Штамм -4994-продуцент сайт-специфической эндонуклеазы

/00 9/22 госудю ственный кОмитет сссрпО делАм иэОБретений и Отнрытю РЕТЕН ОПИСАНИЕ ВТОРСКО ЕТЕЛЬСТВУ ВЕОИСН 1 ЯЕРТ -СПЕЦИФИЧЕС 54) АОЙ(71). Институт вирусологииим. Д.И.Ивановского и Ордена Твого Красного Знамени институтдемиологии и микробиологииим. акад. Н.Ф.Гамалеи. (56) .016 К.Я. ей а 1 кесоапвеоиепсе Йгош гевСгтсйо1-Е И1975, ч. 92 ЬгопсЬверИ- учно-исследоудового Крас- а им.акад. ционный номер специфической иакоп п епйопцзпНнепгае,. ать шой 1 ИсаггесорШопйев, 1981,3. Сгеепчой а гевеНсйе 11 а егозивйев. Сошш.,1287. СОЮЗ СОВЕТСКИХ ЦИАЛИСТИЧЕСНИХ СПУБЛИК кевйгсйоппгушев апд гЬеысев, Яис 1.АсЫв9 э Р 75у Р.Л. ТЬе З.во 1 аг,акопакоп епхуше агой фасДд.-,18 В 10 СЬешВ 10 РЬув980, ч. 95, р. 1282(57) Штамм Вогйеге 11 аса(коллекция Навательского ордена Трного Знамени институтН.Ф.Гамалеи, регистр15) - продуцент сайтэндонуклеаэы.ультразвуком, Обломки бактерий осаждали центрифугированием (100 000 я, 90 мин при 2-4 С); Надосадочнуюжидкость разбавляли РС буфером в 8 раз и наносили на колонку голубой сефарозы (В 1 пе ЯерЬагозе "РЬагшаса", Швеция), раэмерои 1,6 10 си, уравновешенную РС буфером с 0,2 М КаС 1 Колонку промывали таким же раство,ром до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. Адсорбированный материал элюировали 100 мл градиентом 0,2 М НаС 1 " 2,0 М ВаС 1 с 30% глицерина в РС буфере. Объем каждой фракции составлял 5 ил. Аликвоту из каждой фракции (2 мкл) инкубировалн 1 ч при .37 фС с 1 мкг ДНК фага Л и анализировали электрофорезом в гчяе агарозы. Фракции,; расщепляющне ДНК фага Э на Ныд 111-специфические фрагменты объединяли, днализовали 1 1040Изобретение относится к области микробиологии и генной. инженерии, в частности к получению сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции ВЬг 1, аналога рестриктазы НиЫ 111.Известны микроорганизмь-. продуценты эндонуклеаз типа Нпд 111 из рода НаешорИ 1 цв Г 1 21Известен также штамм Вогйесе 11 а реггпзвв, продуцирующий рестрикта- Ю эу Вре 1, которая гидролизует ДНК фагов 3, Ь 989, 3 641, аденовируса, человека типа 2 и плазииды рЛ)В 219, так же, каки Нхпй 111 ГЗ 3.Однако известные штампы патоген ны для человека, требовательны к обогащенньм питательным средам и продуцируют другие типы эндонуклеаз, что затрудняет выделение и получение чистого фермента. 20Цель изобретения - выявление штамма-продуцента, непатогенного ля человека, нетребовательного к питательный средам и селективно продуцирующего одну сайт-специфическую25 эндонуклеазу типа НиЫ 111.Штаим Вогдеге 11 а ЪгопсЬдверййса выделен от кролика, кдонирован по устойчивости к фагаи коклюшного и бронхосептикоэного микробов и хра- За нится в коллекции научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.акад,Н.Ф.Гамалеи под регистрационными номером 15.Морфологические признаки. Мел-. 35 кие подвижные овоидной формы коккобациллы размером 0,3-0,5 0,8-0,2 мки. При электронно-иикроскопичеоком исследовании выявлены латеральные жгу- тикие 40Культуральные признаки.Среде Ворде-Жангу (картофельно- глицериновый агар) . Колонии серого цвета, блестящие, с гладкими краями, через 24 ч достигают 1,0 мм в диа метре. Гемолиз не выявлен.Среда КУА (казеиново-угольный агар), Колонии серовато-креиового , цвета, вязкой консистенции, с гладкими краяии, через 24 ч достигают 50 1,0 им в диаметре, Пигмент не выявлен.Пептонный агар "Мясо". Колонии кремового цвета, вязкой консистенции, через 24 ч достигают 1,5-2,0 мм в диаметре. 55Жидкая питательная среда типа Коен-Уилер. Аэробные условия выращивания, Растет при покачивании, Среда 794 гне окрашивается. Микробная взвесь серовато-белого цвета.Физиолого-биохимические признаки. Усваивает .органические соединения. Оптимальная температура роста 33-36 С. В качестве источников азота, углерода и энергии используют аминокислоты.,Используют цитраты, Восстанавливают нитраты в нитриты. Характерна быстрая положительная реакция на уреазу (в течение 30 мин при комнатной температуре). Содержит водоспецифический бронхосептикозный агглютиноген 12. Культура хранится в лиофильно-высушенном виде.Штамм Вогйеге 11 а ЬгопсЬвергдса содержит эндонуклеазу ВЪг 1, аналог Нпп Ш.П р и м е р , Лиофилизированный штамм В.ЬгопсМвергсавысевают на среду КУА с 103 крови человека с последующим однократным пересевом в пробирки с той же средой, нобез добавления крови. После 24 чинкубирования при 35 С пересевали наматрицы со средой КУА, Микробнмеклетки смывали 0,85 -ным растворомхлорида натрия. Микробную суспензиюцентрифугировали при 7000 р, в тече"ние 20 мин при 2-4 С и промывалифосфоцеллюлозньвч (РС) буфером (10 мМфосфата калия, рН 7,0, 1 мМ ЭДТА,7 мМ меркаптоэтанола). Затем 10 гбиомассы суспендировали в 10 мл РСбуфера, содержащего 0,4 М ЯаС 1 и100 икг/ил лизоцима и разрушалиРедактор П;Горькова Техред Ж.Кастелевич Корректор М.СамборскаяПодписное Заказ 2909/6 , , Тираж 525 ВНИИПИ Государственного, - комитета СССР пс делам изобретений и открытий. 113035, Москва Ж, Раушская наб. д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 з 10407 против РС буфера и наносили на колонку Фосфоцеллюлозы (Р 11 "Жагшап" Англия), уравновешенную РС буфером с 0,05 М ИаС 1, н элюировали 100 мл градиентом 0,05-1,0 М ИаС 1 в РС буфере. Объем каждой, фракции 5 мл. Фракции, содержащие ВЬг 1, определяли так же, как при хроматографии на голубой сефароэе, Фермент элюировался в интервале 0,2-0,25 М ЯаС 1, О Активные фракции объединяли и диалиэовали против РС буфера, содержащего 0,2 М ИаС 1 и 507 глицерина. Полученный препарат (3 мл) имел удельную активность 2000 ед/мл. За единицу 5 активности принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг Фага 3 в течение 1 ч.Для идентификации последователь р ности, узнаваемой ВЬгЮ, проводили гидролиз ею.ДНК ФагаЛ, плазмид рВК 322 и рЯС 1 (несущей полный ге-ном ВЧ 40). Параллельно. проводили гидролиз указанньм тесторных ЛНК д 94 4эндонуклеазой Ндпй 111. Электрофореэ продуктов гидролиза в агаровньщ и полиакриламидных гелях показал, что ВЬг 1 гндролизует каждую из тесторньм ЛНК на фрагменты, полностью идентичные Ндпй 111-специфическим фрагментам. Следовательно, последователь 1ность нуклеотидов, узнаваемая ВЬг 1, идентична последовательности нуклеотидов, узнаваемой Ньпд 111.В результате обработки ВЬг 1-фрагментов ДНК 1, Т 4 ДНК-лигазой так же, как и в случае Нпд 111-фрагментов ДНК Ъ, приблизительно 903 материала превращалось в высокомолекулярную Форму. Следовательно, так же, как и в случае Ндпд 111-фрагментов, ВЬг 1-фрагменты ДНК имеют однонитевые."липкие концы".Таким образом, рестриктаза ВЬг 1 имеет сайт узнавания ААС СТТ, идентичный сайту узнавания прототипа Нпй.111, и может полностью заменить прототип во всех генно-инженерных экспериментах.