Способ выделения моноаминоксидазы

(19) О) 4(5 С 12 Я 9 00 ЗОБРЕТЕНИЯ 1979, ч. 9,ГООУДАРСТВЕННЬЙ НОМИТЕТ ССОРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЮ ОПИСАНИЕН АВТОРСКОМУ СИИФТВЪСТ(71) Институт биологическойдицинской химии АИН СССР(54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ИОНОАИИНОКСИДАЗЫ из мозга бьща путем солюбилизации митохондрий неионным детергентом и аффинной хроматографии, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, солюбилизацию проводят в 0,01-0,05 И фосфатном буфере рН 7,2-7,6 с последующей бноспецифической хроматографией "в объеме".1 1165Изобретение относится к биохимиии медицине, а именно к способам выделения высокоочнщенных ферментныхпрепаратов, конкретно к способамвыцеления фермента моноаминоксидазы (МАО) из объектов животного происхождения, и может быть использовано в научных целях, применяться влабораторной и медицинской практике.Цель изобретения - упрощение процесса и увеличение выхода целевогопродукта.Пример 1. 500 г мозга быкапромывают 0,9 . КС 1 и гомогенизируютв течение 1 мин при 3000 об/мин 15(гомогеннзатор РТ) с 4500 мл0,25 И сахарозы, к которой добавляют90 мл 1 И К,НРО до рН 7,2, Полученныйгомогенат центрифугируют при 1500 ев течение 10 мин на центрифуге ЦЛР20Надосадочную жидкость (3350 мл) центрифугируют в течение 10 мин при1300 я на центрифуге ЦЛР для осаждения митохондрий. Осадок, полученный после центрифугирования при 251500 я втечение 10 мин, промывают2250 мл 0,25 М сахарозы, рН 7,2, ипромывные воды центрифугируют при13000 я в течение 10 мин. Полученныеосадки митохондрий объединяют, сус- З 0пендируют в 450 мл бидистиллированной воды и центрифугируют в течение40 мин при 26000 8 на центрифугеЦВР. Полученный осадок, содержащиймембраны митохондрий, промывают двараза 0,01 И фосфатным буфером, рН72, для удаления белков митохондрнального матрикса и суспендируютв минимальном объеме того же буфера,В полученной суспензия определяют 40содержание белка при помощи калориметрического метода Лоури,Суспензию, содержавшую 18,4 мг/млбелка в объеме 210 мп, центрифугируют 30 мин при 34000 8 на центрифуге ЦВР Полученную надосадочнуюжидкость отбрасывают, а к 130 млосадка добавляют 257 мл 0,01 М Фосфатного буфера рН 7,2, содержавшего18,8 мп 253-ного водного раствора 1 50детергента тритон х. При перемешнвании на холоду (О) полученную.смесь выдерживают 30 мин, а затемцентрифугируют при 40000 я в течение 1 ч. Полученную надосадочнуюжидкость концентрируют методомультрафильтрации через фильтр Амнкок. РМдо 34 мл. Всего получе 7142 но 456 г солюбиэированного материала, который на воронке со стеклянными фильтрами диаметром 9,6 см обрабатывают 188 мл адсорбента АН-Сефарозы, уравновешенного 0,01 М Фосфатным буфером, рН 7,2, Адсорбент промывают 600 мл этого же буФера, а препарат МАОэлюируют 0,1 М фосфатным буфером рН 7,2, собирая фракции по 30 мл. Те фракции, которые содержат белок (общий объем 175 мл), концентрируют в течение 18 ч при помощи Сефадекса Г(сверхтонкий), а затем путем ультраФикации через фильтр Амикон РМдо объема 30 мл. Препараты МАО-Па элюируют как описано 0,1 М фосфатным буфером, содержавшим 0,09% тритонх; ИАО-Пб - указанным буфе" ром, содержавшим 0,25 тритон х. Регенерацию АН-Сефарозы осуществляют промывкой 0,4 М фосфатным буфером, содержавшим 1% тритон Хи 0,6 М ИаС 1, а затем 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2.П р н м е р 2, 500 г мозга быка промывают 0,9 КС 1 и гомогенизируют в течение 1 мин при 8000 об,/мин (гомогениэатор РТ) с 4500 мп 0,25 М сахарозы, к которой добавляют 90 мл 1 И К, НРО до рН 7,6. Полученный гомогенат центрифугируют прн 1500 8 в течение 10 мин на центрифуге ЦЛР. Надосадочную жидкость (3350 мл) центрнфугируют в течение 10 мин при 1300 я на центрифуге ЦЛР для осаждений митохондрий, Осадок полученный после центрифугировання при 1500 е в течение 10 мин, промывают 2250 мл 0,25 М сахарозы, рН 7,6,промывные воды центрифугируют при 13000 а в течение 10 мин, Полученные осадки митохондрий объединяют, суспензнруют в 450 мп бидистиллнрованной воды и центрифугируют, в течение 40 мин при 26000 я на центрифуге ЦВР. Полученный осадок, содержащий мембраны митохондрий, промывают два раза 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6, для удаления белков митохондриального матрикса и суспензируют в минимальном объеме того же буФера. В полученной суспензии определяют содержание белка при помощи калориметрического метода Лоури.Суспензию, содержавшую 20,5 мг/мп белка в объеме 188 мл, центрифугируют 30 мин при 34000 я на центрифу1165 Составитель Н, ЗемлякТехред О,Неце Корректор В, Гнрняк Редактор В. Данко Заказ 4285/24 Тираж 525 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035. Москва, ЖРаушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г. ужгород, ул. Проектная, 4 зге ЦВР. Полученную надосадочную жидкость отбрасывают, а к 130 мл осадка добавляли 257 мп 0,01 М фосфатного буфера рН 7,6, содержавшего 18,8 мп 257;ного водного раствора детергента тритон х. При помешивании на холоду (О) полученную смесь выдерживают 30 мин, а затем центрифугировали при 40000 я в течение 1 ч. Полученную надосадочную жидкость кон центрируют методом ультафильтрации . через фильтр Амикон РМдо 34 мп. Всего получено 464 мг солюбизированного материала, который на воронке со стеклянным фильтром диаметром 1 9,6 см обрабатывают 191 мл адсорбента АН-Сефарозы, уравновешенного 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6. Адсорбент промывают 600 мл этого же буфера, а препарат ХАОэлюируют 714 40,1 М фосфатным буфером рН 7,6, собирая фракции по 30 мп. Те фракции, которые содержат белок (общий объем 170 мл), концентрируют в течение 18 ч при помощи Сефадекса Г(сверхтонкий), а затем путем аультрафильтрации через фильтр Амикон РМдо объема 30 мп. Препараты МАО-Па элюируют таким же образом 0,1 М фосфатным буфером, содержавшим 0,093 тритон х;. МАО-Нб - тем же буфером, содержавшим О, 143 тритон х, а МАО- 0,4 М фосфатным буфером, содержавшим 0,253 тритон х. Регенерацию АН-Сефарозы осуществляют промывкой 0 4 М фосфатным буфером, содержавшим 1 Х тритон хи 0,6 М аС, а затем 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6.