Штамм культивируемых клеток почки мини-свиньи, используемый в качестве тест-системы для репродукции и изучения вируса гриппа

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ 09) (11 СПУБЛИ Б 5 00 ОБРЕТ ИЯ ПИСА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (72) А,А. Царева, А.А. Исаенко, Ю.А. Юрченко, С.И. Машукова и Е.В. Дмитриева(56) Тихонов В.Н Панарина Л,М. Некоторые генетические особенности первых отечественных мини-свиней минисибс. - Генетика, 1981, т. 17, У 5, с, 883-895.Куликова К.С. и др. Тезисы докладов на 2-й научной конференции МНИИВП, М.: 1960, с.57.(54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ . МИНИ-СВИНЬИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ РЕПРОДУКЦИИ И ИЗУЧЕНИЯ ВИРУСА ГРИППА(57) Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированиюклеток и тканей с целью наработки иизучения вирусов. Целью изобретенияявляется получение перевиваемой линии клеток лабораторной мини-свиньи,свободной от контаминантов, обеспечивающей репродукцию вируса гриппа ислужащей сингенной системой при экспериментальных исследованиях. Пинияклеток ПСМ получена из почки двухнедельного мини-поросенка пассированиемна среде Игла МЕМ, содержащей 107сыворотки крупного рогатого скотаПосле 60-го пассажа кариотип стабилизируется, модельный класс состав- Жляют клетки с 60 хромосомами. Клеткилинии ПСМ чувствительны к различным М Рштаммам вируса гриппа. Штамм хранится в коллекции перевиваемых культурВНИИ молекулярной экспериментальной фветеринарии под У 20. 1 табл, 430403Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью наработки и изучения вирусов.Цель изобретения - получение оте 5 чественной стабильной перевиваемой линии клеток лабораторной мини-сниньи свободной от контаминантов, культивируемой на доступных питательных средах, обеспечивающей репродукцию вируса гриппа и служащей сингенной системой при экспериментальных.исследованиях, проводимых с использованием мини-свиней. 15Линия перевиваемых клеток почки мини-сниньи ПСМ депон,1 рована в Коллекции перениваемых соматических клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Всесоюзь,1 го НИИ 20 экспериментальной ветерин рии ВАСХНИЛ, штамму присвоен коллекционный У 20.Линию клеток ПСМ получают следующим образом. 25В качестве исходной ткани используют почку двухнедельного мини-поросенка.Почку извлекают с соблюдением правил антисептики,помещают в стерильную чашку Петри с раствором Эрла, 30 содержащим антибиотики - пенициллин (калиевая соль) и стрептомицин по 1000 мкг/мл, стараясь не повредить почечную артерию и вену, Изолированную почку переносят н чашку Петри, не повреждая капсулы отпрепарируют от жирового сальника. В артерию через эатупленную иглу нагнетают раствор Хенкса, содержащий 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептамицина 40 для промывания органа, Затем поЧку промывают 0,257-ным раствором трипсиона при 37 С в течение 30 мин да появления под капсулой сети трещин, Почку переносят в чистую чашку Петри, оснобождают от капсулы, отделяют корконый слой, механически измельчают и дезагрегируют в питательной среде на магнитной мешалке. Клеточную суспенэию без предварительного центрифу 50 гиронания фильтруют через 8-слойную марлевую салфетку, разбавляют до концентрации 400 тыс. кл. вмл средой Игла МЕМ, содержащей 1 ОЕ сыворотки крупного рогатого скота, предварительно обработанной полиэтиленгликолем (м,в. 6000) 0,6 г/л глютамина, 100 мкг/мл канамицина, высевают в чашки Карреля и помещают в термастат апри 32 С для предотвращения разрастания фибробластов, Каждые 3-4 сут.проводят частичное на 1/5-/3 обновление среды. Первый пересев делаютчерез 10, второй через 8, третийчерез 6 сут. Ввиду увеличения скорости роста к пятому пассажу клеткипересевают через 3-4 сут. Коэффициентрассева 1/3, В дальнейшем клетки культивируют в монослое с применениемсреды Игла МЕМ, содержащей 107. сывороткикрупного рогатого скота,нативной илиобработанной полиэтиленгликолем.Клетки снимают со стекла смесью 0,027-ного версена (1/2-2/3) и 0,257-ногораствора трипсина (1/2-1/3) беэ центрифугирования, дважды обмыв монослой прогретой до 36,5 С смесью ипроинкубировав в течение 5-10 мин.Далее клетки ресуспендируют в свежей среде и рассевают в сосуды длякультивирования с концентрацией100 тыс. кл. в 1 мл. Пересевы осуществляют через 3-5 сут с кратностьюрассева 1:4-1:5,Полученная линия перевинаемых клеток ПСМ имеет следующие морфологические признаки,Культура представлена эпителиоподабными клетками с округлыми и овальными ядрами, имеющими от 1 до 4 ядрышек. Цитоплазма мелкозернистая,слабо накуолизированная. Границыклеток в монослое четко различимы.По данным электроннамикроскопического анализа, изучение в люминесцентном микроскопе препаратов, окрашенных ДНК-флюорохромами, высева на селективных средах, гемадсорбцией сэритроцитами морской свинки, клеткисвободны от вирусной, микаплаэменной, грибканой и бактериальной контаминации.Модельный класс составляют клеткис 60 хромосомами. Анализ кариотипас помощью 0-метода дифференциальногоакрашивания показал, что кариотип кле.ток в линии является н основном трисомным, Произошло слияние 15 и 7(9:17), выявляется хромосома, являющаяся результатом слияния двух гомологов 18 хромосомы 1 (18),: Хромосома 1 (9; 17) может считаться маркерной для клеток линии ПСМ. Приокрашивании азотнокислым серебром выявлено, что числа хромосом, несущихЯО районы, варьирует от 1 до1430403 Клетки линии ПСМ чувствительны к различным штаммам вируса гриппа. Уровень накопления вирусов определяют на третьи сутки после заражения клеток линии ПСМ путем титрования на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) по ЭИДд /мл. Линия перевиваемых клеток ПСМ может быть использована в вирусолоГнческих исследованиях для репродукции и изучения вируса гриппа, а также как сингенная система при экспериментальных исследованиях с лабораторными мини-свиньями. Формула изобретения Штамм культивируемых клеток почки мини-свиньи ВСКК (СХЖ) В 20, используемый в качестве тест-системы для репродукции н изучения вируса гриппа. Культураклеток Штаммы вируса гриппа А/Адски/2/68 А/ВапЕоХ А/Ленинград ННЗИ 2 2/79 385/80НЗИ 2 А/МеуЪгЫде Н 71174,25 4,5 5,0 4,75 ПСМ 5,25 4,0 5,0 СПЭВ Кожномышечные клеткиэмбрионачеловека 3,75 3,75 3,5 2,75 Составитель И. Тареева Редактор Н. Киштулинец Техред А. КравчукКорректор С. Шекмар Заказ 5302/23 Тираж 520 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий1 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Клетки линии ПСМ хранят в замороженном состоянии в жидком азоте прио-196 С. Режим замораживания: снятые со стекла смесью версена и трип 5 сина и ресуспендированные в свежей среде клетки центрифугируют и ресуспендируют в новой порции ростовой среды, содержащей 103 сыворотки КРС до концентрации 3,3-6,5 млн.кл в 1 мл.1 р Затем медленно, при постоянном перемешивании добавляют глицерин до конечной концентрации 103 от общего объема, Суспензию клеток разливают по ампулам и эамораживают в смеси спир та и жидкого азота при понижении темо о пературы на 1 С в 1 мин до -40 С с последующим погружением в хранилище биопродуктов.Режим восстановления. Ампулы с 20 клетками после извлечения иэ жидкого азота помещают в водяную баню сотемпературой 38 С. Суспенэию размороженных клеток переносят в колбу и порциями, постоянно перемешивая, с ин тервалом в 1-2 мин добавляют ростовую среду: 0,5; 0,5 1 2; 2 и 3 мл, затем суспензию центрифугируют и ресуспендируют в свежей ростовой среде, подсчитывают общее количество клеток 30 и процент жизнеспособных и разводят ростовой средой до концентрации жизнеспособных клеток 100 тыс. кл/мл. В таблице даны результаты репродукции различных штаммов вируса гриппа на перевиваемых культурах клеток.Из данных таблицы следует, что клетки линии ПСМ обладают примерно одинаковой чувствительностью к вирусу гриппа в сравнении с клетками линии СПЭВ и значительно превосходят линию кожно-мышечных клеток эмбриона человека.