Способ получения изоцитратдегидрогеназы

(ю 4 С 1 4//(СС 12 к 140) ЕТ СССРОТКРЫТИЙ ИСАНИЕ ИЗОБРЕТТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(57) Изобрнологии. Сса осущест ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИ(72) Шепп Вульфи Груно Марлис(53) 577.15(08 Б ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЦИТРАТДЕПЩ- тение относится к биотехцелью удешевления процесляют культивирование продуцента штамма Рзецс 1 ошопаз рийддаАТСС 17633 на питательной среде домаксимальной активности, отделениеклетбк, получение бесклеточного экстракта, фракционирование сульфатомаммония до 40-50 Ж насьицения, Хроматографическую очистку полученного экстракта ведут на 10-карбоксидецилсеа"розе, Способ предусматривает использование в качестве источника углерода веществ, у которых в процессе окисления образуются ацетоацетаты, которые при регулируемом снабжении кислородом потребляют НАДН и тем самымрегенерируют НАД , Активность фермента в грубом экстракте 1-3 ИЕ/мг, после очистки достигает 50 ИЕ/мг 1 з.п.ф-лы, 2 табл.Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения изоцитратдегидрогеназы, которая находит применение в клинико-химической диаг 5 ностике и в анализе продуктов питания для количественного определения изоцитрата.Известен способ получения изоцит" ратдегидрогеназы из ЕясЬег 1 сЬ 1 а со 1, 10 предусматривающий культивирование продуцента на питательной среде с последующими выделением и многостадий" ной хроматографической очисткой целевого продукта. На иммобилизованном текстильном красителе С 1 Ьасгоп В 1 це РЗС-А. Активность целевого продукта до 1,2 ИЕ/мг белка(Иаядцсг В, Кеечея Н.С, ВхосЬеш В 1 орЬуя. АсСа, ч. 578, р. 31-40, 1979).Недостатки известного способа - многостадийность хроматографической очистки и использование патогенного 20.,продуцента.Цель изобретения - удешевление про-,5цесса.Поставленная цель достигается использованием в качестве продуценташтамма Ряецйошопая рцгЫа АТСС 17633,ранее известного как продуцент 3-гидроксибутиратдегидрогеназы (хозяйст венный патент ГДР Р 149874,-кл, С 12 И 9/04, 1980),Культивирование штамма осуществляют преимущественно на 2 Х-ном агао 35ре при 4 С в темноте и использованиив качестве источника углерода декана и сульфата аммония в качествеисточника азота.Культивирование Ряецйотпопая рцэр.Ыа 40АТСС 17633 осуществляют после заражения посевной культурой нри температуре 20-40 С (преимущественно при 30 С)в субмерсионной культуре на жидкойминимальной среде. 45Выращивание проводят в условияхтакого газового состава воздуха, при.котором образование иэоцитратдегидрогеназы не подавляется избытком внутриклеточного НАДН. Так как это характерно как в случае начального роста,так и при достижении стационарнойфазы, активность Фермента показываетострый максимум, который достигаетсяв конце логарифмической фазы роста.Такое развитие имеет место при применении всех источников углерода, которые штамм в состоянии использовать,Абсолютные значения, которые могут быть достигнуты в максимуме для активности фермента, находятся в зависимости как от газовых условий, таки от источника углерода, Особенноприемлемыми являются такие вещества,у которых в процессе окисления возникает большое число таких промежуточ"ных продуктов, как ацетоацетат, которые при ограниченном снабжении кислородом в их дальнейших реакциях потребляют НЛДН и тем самым регенериру+ют НАД . Пример таких веществ представлен в табл, 1.Культивирование проводят на косомагаре, причем источники углеродадобавляют в концентрации по 0,57, каждый. После инкубации 24 ч при 30 Сбактерии смывают, Активность определяют после замораживания-оттаиванияклеток в присутствии 0,17 тритонаХ 100.Специфическая активность изоцитратдегидрогеназы в грубом экстрактеиз Ряецботпопая рцгЫа АТСС 17633 по-сле роста на различных источникахуглерода приведена н табл, 1,В качестве источников азота используют БЬС 1, (ИН)БО и т.п.По истечении времени роста 5-40 ч в зависимостй от физиологического состояния и количества заражаемого материала бактерии собирают центриФугированием, промывают Фосфатным буфером с получением бесклеточногоэкстракта.Содержащийся в бесклеточном грубом экстракте Фермент показывает в зависимости от источника углерода представленные в табл. 1 специфические активности. Речь идет при этом об эмерсионном культивировании на 2 Ж-ном агаре, При субмерсионных условиях культивирования такие значения активности достигаются после соответствующего оптимирования газового состава и скорости перемешивания в зависимости от конструкционных параметров Ферментационного сосуда. Особенно хорошие результаты достигались тогда, когда культивирование проводилось при применении углеводородов в качестве источников углерода, которые подводились к Ферментационному сосуду в газообразном состоянии. Из бесклеточного грубогс белкового экстракта изоцитратдегидрогеназу выделяют Фракционированным осаждением солями или экстракцией сульфатом аммония 5 141833810 раз. Для этого к грубому белковому экстракту добавляется твердый сульфат аммония до конечной концентрации в 70% насьпцения, причем вся активность переходит в осадок. Для дальнешпего обогашения изоцитратдегидрогеназы остаток перемешивается каждые 5 мин с раствором сульфата аммония, содержащего 0,05 моль/л МЯНРО,Е при 0 Со, и снижающихся концентрациях сульфата аммония. Фермент растворяется при этом в возрястаюшей степени. Основное количество растворяется при этом в промежутке концентраций сульфата аммония между 40 и 50 насыщения, Фермент снова осаждают добавлением сульфата аммония до конечной ко.цент- рации в 70 .Предлагаемый Фермент хорошо сохраняется. При специфической активности 5-10 ммоль/мин/мг белка установлено не более следующих чужеродных активностеи: алкоголь-, малат- и лактатдегидрогеназы, каждая менее 1%. Изоцитратдегидрогеназа чрп применении гидрофобной хроматографии на 10-карбоксидецилсефарозе может бь 1 ть обогащена до специфической активности в 50 ИЕ/мг.П р и м е р. Культивирование Ряецс 1 ошопая рцсЫЯ ЬТСС 17633 проводят в среде, содержа 1 цей на 1 л следующис ингредиенты: КНРО7,46 г/л; ИЯНР 04 0,54 г/л; М 8804 7 Н 10 20 мг; СЯС 1 2 2 НО 20 мг; Ре (КН Е) (БО 4) П 6 НО 10 мг.В качестве источника азота служит (11 Н 4) 180,. - 1 г/л.ДЛЯ ЭМЕРСИ 01 НОГО КУПЬТВИРОВЯЕня штамма в пробирке с косым 2 -ным агаром (Дифко-агар) агар готовят на основе описанной среды, В пробику вносят 6 мл раствора агаря. Затвердеваеие агара осуществляют в максимально возможном горизонтальном положенил пробирок. Для поддержания штамма пробирки после пересева на поверхность с помощью петли ставят вертикально, Затем добавляют 0,1 мл декана, причем поверхность геля только в основании сосуда приходит в соприкосновение с источником углерода.После инкубации при 25 С в течение приблизительно 60 ч бактерии смывают с поверхности агяра 2 мл 0,05 Ы Фосфатного буфера рН 7,5 (Е , см 2,5) и применяют для заражения субмерсионной культурь, Плотность посевного матерна.Я Е,см:0,65, При " .1 ьтивировянии ня углеводородах еяпример няГексане источик углеродя подаютчерез газовую среду. В 10-литровомФерментативном сосуде с наполнениемдо 7 л поступление газовой смеси (210 л/ч) осуществляют через содержаощую гексан промывную склянку при 30 С.10Среднее поступление гексана в ферментационньп сосуд при этих услоьияхсоставляет сколо 5-10 мл/ч. Культуряльная среда интенсивно перемешивается (800 об/мин), После культивирования в гечение 25 т при 30"Сцмутность сред: составляет после этого Е см - 2-4, бакгерии собираютпосредством центрифугировянпя, промь 1 вают Фосфятным буфером 0,05 и/лрН 7,5 и разрушают с гомощью ультразвука при - С. Бесклеточньп грубыйэкстгякт полу. тают центрифуг:рованием.Специфическая активность изоцитратдегндрогенязы прп этих условиях достигает значе;пй 2 ИЕ/мг. Этот белковыйгрубый экстракт разводят 0,05 м/л фосфатным буфером рП 8 до достижениясодержания белка 20 мг/мл. Из этогораствора при 4 С путем добавлениясульфата аммония до конечной концентрацпи в 70% насьпцения Осаждают основную часть бенка,Общая активность изоцитратдегидрогеназы находится в осадке, После .центрифугпрования осадок суспенди"5 о"5 руют при 0 С в растворе сульфата аммония (40 . насьещения) в 0,05 М МЯНРОи центрифугируют, После повторенияпроцедурь 1 свыше 80 . Общей активности40изоцитратдегидрогеназы находится всупернатанте (табл, 2).Результать 1 обо Яп;ения изоцитратдегидрогеназы из Ряец 1 оепопая рц 1 йапосредством зкстрякции сульфатом аммония, приведены в табл. 2,45Фермент снова осаждают путем добавления сульфата аммония до конечной концентрации в 70% насыщ,ния.Полученный посредством экстракции50сульФата акония сулернатант (супер;натант 2) в количестве 15 мл с содержанием белка в 130 мг наносятна колонку, содержащую 80 мл 10-карбоксидецилсефарозы и элюйруют прил55.22"С 200 мл раствора сульфата аммония (насьпцение в 40 ) . Получаютизоцитратдегидрогеназу, обогащеннуюдо специфической активности в 50 .ИЕ/мг.1418338 формула и з о б р е т ения Таблица Оптическая Активность плотность, фермента, . Е о ммоль/мин/мг Источник углерода 1. Способ получения изоцитратдегидрогеназы,предусматривающий аэробное культивирование продуцента при оптимальной температуре для биосинтеза фермента на питательной среде, содержащей источники углерода, факторы роста и минеральные соли, до максималь ного накопления активности, отделение клеток; приготовление бесклеточного экстракта, фракционирование сульфатом аммония и последующую хроматографи" ческую очистку полученного белкового 15 экстракта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью удешевления процес" са, в качестве продуцента используют штамм Рзеийошопаз риТЫа АТСС 17633, фракционирование сульфатом аммония 20 ведут до насыщения 40-507., а хроматографическую очистку осуществляют на 10-карбоксидецилсефарозе.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что в качестве ис точника углерода используют цитрат, изоцитрат, о-кетоглутарат, фумарат, сукцинат, пируват, О, 1 -малат, лейцин, глутарат, гексан или декан. 0,8 ЦитратИэоцитрат 1,2 1,0 0,7 б/-Кетоглутарат 3,0 1,5 ФумаратСукцинатЦируват 0,7 3,4 1,4 О,-малат 1,9 1,4 1,5 Лейцин 2,9 3,0 Глутарат Гексан 1,4 2,0 1,5 Декан Та блица 2 Исходный материал Общий бе лок, мг Общая активностьммоль//мин/мг Грубый экстрактили осадок (70 Жнасыщения) 5800 6060 1,04 СупернатантЗаказ 4127/27 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5