Способ получения рибозо-5-фосфат изомеразы из листьев шпината

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 4(51) С 2 ЫЙ КОМИТЕТ СССРРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ГОСУДАРС ПО ДЕЛА ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУсД ваай(71) Институт физиологии и биофизикирастений АН Таджикской ССР(56) Кцйпег А.С. БрпасЬ 5-рЬоврЬог 1 Ъове 1.вогпегаве. РцгИсасоп апйргореггев ой гЬе ец 8 упхе. - "В 1 оспеш 1 всгу", 1970, ч, 9, Я 1, р. 178-184.(54).(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОЗО-.- .ФОСФАТ ИЗОИЕРАЗЦ ИЗ ЛИСТЬЕВ ШПИНАТАпутем.гомогениэации листьев в буфере,801165713 А многократного фракционирования суль"фатом .аммония, диализа и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозео т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, в качестве буфера используют трис-НС 1экстракт двукратно фракционируютсульфатом аммония при насыщении 3767%, активную фракцию фермента прогревают, проводят диализ против дистиллированной воды однократно в течение 40 ч, вновь двукратно фракционируют сульфатом аммония при насыщении40-85%, а ионообменную хроматографиюпроводят однократно.Изобретение относится к производству ферментов, касается технологии их получения, и может быть использовано для получения рибозо-фосфата, а также при моделировании системы 5 карбоксилирующей фазы фотосинтеза.Цель изобретения - упрощение способа и повышение выхода целевого продукта.П р и и е р. 100 г листьев шпина та промывают охлажденной водой, затем дистиллированной водой и подсушивают с помощью Фильтровальной бумаги. Приливают 100.хп 0,05 М трис-НС 1 буфера рН 8,5 и гомогеиезируютв ступ ке или гомогенизаторе РТ, полученный гомогенат Фильтруют через четыре слоя марли. Добавляют к нему твердый сульфат аммония из расчета 23 г на 100 мл полученного гомогената, После 20 растворения сульфата аммония гомогенат центрифугируют на центрифуге (лю" бой) при 8000 я в течение 25-30 мин. Полученный осадок отбрасывают, а в супернатант добавляют твердый суль Фнт аммония из расчета 19 г на 100 мл супернатанта.После растворения сульфата аммония помутневший супернатант вновь центрифугируют при 8000в течение 25- Зр 30 мин. Полученный супернатант отбрасывают, а осадок растворяют в дистиллированной воде из расчета 65 мл на 100 г взятых листьев. Полученный раствор.(70 мп) прогревают на водяной бане 95 С 1-1,5 мин, чтобы температура раствора достигла 60 С, и выдерживают в течение 10 мин в бане 60 С. Затем быстро охлаждают в ледяной бане до +4 С и центрифугируют при 8000 я в течение 20-25 мин на любой центрифуге. Полученный осадок отбрасывают, а супернатант диализуют в диализных мешках против 10-12 л дистиллированной воды (воду по 1,5- 2 л меняют 6-8 раз в течение 40 ч), Помутневший раствор насыщают твердым сульфатом аммония .из расчета 29 г на 100 мл, затем центрифугируют при 8000в течение 25-30 мин.Осадок отбрасывают, а супернатант вновь насыщают сульфатом аммония из расчета 32 г на 100 мл. Вновь центрифугируют при тех же условиях.Полученный осадок растворяют н минимальном (3-5 мл) объеме 0,02 М трис-НС 1 буфера рН 8-8,5 и обессоливают, используя диализ против 0,02 М трис-НС 1 буфера рН 8,0 или, что лучше - обессоливают на колонке 1,5 х 25 см, заполненной сефадексом Я = 50 и забуференной тем же буфером. Обессоленный белок наносят на колонку с предварительно обработанной и забуференной ДЭАЭ-целлюлозой 0,02 М трис-НС 1 ффером рН 8,0. После связывания беж с целлюлозой пропускают градиент концентраций ЙаС 1 0-0,5 М в том же буфере общим объемом 300 мл (на колонку 2,5 х 15 см)Активные фракции появляются после прохождения примерно 150 мл градиента, Все остальные фракции (примерно 150 мл) объединяют и приливают к ним. насыщенный раствор сульфата аммония 350 мл, предварительно оттитрованный аммиачной водой до рН 7,5. Помутневший раствор центрифугируют, Полученный осадок - очищенная рибозо-фосфат изомераза может быть растворена в буфере, обессолена и использована для дальнейшей работы (ее практического применения). Выход составляет 1-2 мг.В таблице представлены сравнитель" ные данные для предлагаемого и известного способов.Полученный ферментный препарат характеризуется электрофоретической однородностью в 57, 7,57 и 107-ном полиакриламидном гелях, имеет характерную молекулярную массу в 53 000 дальтон и близкий аминокислотный состав к ферменту из табака,Таким образом, предлагаемый способ выделения рибозо-фосфат изомеразы из листьев шпината позволяет получать однородный высокоактивный Ферментный препарат со значительно меньшими затратами во времени и реактивах по сравнению с известным способом.11657 13 Критерий Количество затраченноговремени, ч 60,65 2,1 раза 125,5 1,4 0,24 5,83 раза Электрофоретическаяоднородность Удельная активность,нкат/мг белка 1500 1500 400 5 раз 80 Составигель И, ГуляеваТехред О,.Веце Корректор С. Юекиар Редактор В, Ланко Заказ 4285/24 .Тирах 525ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж Ваушская наб., д, 4/5 Подписное филиал ППП "Патент", г. Уагород, ул. Проектная, 4 Количество очищенногофермента на 100 глистьев, мг Количество растительногоматериала для получения1 мг очищенного фермента,г/листьев Известный Предлагаемый Эффективностьпредлагаемогоспособа