с мол.мас.2,0-1,5 КД в качестве ингибитора репарации двунитевых разрывов ДНК. Из приведенных примеров ясно, что полиглутамат (мол.мас. 2-15 тыс. даль" тон) и полиаспартилглутамат (мол.мас, 1,5-3,5 тыс. дальтон) в соответствующих концентрациях обеспечивают полное ингибирование процесса репарации ДР и обладают большей относительной эффективностью и меньшей токсичностью.