Способ выделения протеина

Союз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет7712518 .7810769 Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытий(53) УДК 547. 964. .4.07(088.8) Дата опубликования описания 301130 ИностранцыШарль Дюлу, Андре Пейрузе, Рене Панари,Клод Аннун и Жан Весан(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОТЕИНА Изобретение относится к способу выделения протеинов с различными молекулярными массами, с использованием хроматографии, который может найти применение в микробиологии для выделения и очистки вирусов.Разделительная хроматография широко используется для очистки и разделения организованных фракций бактериальных или вирусных тел, макро- молекул 1, 2Высокой чистоты протеины-вирусы получены при использовании хроматографии на эластичных гелях, например шариках агара 11. Однако этот носитель имеет существенные недостатки; низкую механическую прочность, не выдерживает стерилизации нагреванием, что ограничивает его применение для разделенияпродуктов, которые должны быть сохранены стерильными,Наиболее близким к описываемомуявляется способ разделения протеинахроматографией на силикагеле 21;силикагель промывают водой, 1-нымводным раствором карбовакса 20 Мпри 90 С, при последующей промывкетемпературу снижают до 9 оС. Затемколонку вновь промывают водой и буфером (рН5,5-7,6), разделение проводят при низкой температуре (9 С),одезактивация силикагеля карбоваксом20 М предотвращает адсорбцию протеинов, разделение их осуществляют засчет градиента концентрации соли вэлюирующем буфере и изменения рНи при приложении повышенного давления (несколько десятков бар).Недостаток способа состоит в том,что протеины могут быть разделенытолько под действием сильных давлений. Кроме того, способ применим15 только к аналитически чистым протеинам невысокой молекулярной массы(25 000 - 800 000): лизоцим, альбумин,каталаза, тироглобулин, цитохром С.Споссб неприменим к протеинам с вы 20 сскими молекулярными массами (вышемиллиона), с чем встречаются привыделении и очистке вирусов гриппа,средние молекулярные массы которыхвыше нескольких миллионов.25 Цель предлагаемого изобретения -способ выделения протеинов с высокими молекулярными массами и упрощение процесса,Поставленная цель достигаетсяописываемым способом выделения протеина из водной среды путем разделительной хроматографии на твердомносителе, предварительно лассивированном водным раствором полимера иэлюированием протеина буферным раствором с рн 5,5-7,6, заключающийся втом что в качестве твердого носителя используют силикагель или силикат щелочного металла с частицамиразмером от 40 до 200 мкм, порамидиаметром от 5 до 200 нм, носительпосле первичной пассивации воднымраствором полимера с молекулярноймассой от 5000 до 30000, пассивируютповторно 0,2-20-ым водным раствором протеина с молекулярной массойменьше молекулярной массы выделяемого протеина.Предпочтительными вариатамиспособа являются использоваие в качестве полимера для первичной пассинации полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона или полипропиленгликоля,В качестве протеина для повторногопассивирования протеины с молекулярным весом меньше 100000 - альбумижелатин, пептон или продукты разло. -жения полипептидов, Нспользованиебуферного раствора с добавкой антисептика в количестве от 0,1 до 10 г,представляющего собой дихлормета,дибромметан, дийодметан, 1,2-дихлорэтан, дибром,2-этан или трихлорэтил"н, Нспользоваие в качествевыделяемого пептида вируса.П р и м е р 1. Подготовка колонны. Колонну с внутренним диаметром10 см и высотой 120 см заполняютпорошком силикагеля "Сферозил ХовФ030" (Рон-Пуленк) в виде частиц размером 100-200 мкм, со средним диаметром пор 60 нм и удельной поверхностью 50 м /г, объем пор аполните 2ля 1 мл/г, После стерилизации паром,помещенный в колонну гель предва -рительно пассивируют, т,е. обрабатывают водным 1.-ым раствором полизтиленгликоля молекулярой массы20 000 в течение 24 ч для блокировки его адсорбциооспособных участков. Затем в колонну загружают500 мл не содержащей гриппозный вирус алантоисной жидкости, с помощьюкоторой проводится повторная пас:ивация.Циркуляцию раствора через колоннуосуществляют при незначительном повышении давления на входе в колонну (примерно 1 бар.),Иэ 450 мл вирусного раствора зрезультате его хроматографическоиочистки получают 1050 мл элюата, содержащего вирус ьысокой степени чистоты.На чертеже представлена хроматографическая кривая выделения вирусагриппа штамма А/х 53 иэ его алантоисной питательной среды, по оси ординат отложены оптические плотности 5 1 О 15 2 О 35 40 45 5 О 55 60 65 злюата, по оси абсцисс - объемы злюата. Чистому вирусу соответствуетпик Ч, примесям соответствует пик 1,прерывистость пика 1 вызвана изменением расхода элюата с 9 до 27 л/ч,При работе с аналитической хроматографической колонкой (диаметр 0,8 см,высота 120 см), заполненной такойже двуокисью кремния, как указансвьше, получают раствор чистого вируса, не содержащий примесей (1050 мл).Баланс составляют путем определения активности вируса в растворепо методу гемагглютинации (ГА). Установлено, что в 450 мл исходногоалантоисного раствора активность составляет 1200 единиц ГА/0,25 мл. Активность раствора вируса после хроматографической очистки - 480 единицГА/0,25 мл. Объем элюата - 1050 мл,Таким образом, активность в исходном растворе 2160000 единиц ГА, активность в очищенном растворе вируса 2016000 единиц ГА, Следовательно,выход: (2016000:2160000)х 100 = 93,8.Этот выход намного выше выхода,получаемого при использовании известного метода очистки,За этой двойной пассивацией следует промывка водным стерильным буферным раствором первичного фосфатакалия и вторичного фосфата натрияс рН 7,5, содержащим )аС) в концентрации 0,15 М,П р и м е р 2. Выделение вирусагриппа штамма А/х 53 из его алантоисой питательной среды. Раствор вируса из классической культуры в алантоисной полости куриного эмбрионального яйца, после инкубации в течение 10- 12 дней содержит 1 200 единиц ГА (метод гемагглютинации) на0,25 мл.450 мл этого раствора вводят вколонну, скорость пропускания раствора 150 мл/мин. В течение этого времени через колонну постоянно пропускают буферный раствор со скоростью9 л/ч до появления одного вируса навыходе из колонны (30 мин), Скоростьподачи буфера утраивают (до 27 л/ч),что позволяет провести весь процессза 1 ч,Колонна, снабженная автоматическим устройством, функционирует безперерыва в течение всего необходимого для проведения процесса времени.,Определение составляющих элюатана выходе из колонны осуществляют иооптической плотности в ультра-фиолетовой области при длине волны 252 нм,П р и м е р 3, Выделение гриппозкого вируса двойным способом адсорбции - элюирования на зритроцитах споследующей очисткои путем хроматографии на силикагеле.5.0 л вирусных алантоисных жидкостей, происходящих из эмбриональныхкуриых яиц, 10- 12 дневных, предва 784784Полученный таким образом раствор центрифугируют для удаления нерастворимой части и верхнюю прозрачную жидкость (около 500 мл) собирают.Выход этой операции концентрирования-очистки найден близким к 65,500 мл этого концентрированного раствора хроматографируют в колонне с внутренним диаметром 10 см и высотой 120 см снабженной такой же двуокисью кремния, что и в примере 1, и используют такой же буферный раствор. 500 мл вводят как описано в примере 2. Вирус собирают элюированием в 1500 мл раствора, титр которого 556065 рительно осветляют центрифугированием, для удаления нерастворимых веществ, Надосадочная жидкость имеет 1200 единиц ГА в 0,25 мл.К полученной жидкости добавляют 4 об. осадка куриных эритроцитов. Через 8-16 ч при температуре +4 Соили +37 С, эритроциты отделяют центрифугированием со скоростью 3 000 об/ мин и вирус элюируют фосфатным бу-Фером в объеме 5 л, Элюат имеет гемагглютинатный титр 12000 единиц ГА в 0,25 мл. 450 мл этой вирусной суспензии автоматически вводят в колон-ну, в течение 3 мин (с расходом 150 мл/мин), В течение этого времени непрерывно пропускают через ко лонну описанный в примере буферный раствор(расход этого раствора 9 л/ч) до появления только одного вируса на выходе из колонны. Расход утраивают (27 л/ч), когда в элюате не обнаруживают более вируса, элюат при этом содержит загрязненные протеины. Каждая операция длится 1 ч. Благодаря своему автоматическому устройству, колонна функционирует непрерыв но, при этом расходуется 5 л элюата.Фракции, соответствующие очищенным вирусам, собирают, получают 15 л. Титр этого раствора в гемагглютинатных единицах составляет 32 00 единиц ГА на 0,25 мл, что означает выход порядка 100.П р и м е р 4. Исходя из 10 л раствора алантоисной жидкости, заряженной гриппозным вирусом, подобного описанному в примере 2, осуществляют в первой стадии концентрирование-очистку на полимерном комплексе кальция. Для этого к раствору добавляют водный 2-ный (вес.) раствор полиэтиленгликоля молекулярной мас сы 20 000 и 12 г СаС 62 в виде порошка, Смесь гомогенизируют в течение 30 мин, осадок отделяют декантацией с последующим центрифугированием, осадок обрабатывают примерно 500 мл водного 0,2 М раствора динатриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты, рН которого доведен до 7,5 с помощью б н, раствора едкого натра. 50 10 800 единиц ГА/0,25 мл, что соответствует выходу очистки, близкомук 98. Полученный раствор вирусаодновременно очень чистый и концентрированный.П р и м е р 5. Алантоисную зараженную жидкость, как описано выше,концентрируют диафильтрацией на мембранах или полых волокнах.50 л таким образом доводят дообъема 5 л или меньше. После осветления этот концентрат непосредственно вводят в колонну, согласно описанной в предыдущих примерах модели ипо такому же способу,Вирусный пик содержит совокупностьгемагглютинатных единиц, которыебыли предложены. Этот раствор, оченьчистый в отношении протеинов, можетбыть загрязнен фосфолипидами желточного мешка, организованными в мицелы;это загрязнение отделяют ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы,При удалении всех примесей с помощью разделительной хроматографии выход на всех операциях увеличивается.П р и м е р б. 500 л зараженнойалантоисной жидкости, как описановыше, очищают путем ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы. Объем фракций, соответствующий пикувируса на графике, составляет объем1Выход этой операции 30-80. Этуфракцию вводят автоматически в колонну с силикагелем, как это описанов примере 2, и осуществляют разделительную хроматографию по способуэтого примера. Собирают 3 л элюата.Выход операции хроматографииблизок к 100. П р и м е р 7. Операции, реализованные в этом примере, идентичнытаковым описанным в примерах 2, 3,4, 5 и б, Однако вирусная суспензия,подвергнутая разделительной хроматографии, предварительно инактивирована формалином, Ч -пропиолактоном или ультрафиолетовым излучением,и/или обработана органическим растворителем,П р и м е р 8. Хроматографическую колонну, подготовленную согласнопримеру 1, используют для очисткиводного, с примесью, раствора каталазы, извлеченной из бычьей печени.Этот раствор имеет активность 220международных единиц. Элюат буферируют при рН 7, Получают раствор сактивностью 1800 между народных единиц, выход составляет 86.П р и м е р 9. Повторяют операции, описанные в примере 2 при использовании описанной в примере 1колонны, но наполнитель колонны представляет собой стеклянные шарики размерами 80-280 мк, среднии диаметрпор которых составляет 50 нм.(10 Выход очищенного вируса составляет 87,П р и м е р 10. Очистку вирусаштамма В/НК осуществляют согласнопримерам 1 и 2, за исключением второй пассинации наполнителя колонны,используют 500 мл водного 6-ногораствора лактальбумина молекулярноймассы около 18 000, Выход 92.П р и м е р 11, Указанный впримере 10 лактальбумин заменяют(8-ным растнором мясного пептона,т.е. продуктов протеолиза полипептидов мяса. Выход составляет 93,П р и м е р 12. После выделениявируса согласно примеру 2 полученный продукт (А) исследуют с точки 5зрения его микробной флоры; количество микробон на мл указано нижеПодобное выделение осуществляютс той разницей, что к буферному раствору добавляют 5 г хлороформа на 2 Олитр для стерилизации среды; полученный раствор В содержит очень грло микробов, В операции С добавляюттот же антисептик в количестве5 г/л как к буферному растворУ, так ди к обрабатываемой жидкости, Результат подобен В, Вирусную среду подвергают зональному ультрацентрифугированию, после обычного добавления 0,01 метиолята и 0,02 формальдегида.Получены следующие результаты,микробон/мл;А. Хроматография, безантисептиков 105В. Хроматография, хлороформ в буфереС, Хроматография, хлороформ н буфере и нобрабатываемой жидкости 10 40Д, Зональное ультрацентрифугиронание метиолят + формальдегид 3 000Кроме того, полученные н операциях А, В и С вирусы живые, в то 45время как полученный в операции Двирус неактивен. Более того, полученные в результате операций В и С,с хлороформом, процукты сохраняюттот же самый инфекционный титр и обладают той же самой гемагглютинатной способностью, как и продукт,полу военный н операции А, выделениекоторого осуществлялось безвсякогоантисептика,П р и м е р 13, Вирусный раствор,подобный тому, что использован вопытах А-Д в примере 1, но соответствующий другим штаммам вируса, подвергают разделению по способу описанному в примере 2. 60Таким образом, были исследованыжидкости, полученные н 3 штаммон вирусов гриппа: А/СССР, А/Техас В/НК,В каждом случае, осуществляютхроматографию, злюируя буферным раствором, содержащим 5 г хлороформа в 1 л или без хлороформа. Кроме того, проводят сравнительные выделения путем зонального центрифугиронания.Ниже даны выход,по отношению к исходной жидкости, и вирусный титр (в международных единицах на мг протеина) . Выход,А/СССР А/Техас Н/НК ХроматограФия с хлороформом 88Хроматография безхлороформа 81Зональноеультрацент- рифугирование (метиолят+формальдегид) 72 63 77,5 88 71,5 81 50 Между н ар од н ая ед /мгпротеинаХроматография с хлороформом 19800 23400 26200ХроматограФия безхлороформа 15900 12100 19200Зональноеультрацент- рифугирование (метиолят+формальдегид) 12900 13600 15300Результаты показывают, что добавление хлороформа улучшает как выход, так и концентрацию вируса вполученном продукте. Из результатов,полученных при осуществлении процесса описанного н примере 13 найдено,что выделенный в присутствии хлороФорма вирус живой и имеет тот жесамый инфекционный титр и обладаеттой же самой гемагглютинатной способностью, как и вирус, полученный врезультате хроматографии без хлороформа. Напротив, выделенный центрифугированием с классической стерилизацией вирус является неактивным,П р и м е р 14. В операциях, подобных В и С примера 12, используютбромоформ н концентрации около 1 г/л,что соответствует максимуму растворимости СНВгз в воде. Находят околосотни микробов, на мл, в конечнойжидкости,П р и м е р 15. Замена хлороформа н примере 12 на 1,1,2-трихлорзтан, по 4 г/л (растворимость 44 г/л при 20 С), приводит к значительномуоуменьшению микробной флоры, менее 30 микробов/ил.П р и м е р 16. Операции примера 2 реализуются в колонне, описанной н примере 1, но беэ второй пассива784784 10 ции, т.е. без обработки наполнителя алантоисной . жидкостью. Выход вируса ранен 70.П р и м е р 17. Работая без второй пассивации, как в примере 16, причем наполнитель представляет со бой такие же стеклянные шарики, как в примере 9, получают выход 64 (по сравнению с 87, пример 9).Условия расхода элюирующего средства, количество обрабатываемой инжектируемой в колонну жидкости, частота этой инжекции, описанные в примерах, не являются ограничительными, их можно изменять в широких пределах.П р и м е р 18. Растворы алантоисной жидкости, зараженной вирусом, приготонляют известным образом, с помощью различных штаммов вируса. В эти растворы вводят б г/л хлороформа.Ниже показано, что введение хлороформа не изменяет инфекционный- титр и гемагглютинатную способность этих растворов.А/Викто- А/Х 47 НК 73рия 75 200 Титр: ГА дохлороформаспустя 24 чспустя 2 дняспустя 3 дняспустя5 дней 210 210 180 230 160. 290 160 280 160 Показатель Пример Диаметр частиц, мкм 100-200 50-100 100-200 40-80 50-150 Средний диаметрпор, нм 60 140 30 10 180 Удельная поверхностьм /г2рН элюента 50 230 70 420 30 6,7 5,6 7,5 7,0 6,5 1-й агент пассивации Полиэтиленгликоль Поливинилпирро- Полипролиден пилен- гликоль молекулярная масса 20000 6000 29000 2-и агент пассива- Яичный альбумин (незаряжен- Пепции, ная алантоисная жидкость) тон,Лакталь- бумин 44000 18000 93,0 926 92,9 90,7молекулярная масса Выход, % 93,3 тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве твердого носителя 60 используют силикагель или силикатщелочного металла с частицами размером от 40 до 200 мкм, порами диаметром от 5 до 200 нм, носитель после первичной пассивации водным раст вором полимера с молекулярной массой Формула изобретения1. Способ выделения протеина из водной среды путем разделительной хроматографии на твердом носителе, предварительно пассивированном водным раствором полимера и элюированием протеина буферным раствором с рН 5,5-7,6, о т л и ч а ю щ и й с я Инфекционныйтитр:без хлороформа 0 10-,с хлорофор 5мом 10" 102-П р и м е р 19. Испытания, аналогичные тем, которые проведены впримере 13 с различными антисептиками в буферном растворе, дают следующие результаты,Антисептик Концентра- Микробы,ция, г/л обнаруженные на мп(средниеокруглен 15ные значения) Никакой 10Дихлорметан 6 200Дибромметан б 10020 Дийодометан б 40Дихлор, 2-этан 6 160Дибром,2 этан 45 Трихлсрэтилен 1 300П р и м е р ы 20-23. По методупроведения примеров 1 и 2, проведены хроматографические анализы, ипри этом проводилось изменение некоторых факторов, которые указаны втаблице, где результаты примера 2приведены в качестве сравнения,784784 12 Составитель В. ВолкоРедактор Л, Герасимова Техред А, Бабинец орректор О. Била раж 495ого комитета СССРений и открытийаушская наб д.4/ аказ 85 4/б 7НИИПИ Гопо дел35, Моск Т дарствен м изобре Ж, Подписное илиал ППП "Гатент", г. Ужгород, ул . Проектная, 4 от 5 000 до 30 000, пассивируют повторно 0,2-20-ным водным раствором :протеина с молекулярной массой меньше молекулярной массы выделяемогопротеина,2. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве полимера для первичной пассивации используют полиэтиленгликоль, поливинилирролидон или полипропиленгликоль.3. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что протеин используемый при повторном пассивировании,имеет молекулярный вес меньше 100 000и представляет собой альбумин, желатину, пептон или продукты разложения полипептидов.4. Способ по и. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что в буферныйраствор добавляют антисептик в количестве от 0,1 до 10 г, представляющий собой дихлорметан, дибромметан, дийодметан, 1,2-дихлорэтан, дибром,2- -этан или трихлорэтилен.5. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве выделяемого протеина, используют вирус,Приоритет по пунктам:26.04.77 - по пп. 1, 2, 3, 5 10 12.04,78 - по п. 4. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. 5. Веп 9 сььоп, С. РЬ 111 рьоп,