Способ определения повреждений днк в растениях

Чт.саул ГлЬл (т.п ятд:дд), подвергнутыхдействию-облучения,Экспериддеддтьд проводят ца меристематических клетках первичного корняЧт.сна 1 аЬа сч 1 дтотрсОдинаковые по величине семена замачддвантт в проточной воде в течение6-7 ч. Затем помедцант их во влажныйпесок и содержат в термостате прио,21 С. Первичные корешки отбирают нл4-5 дент после проращивания при стандартной длине 5-7 см. Облучение кобОрешков проводят от источникаСопри мощности дозы 0726 Гр/мин в дозлх 10, 15 и 20 Гр. 1 епосредственцопосле облучения верхушки корней обрезают и дттиксируют в зтанол-уксусномФикс.аторе (3:1) в течение 24 ч. Вдальнейшем корешки подвергают гид 1 толизу в 1 И 11 С 1 при 60 С в течение;11 мин, затем готовят длвленцые через покровные стекла в 45%-ной уксусной кислоте цитологические препараты.Покровцые стекла удаляют при помощи 25сухого льда, Высушенные цитологические препараты проводят через ряд спиртов уменьшающейся концентрации (96,70, 50 и 30%) и цитрлтньдй будттер (РН4,3), Затем препараты окрапдивают в 30течение 15 мин в акридиц оранже(7 10 ), приготовледдном на том же-бцитрлтцом буФере, и отмывают в цитратном буФере 3 разя тдо 5 мин.При помощи микроспектройлюориметра 35исследуют люминесцд нцию однонитевьдх.бдо 6 ы характеризующее степень денлтурации ДНК в контрольных и опытных образцах.Распределение зцачений степени кис латной денатурлции ДНК -в популяциях индивидуальных клеток контрольного и облученцых в дозе 10, 15 и 20 Гр образцов представлено на Анг,1.Как видно из Фиг. 1, значения широко варьируют в индивидуальных клетках как в контрольных (кривая 1), так и в облученных образцах (кривые 2-4). Однако в клетках, подвергнутых облучению, интервал значений ддЕ существенно отличается от интервала зцачеддий контрольных образцов н зависит от дозы облучения, Так, интервал значений Ь в контрольных клетках изменяется от 0,13 до 0;37, а придозе 10, 15 и 20 Гр - от 0,16 до0,53, от 0,27 до 0,57 и от 0,35 до0,76 соответственно,Еезультаты провепецньдх измеренийпоказывают, что наблюдаемые при воздействии радиации смещения интервалов значений в индивидуальных клетках,выявлентдые при кислотной денатурацииЛНК, характеризуют степень индуцированного облучением повреждения ДНК.Затем опредепяют среднее значение1 тд, для каждой дозы по результатамизмереция в индивидуальных клетках,Лля этого проводят измерение значенийр не менее, чем дд 200 клетках в 3-4повторных опытах. Средние эцачеция .4для каждой группы облучеццых при разных дозах клеток предстлвлецы цаФиг 2Как видно иэ фиг. 2, значение воблученных образцах растет линейно отдозы, Затем по разности для облученцых и необлученных клеток определяютстепень радиационного поврежденияЛНК - 6 ф,Средддее эцлчедддде 0 в необлученныхклетках было равно О,4 ф 0,04, а в облучецных в дозе 20 Гр клетках - 0,06++0,08, Отсюда 60 для дозы 20 Гр (т.е.степень радиациоццого поврежденияДНК при этой дозе) равняется 0,36+0, 04.Лддллогичддым образом определяют при.дощлх 1 О и 15 Гр, Среднее значение1 д для этих доз составляет 0,35+0,05и 0,45 д.0,06, л степець радиационногоповреждения ЛНК ЪМ) - О,1 1+0,О 1и 0,210,02 соответственно. Зависимость 6 от дозы облучения представлена нл Фиг, 3 и имеет линейный характер.Тлким образом, кислотная децлтурация ЛНК действительно позволяет выявить разницу между цеповреждеццой ЛНКв интактньтх клетках и ДНК, поврежденной об.ддучецдц.мП р и м е р 2, Определение репарации повреждений ЛНК в летках Чувст.аЕлЬл в разные сроки посгде облучения.Лля определения репараддии повреждений ЛНК пропорщецные клк в примерекорешки Ч, ГаЬл облучлют в дозе20 Гр прп температуре тающего льда.Часть корешков Фиксируют сразу послеоблучеция, л другун часть помещают вводу при 20 С и Фиксируют через 15,30 и 60 миц после облучения При этомкислотную деддатурлддддю ЛНЕ, последуюдпее")ЯВИ гМОСТЬ СТЕП.НИ ПОГгРЕжДЕНИЯ ЛНК (Ы, ог тремг.ц репярацги поврежДеций ,ггге:гци гослР обЛУгеНЯ, пРеД- С г ЯВЛГНг 1 Я ,ггг . 4КЯК НИНО Пз гг . гг Г.цпжаЕтСя В 3 ЯБИГ ИМОС т О О 101;Кт СТгвно СТИНос ст ггг ггг гг гг гл:г) лг "лг;ггг г 1таким Обгаз;., рнге 11 еццге в приМЕраХ КОНКрс 1 О.Г .:ЫПОЛцгЕНИя рЕЗуЛЬтатЫ СВИ 1 Е геЬС" ггг О тОМ ЧтО ПРЕД.Нагягей сцо об . йствительцо позволяЕт НЫНВгГТЬ ПО;рс;НИ 1 КК В КЛЕтКаХ И В От,ИГИЕ ОТ лнеотЦЫХ ОПРЕДЕЛИТЬ нов.гг.;, нич г 111 г, в и: пиг.И 1 уа:1 ьцых расIТГГЛгЫХ ЛГТГЯ ХП;:.г. г.,1 Н И М Е Р л. ОгПГзЕДЕЛЕЦИЕ ПОВР".ж,гллн,К Ч Кг 1 ЕТКЯХ Сг ЕРЗ.Я СЯРЛ.Ч.- 1 3.1.чСем ц Сггрср.11 аггз поеают на впе г 1 ипьтр:, в чапки 11 етри ио держат в термостате при 25 С гго проргстац,. 11 еричные кореТки отбираютлЧЕРСЯ Ч . г По Ле ЦЯЧЯЛа РОРЯЩИВЯНИЯ, ОблуЧЯЮТ;г НИЗЕ 2, Гр ОТ ИСТОЧНИКаСО при или . - ,Оз Й-,г 6 1 рин, лнолоегГТВЕЦГ 0 ОгГУР ООГГ,ГтЛЕЦ 11 Г ОТРЕи:, .,3 сгг "г" г, ггг Чхъггф Отяцол-уксусном растворе .3.1,г, КНГлгг ЧГг 1 д турапнгГ, К ГГ С Г ггГГг 1 РС ггг, г,агггггаЦИЕ 11, г 11 ОГ 1 ЧС.Кг 1 1 Я. Я ГВ и Гпределение степени дегатурацг,1, В От 71 ельнх клетках ггроОдята-.ке как описано ц г:римере 1.СредНлг. зц 4 гЕНИС Ч НлОГгЛг;Чснгг,Г: ;ЧГТКЯХрг-.НГ 0,3-+.ч, а в об.уецньх в доГр - Г 1,бб+0,117: Отсюда Гг для иР г Т Е г ГЕПС.г лп; гИОЦНОр и гг ж,гегцгг г 11 К ч Втоц гозе)р;:вцнегся 0.,3+0,05, что хордО соче - , сгся с даннььми, 1-:алучецкми на про;Ог ГКЯ", ,СГЯ ГЯЬЯ И Д;:ОНСТ ИРУЕту:".ерся;1 ьность прсллагяемого метода В О,.НГ:ггСНИ рЯ ЛИ;НЫХ раТг 1 ТЕЛЬНЬГХ 20.ормула изобретения Спс соб определения пов 1 геждениг,гг",К ., ггастег 1 ях о т л и ч О ю ц и й РМ ггТО С ПОЛЬЮ уПГгго;.Ецня 25 с;ОГГбатроростки растений выдержиВ;.;т в , ОТЯНОЛ-УКГУСНОМ фИКГ ЯтОРЕ,1.:. о.я:г их кислотному гидролизу г,. г",лигии пОВРсжДРций 11( В ипдиВи, " .";ЧЬХ К;,1 ЕТКЯХ СУДЯТ Н РГИОВЯНИИ0 0 Составитель С Техреду М.Дидык рин Ренская рект ежни едакт Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 1 О каз 3705 ТиражНИИПИ Государственного комитета113035, Москва,изо5, Р Подписноетениям и открытиям при ГКНТ СССРская наб д. 4/5