Способ получения антигенов

О П И С А Н И Е ,и,ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советскин Социалистических Респубпик(32 72 осударстаеннмй номнтетСоавта Мнннс 1 роа СССРпа делам нзобретеннйн открапнй Р) США1,77 Бюллетень 43 (5 27027(088,8) писания 20 72) Автор изобретен Иностранецгут Бертил Бьеркпунд ( Швеция) 71) заявитепь) СПОС ЛУЧЕНИЯ АНТИЕН нактивациюантигенов не олжна Изобретение относится к области медицины.Известен способ получения антигенов из злокачественных образований и нормальных тканей путем обработки гомогенизированных ткайей органическими растворителями, лиофилизапией осадка на шаровой мельнице прн низкой температуре с последующим гидролизом гомогента раггвором МаОН и пентрнфуирова.нием. Затем надосадок прогревают при 95 100 С и осаждают при рН 4,5 белки, которые затем растворяют в буфере или воде.Однако такой способ не обеспечивает высокой специфичности антигенов.Лля повьппсния специфичности антигснов по предложенному способу растворенные в буфере белки фильтрукт через гель, собиракт фракции мол, вес. (О 10620.0 и повторно фильтруют через гель, собирают первую активную порцию, доводят до рН 5,0, соединяют осадок с телсм мол, вес. 2.000 уравновененным буфером ирн рИ около 5,0, помещают на колонку с тем же гелем, элюируют растворами со сни. жающимся градиентом рН н собиракт фракцию, элюирусмую прн рП 3,0.Карпнномньп или нормальныс ткани в замороженном состоянии отдельномеп 1 ивакт с иолой при температуре около 0 С н гомогеннзирую гак, нгобы нс создавать излишнего тепла 2 трения, которое может вызвать исвязанных с раком полипептидных(СРПА). Температура суспензии д превышать ОС.Полученную холодную смесь жидких гомо. гснатов и твердьх Веществ смешивают с органическим растворителем, способным растворять липиды (например природные жиры), ацетоном или этиловым эфиром при температуре около О С. Цель обработки растворителем заключается в удалении липоидных веществ и в уве. личении времени действия антигенных групп. Твердые вещества отделяют от смеси центрифугированием, воду и слои растворителя удаляют, Температура не должна превышать плюс 4 С.Выделенные твердые частицы лиофилизируют и лиофилизированный тканевый порошок размалывают в шаровой мельнице при температуре минус 70 С, После размола получают тонкий серо. коричневый порошок,Полученный порошок экстрагируют солевым раствором, верхний слой после центрифугнрования удаляют. Полученный осадок снова суспендируют в холодной воде, выделяют и лиофи 1 изируют. Полученный порошок можно хранить годами в закрытых бутылках при плюс 4 С,Прн экстрагировании опухолевых я нор. м алых порошков, содержагцих полипептиды.водой при щелочном рН среды экстракты чут неют после добавления ЙаС при нейтралнноч или слегка щелочном рН, Эта мутность возникает из.за присутствия примесей нуклеиновых кислот. После центрифугирования обработан. ных рассолом экстрактов вся активность оста. ется в прозрачном верхнем слое, Верхний слой осаждают изоэлек трически п ри кислом рН око. ло 4,8 и полученный осадок растворяют н во. дном фосфатном буферном растворе при рН около 7,0.Полученный раствор фильтруют на соответствующем молекулярном сите гелевого типа в слое, позволяющем фракционировать со. единения по молекулярному весу в диапазоне от 10 10 до 20 10 предпочтительно 15 10, Фильтрующий гель элюируют буферным раствором при нейтральном рН, при этом выделякй молекулярные фракции 10 10 до 20 О, предпочтительно 15 10.Выпавшую активную фракцию из гелевого фильтрования растворяют в буферном растворе рН около 7,0. Полученные растворы фильтруют через колонку, загруженную слабым ионообМенныч молекулярным ситом типа геля со слабыми ионообменными свойствами, например полиакриламидным гелем Био-Гель Р, причем колонка уравновешена аналогичным буферным раствором рН около 7,0, Первая фракция, ны. ходящая из колонки, которую выделяют, обладает антигенной активностью.Выделенную фракцию из хроматографии на Био-Геле Рподвергают особой обработке для дальнейшей очистки СРПА. ту обработку осуществляют следующим образом, Смесь протеинов или сопряженных протеинов осаждают изоэлектрической регулировкой рН, Полученный осадок смешивают с соответствующим гелем, подобранным, исходя из имеющейся протеиновой смеси. Полученную смесь осадка и геля загружают в верх колонки, содержащей идентичный гель такого же изоэлектрического рН, т, е, рН, который является изоэлектрическим для протеинов при осаждении их в предыдущей стадии. Затем колонку элюируют гри постепенно возрастающем или уменьшаюгцемся рН. В элюате выделяют те фракции, н которых содержатся нужные протеины,Нормальные и СРПА фракции., выделенные хроматографией, подвергают осаджению активного вещества, при рН около 5, осадок выделя. ют и растворяют н воде при рН около 8,5, Затем рН прозрачного раствора доводят до кислого рН около 5,0 при помощи муравьиной кислоты, такая обработка приводит к осаждению. Каж. дый осадок смешивают с шламом полиакриламидного геля, уравновешенного НСООН - -НСООВ 4 при рН около 5,0, Каждую из таких смесей помещают в верхнюю часть геленой колонки, уравновешенной как указано,Для элюирования осадков применяют рН- градиент, и в этом случае с постепенно умень.шающимся рН. Соответствующей буферной снстечои является НС 0011 НСОО 1 Н 4 Р 1 Н НСО- г 4 Н,. Антигенная активность установлено в выходящей жидкости в диапазоне рН от начального рН до рН 3. Выделенная0 20 25 30 35 40 45 50 55 60 жидкосгь н этом диапазоне р 11 сслержи 1 нуж.ные СРПА, которые можно выделить вымора.жива ниеч. Для установления молекулярноговеса СРПА этой фракции жидкости фракциюфильтруют на геленой колонке, уравновешенной НСООН-НСООМН, при рН около 3. Затем выделяют элюнрованные фракции СРПА соспектрофотометрическим пиком поглощения ндиапазоне 229 - 233 мкм. и чол. вес. 20.000 27.000. СРПА можно выделить после фильтро.нания из активной фракции нычораживанием,их можно хранить длительное время н вакууме,на холоде, в течноте,Выделенное вещество состоит из полипепти.да на основе одной полипептидной цепи. СРПАимеют основную реакцию и растворичы при рН13,5, Незащиценный полипептид денатуриру.ется необратимо при нейтральных рН, а именнопри рН 4,6. Антиген гигроскопичен, переходит нжелтую окраску и становится неактивным ивязким при поглощении влаги.Очищенные СРПА содержат флуоресцируюгцую группу, эта группа активируется при длиневолны около 288 мкм и излучает свет при длиневолны около 350 чкм. Флуоресценция пропорциональна количеству СРПА и может бытьиспользована для определения наличия полипептида при его выделении.Спектрофотометрический пнк поглощенияСРГ 1 А находится н диапазоне длин волн 229 -233 мкч, Кроме того, они склонны к агрегиронанио и не фильтруются на нормальной фильтро.нальной среде, применяемой для стерилизации,они не содержат углеводов и, как показываетспектрофотометрия, не содержат нуклеиновыхкислот,Выделенные СРПА можно широко использовать, например при получснии моноспецифичных антител для диагностических целей, дляиммунизации в качестве активного ингредиентан состанах.Пример 1. Выделение чистого антигена,Карциномные и нормальные ткани из аутопсий раздельно чисто отрезают от соседних тка.ней и разрезают на кубики 23 см, эти кубикипромывают в 0,90-ноч растворе МаС приО С до тех пор, пока они не перестают выделятькровь. Промытые кубики заморажинают и хранят при минус 24 С.В замороженном состоянии тканеные кубикисмешивают с 10 мл воды при 0 С на 1 гзамороженной ткани, затем их гомогенизируютв охлажденном гомогенизаторе, Температурусуспензии выдерживают при 0 С или несколькониже.Холодный гочогенат выливают н охлажденные полиэтиленовые бутылки 000 чл, В каждой бутылке смешивают 400 чл суспензии и400 чл этилового эфира при минус 20 С, перемешинание ведут прн минус 2" С н течение 2 часв центрифуге-трясучке (300 об/чин). Смесьцентрифугируют при минус 2 с н течение5 мин. В этой стадии липидньй слой не смешивается с тканеныч слоем Этилсный эфир нлипид выбрасывают и проводят вторую экстракцию н течениечас с последующим центрнфугиронанием н течение 5 чин и удалениемэфирлипидного слоя.1842 Для дальнейтией очистки СЫ 1 А осевшиеактивные средние фракции из пяти колонок БиГель-А.50 м растворяюг в 1/150 М фкфзтноч 20буферном раствоте прн рН 7,0 Сбу) р с спенсенз в 2/ -ном бутанолс) до У/ ттзтзгтьнго объемао.цжидкости. Этот раствор, содержаигнн 1,0 мл протеина в 8,5 мл фильтруют через колонку с Био-Гелем Р.2. Колонку утзвнояешивянт 1,150 М буферным раствором рН 7,0 (буфер Соренсена в 2/.том бутяноле 1. На каждый миллиграмм протеина допускают объемлоя10 мл.Первая фракция активна, ее отводят элюн.руютцим буферным раствором рН 7,0. а примеси ЗО сорбируют на геле при низкой ионной силе.Активное вещество осаждают при рН 4,8 прн помощи 0,1 М НСООН н цетттртфугттрукл при 0 С в теченте 5 мн т. Осядорзсттрянт в 8,5 мл тот рН доводят до 8,5томтттьт 35О М (х 111 ОН. 1 розрячный тял вттт снова осяж даот грн раза О, М 1 СОО 1 прп р 1 4,Я,промывают в центрифуге при гаком ж р 1 и растворяют прп рН 8,5. Исчезновение бутанола прослеживятот газо-жидкостной хроматографией, Готовый раствор хранят в ампулах лио О фнлизировзнным н замороженным. Получен.ный продукт представляет собой сухой, почти белый порошок, который хранят при минус 24 С в эвакуированных герметичных ампулах.Для дальнейшей очистки продукта, получен.ного в результате предыдущей хроматогряфи ческой обработки, разработан способ элюиро.ванин с градиентом рН, Этот способ заключает.ся в следующем. Подлежащую очистке ог ак.тивного компонента протеиновую смесь осаждают нзоэлектрическим регулированием рН.50 Осадок смешивают с соответствующим гелем.Эту смесь наносят слоем в верх колонки, содер.кащей такой же гель с таким же изоэлектрнческнм рН, Затем колонку элктруот с градиентом рН при постоянных расходе и темпера гуре.Таким образом колонку элюируют средой с 55 непрерывно н ступенчато возрзл зющим илисттижяюшим. я рН.ряди,нтное элюнрованн роводят с 5 мглиофилнзнровзнного и обессилентсго норовкз СРПА н тормзльнго знтнгенного проптиз, Очите(тго указа нымпоссбом, с дан ч с.ч;е т 1 нт;т,;.нти хтся эн, ттт 11 кн 58Затем проводят центрифуги)овяние при минус 2 С в течение 30 чин, водный слой удалякт, хотя он содержит некоторое количество СРПА. Оставшиеся нерастворимые вещества сохраняют. Оставшийся этиловый эфир удаля. ют вакуумом в течение 5 мин. Антигенный материал суспендируют в 50 мл воды при О С, переносят в инфузионные бутылки на 500 мл и замораживают при 70 С (сухой лед в этаноле). Лиофилизацию ведут в лиофилизаторе при регулируемой температуре,Лиофилизироваиный тканевый порошок размалывают в шаровой мельнице при температуре минус 70 С в течение 2 час при 40 об/мии. После размола получают тонкий серо-коричневый порошок. Этот поротиок экстрагируют предварительно охлажденным до минус 2 С эфиром в центрифуге-трясучке при 300 об/мин в течение 1 час и центрифугируют при минус 2 С в течение 30 мин. Эфирный слой удаляют и остаток сушат в вакууме. Полученный сырой тканевый порошок (СТП) можно хранить годами при 4 С в герметичных бутыл. ках без заметной потери активности.Суспендируют 5 г СТП при нейтральном рН в 500 мл солевого раствора, содержащего стериальные кубики льда. Суспензию гомогенизируют, температуру выдерживают при 0 С в течение 30 чин при слабом перемешивании, Центрифугирование ведут при 0 С в течение 40 мнн. Верхний слой выбрасывают, Осадок снова суспендируют в 500 мл холодной дистиллированной воды и медленно перемешивают пр ОС в течение 30 мин. После центрифугиро. вания при 0 С в течение 40 мин верхний слой удаляют, Оставшийся осадок суспендируют в 25 мл холодной дистиллировяннои воды и замораживают при минус 70 С (сухой лед в этаноле), После лиофилизации получают промытый тканевый порошок (ПТП), который можно хра. нить годами в герметичных бутылках при 4 С.Приготавливают водные экстракты СРПА и нормального тканевого порошка (НТП) при рН 9,5 концентрпрутот нх 10 раз изоэлектрическим осаждением при рН 4,8 и растворением осадка в О, объема воды прн рН 9,5, Полученный концентрат стабилизируют быстрым нагревом до 98 -00 С и выдержкой при этой температуре в течение 5 - 10 мин. Такая термообработка разрушает энзимы, которые дезактивируют СРПА. Стабилизированный экстракт мутнеет после добавления солевого раствора при рН 7,5 вследствие осаждения оставшихся примесей нуклеиновых кислот. Для осаждения оставшихся примесей отдельно осаждают 8,0 мл водных экстрактов СРПА н нормальных добавлением 0,8 мл 10/О-ного раствора ХаС 1, После центрифугирования прн 0 С в течение 1 час прозрачные верхние слои осаждатот изоэлектрически при рН 4,8 (рН регулиут 0,1 Х НС нли 0,1 М НСООН). Осадки растворяют в 2 - 3 мл 1,150 М фосфатного буферного раствора рН 7,0.Позученные растворы из опухолевых и норма.ьз,к НТП фильтруют через Био-Гель Р, ". м х охтажденных колонка . Гель урзвно. вес с,;ут ,150 М фосфатньм буферным растворе 1 тН 7,0 с 2 О/О бутанола и элю;лют этим 6же буферным раствором. В кяжлм отт при.меняот 4- -8 мл эксгРактя, сзержзпсето всего 50100 мл ттротвиттз.Анти геннук як гикностьбня руж и вя т ясредней фракции, выходяттт и к жидкгн ти опухо левого экстракта. 1 Ърттии ичл этой фрак.ции, всего 60180 мл, разбавляют три раза и доводит до разных значений р 11 от 2,0 до 9,0.Г(осле 6 мин пребывания при комнатной темпе.ратуре пробы переносят в кюветы н определяют то пх светорассеяния при 500 мкч под углоч 90"Зависимость интенсивности рассеивания л рН показывает максимум при рН 4.8, это значение рН является изоэлектрической точкй этой фракции.Оставшуюся часть активной средней фрак. т 5 ции осаждают при рН 4,8 с помощью О, Ч НС 1,Центрифугирование прп 0" С в течение 5 мин лает количественный выход активностиразл(льцо растцорякт В воле, причем рН р(гл.лирук)т ло 8,5 при ц(моии 0,1 )л) расВо)а )л)НОН.;Затем рН пр(зрачцого растц(ра ло.водят ло 5,0 при помощи 0,1 М НО)ОН, при этом происхолит осажление. Каждый осалок смешивакт с О мл суспензии Био Ге. ля Р, уравновешенного водным раствором 0,02 М НСООН и 0,2 М НСООН)л)Н 4 с получением р)1 5,0. Каждую из этих смесей помещакт В верх колонки с 15 мл Био-Геля Р.2, обрабо. таиной силиконом. Гель нахолится на неболь. шом куске стекловолокна. Для элюирования осалков применя)от градиент рН. С помощью градиентного смесителя вь)лерживают рН око. ло 5 в течение короткого периода времени для промывки осадка, затем рН постепенно снижают ло 2,8 и наконец увеличивают до 9,0. Буферная система состоит из 0,02 М НСООН - - Н( 00 ЧН 4 и 0,02 М л( Н 4 НСО) - ЧН, элюи. рование ведут при комнатной температуре. Расхол составляет 27,2 мл/см час.Выходящую жилкость после опухолевого экстракта анализируют флуоресцентной спект. рометрией (активация при 288 мкм, флуорес. иениия при 350 мкм). цракцию элюирования межлу начальным рН и рН около 3 выделяют лля дальнейшего использования. После лиофи. лизаиии и вымораживания продукт можно хранить в герметичньх ампулах после откачки воздуха при минус 24 С.Для характеристики размера молекулы и подтверждения чистоты антигенный материал в виде раствора фильтруют через Ьио-Гель Ркоторый уравновешивают буфером 0,02 М НСООН - НСООл)Н 4 рН 3,0. Элюированный СРПЛ растворяют в небольшом количестве этого же буфера. Расход 3,25 мл/смчас, собранные фракции 1,25 мл. Активные фракции показывают максимум спектрофотометрического поглоцения при алине волны 229 - 233 мкм и флуоресценцию при 350 мкм, если активация шла при 288 мкм.10,4 мг СРПА, растворенные в 3,0 мл указанного буферного раствора обрабатывают на силиконизированной колонке с Био-Гелем Ри получают полное выделение обоих веществ и активности. Объем элюирования сопоставим с молекулярньм весом 22 000 - 24 000. После вымораживания получают белый гигроскопический порошок, который можно хранить на холоде, в темноте, без доСтупа кислорода, В продукте отсутствуют углеводы и нуклеиновые кислоты. Анализ при помоц(и аминокислот показывает соответствие с молекулярным весом, опрелеленным по гелевой фильтрации.Анализ аминокислот показывает следуюгцее распределение ве(цеств по молярнь)м процентам с точностью до +5/о, алании 8,62, аргинин 4,57, аспартовая кислота 10,39, цистеин 0,95, глутамовая кислота 17,04, глииин 6,87, глистидин,0, изолейиин 4,75, лейииц 10,49, лизин 3,69, ме. .тионин 1,91, фенилаланиц 2,75, пронин 3,79, серии 7,74, треонин 5,92, тирозин 3,21, валин 6,36. Солержание амицокколот соответствует тео. рот 4 сскому голержанию азота 6,217,8 /о. о(например 0, Л 1, р) 2 3). Получают пр(зр 11 нь 1 и растВор. К этому растВору ЛбаВляк)тпороци)к альбумица или раствор альбумица црцтаком же рН, как у раствора муравьиной кн.лить (200 вес. ц. альбумина на 1 Весз. СР 11 Л), цполучают пр(зрацный раствор СРГ 1 Л и альбу.мина. 31 тем рН раствора меллецно увеличивают добавлением основания (например волцого)ц раствора елкого патра или аммиака) ло рН 7,5.Получают прозрачный раствор, содержан(цй(;РПА и альбумиц в виде комплекса.Этот раствор, содержащий 12 мкг СРГ 1 А/мл,можгт быть использован лля лиагцостики илиможет быть выделен вымораживанием комп 15 лекс в виде белого порошка, Порошок стабиленна холоде (глюс 4 С) в течение длитсльцоп)времени.Макс цмальное использование активности(.;ПЛ достигается прц весовом соотношенииальбумина к СРПА равном или больц(е 200:1.Получение дубленьх и меченых красныхкровяных телец.Свежую кровь овцы (1 об. ч.) добавляют кстерильному раствору Алсевера (1,2 об. ч.).Раствор Алсевера готовят из 250 г глюкозы,80 г лигилрата нитрата натрия, 42 г (л)аС цволы лоО л, рН доводят до 6,1 при помощи 10%-ного моногилрата лимонной кислотыСмесь иентрифугируют и эритроциты снова сус.цецдируют в растворе Алсевера и дважды вбуферном растворе при рН 6,8,зо Созлают суспензию эритроцитов в буферномрастворе при рН 6,8 концентрациейО эритроиитов Вмл на 1 объем суспензииэритроиитов, полученной как указано, добавля.ют при перемешивании к 1 объему буферного раствора при рН 6,8, содержа(цему около8 мкг лубильной кислоты на 1 мл. Дубленыетаким образом эритроциты центрифугируют илважды суспендируют в буферном растворепри рН 7,5. Далее эритроциты суспендируют вбуферном растворе при рН 7,5 концентрациейО эритроиитов на 1 мл.Порцию полученного комплекса СРПА растворяют в буферном растворе при рН 7,5 иполучают концентрацию СРПА 3 мкг/мл (расчитано по чистому СРПА), Добавляют1 об. ц, суспензии дубленых эритроцитов по45 каплям при 0 С коб: ч. раствора СРПЛкомплекса в течение 10 мин. Меченые эритроии.ты иентрцфугируют и снова суспенлируют Вбуферном растворе при рН 7,5, содержащемстабилизируюцее количество инертной целоцс.ческой сыворотки, и получают суспензию, солержащую 1,6 1 О меченых клеток вмл. Этимеченые клетки применяют для методики лингноза.Пример 3. Получение антител,Для перенося полипептилов в активном со.55 сгоянии к клеткам, пролуцирук(иим антител,необходимо солержать полипептилы В растпо)цпри рН ниже 3 (0,02 М НСООН, рН 2,8) цэчульгировать раствор в маслс ло сбраццацццчрезвыццйно малых кацль, зац(ицпццых слем масла. 1 гь(киия такой эмульсии пригнли60 к с)с) рзона ц ц к) чл(В,(т В(рц тссл ьцс) г( к ,111 сс 19ва антител, которые специфично реагируют с СРПА н реакциях склеивания красных кровяных телец, в которых клетки крови мечены СРПА,Получение иммунизирующего реагента.816 мкг чистых СРПА, полученных иа хранящихся раковых опухолей человека, растворяют в 1 мл 0,02 М НСООН при рН 2,8. К этому раствору по каплям добавляют 1,0 мл вспомогательного масла при эмульгировании, Эмульгирование ведут по фройнду шприцем для инъекций. Смесь втягивают и вьпускают из шприца до образования гомогенной эмульсии белого цвета, имеющей консистенцию взбитых сливок, Одна капля этой эмульсии при испытании с ле. дяной водой отдельно плавает и остается неповрежденной. Полученную полутвердую эмульсию применяют для подкожных и внутримы. шечных инъекций кроликам,Иммунизация пяти кроликов. В первой инъекции применяют, так называемое полное вспомогательное вещество, а в последуюгцих инъекциях, неполное вспомогательное вещество. По. сле начального отбора крови у каждого из пяти кроликов для установления О - величин, им подкожно вводят справа и слева по 408 мкг эмульгированных СРПА при рН 2,8. С интервалами в десять дней вводят еще три инъекции, первую внутримышечно в задние лапы, а вто. рую и третью соответственно в переднюю и заднюю часть, Выбирают место инъекции, исхо. дя из использования приемных участков регио. нальных лимфатических желез. Всего каждый кролик получает около 1,6 мкг СРПА в виде эмульсии, Через 4 и 24 дня после последней инъекции берут пробы крови для анализа на склеивание красных кровяных телец для определения наличия специфичных антител против СРПА, Через два дня после отбора последней пробы спускают максимальное количество крови, выделенной в виде сыворотки, которую стерильно фильтруют и переносят малыми порциями в стерильные пробирки. Эти пробирки можно хранить на холоде при поддержании специфических условиИ,Процедура диагностики. Анализ крови основан на показании наличия СРПА по модифицированной методике подавления слипания крас. ных кровяных телец (микрометод). Сыворотку пациента (25 мкл), сорбированную красными кровяными тельцами овцы, титруют в восемь стадий двумя разбавлениями в разбавительных пластинах Линдро5 МЯ С - 96, затем в каж. дую полость добавляют 25 мкл специфичной иммунной сыворотки при предельном разбавлении (1:2000). После инкубации при 22 С в течение 10 мин в каждую полость добавляют по 50 мкл суспензии около 6 - 8 миллионов крас. ных телец крови овцы, задубленных и меченных выделенными СРПА, комплексированными с чел овеческим альбуми ном (2 - 4 м кг на 10 клеток крови). Вместо эритроцитов можно применять другие порошкообразные носители, например латекс, бентонит или коллодий, . Геакцию записывают при помощи наклонного зеркала и стандартной серии через 4 - 24 час после инкубацнн при 1 - 2 С, 58842 10 Статистический анализ экспериментальных данных показывает, что существует важная зависимость между диагнозом рака и увеличенной концентрацией СРПА (Р0,001). То же относится к соотношению между размером мас. сы рассматриваемой опухоли и увеличенной концентрацией СРПА (Р ( 0,001), Независимо от типа и локализации установлено, что раковые опухоли содержат СРПА, вследствие чего СРПА являются общими для всех типов рака, т, е. злокачественных опухолей эдитфлийного происхождения.45 Формула аобретекия Способ получения антигенов путем обработ. ки гомогенизированных ткбкей органическими растворителями. лиофилизацией осадка и повторной гомогенизацией его при низкой температуре с последующим гидролизом ПИдроокисью натрия, обработкой хлористым натрмч, осаждением в иЯазлектрической точке и растворением осадка в буфере, отличающийся тем, что. с целью п вышения специфичности антигенов, растворенные в буфере белки фильтруют через гель собирают фракции мол наес.10 10 - 20 10 И повторно фильтруют череЗ. гель, собирают первую активную порцию. дЮ" 50 5560 Для контроля применяют: а) клетки крови.меченные СРГ 1 А, плюс иммунная сыворотка; б) клетки крови, меченные СРПА, без иммунной сыворотки; в) сыворотку больного плюс клетки крови, меченные человеческим альбум ином; г) сыворотку больного и необработанные клетки крови; д) клетки крови, меченные СРПА, и антитела в одной серии, где ингибирование обеспечено ступенчатым уменьшением извест.ных количеств СРПА.о Жидкости для разбавления содержат соеди.ненную от многих людей инактивированную нейтральную сыворотку для стабилизации кле ток крови.Реагент СРПА получают из хранящихсяраковых тканей человека, очищают его с по5мощью гелевои фильтрации, элюирования рН- градиентом, фильтрованием через Био-Гель Ри комплексированием с альбумином,В качестве иммунной сыворотки применяютлошадиную анти-Не.а, сорбированную нормальной тканью, и запасную человеческую сыворотку. Иммуннизацию проводят промытыми фрагментами Не.а клетоквыращенных на среде Игла, содержащей 20/О инактивированной человеческой сыворотки в плоских стеклянных бутылках. Клетки собирают с помощью 25 ЕДТА, центрифугируют и три раза промыва.ют водой. При наличии в сыворотке большого СРПА лошадиные антитела нейтрализуются, при этом не наблюдается склеивания при последующем добавлении клеток крови, меченных полипептидами, Регистрацию ведут по воззо растающей шкале от. О до 6, где Оуказывает наотсутствие ингибнрования, а 6 - йа максимальное ингибирование склеивания.Записи делают без учета состояния здоровья больного.5884 водят ло рН 5,0, соединяют осадок с гелем мол. вес, 2.000 уравновец 1 енным буфером цри рН около 5,0. ломен 1 ают на колонку с тем же 22гелем, элк)ируют растворами со снижаю 1 цимся градиентом рН и собирают фракцию, элюируе. мую при рН 3,0, Составитель С. Малютина Редактор Е. Кравцова Техред О. Луговая Корректор Д. Мельниченко. Заказ 3930/1 Тираж 677 Подписное ЦНИИПИ Государственноо комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий13035, Москва, Ж.35, Раушская наб., д. 4 Ф Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4