Способ получения антибиотической смеси

09) И 1) СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ НИ ЗОБР ЕН НП ТУ(21),2822004/3.01.84. Бюл. Р 4берт Л. Хэмилл и Марвинн (США)и Лилли энд Компани (США,5.779.9(088.8)КоггуЬв)с 1 1. ег, аг 191 п, Наце апйегдавоп Ргевв Б,-408атент Великобритании68, кл. С 2. А, 01.06,78 1 Ап 1 Ргоре Д1 ев,Р 151 у в у юо Фг тввгогазоьо ОООО ЛВ 7 ЮИО(54)(57) СПОСОБ ПОЛуЧЕ ЧЕСКОИ СМЕСИ, заключаю .что проводят кулътивир , ВСгерйовусев говеоврогв аэробных условиях на ;жащей источники углеро минеральных солей, с п делением отдельных комп ИЯ АНТИБИОТИийся В томуванне штаммав ЛАРРЬ 11379среде, содера, азота в фследующим выонентов смеси.18 1071226 Терпимость кдействию йаС 1,рост,до, Ъ 10 Таблица 7 Концентрация/диск, мг Класс А.6 Антибиотчк Макролид + Лактам + ЭритромицинЦеФалотинЛинцомицинНистатинПолимиксии ВСтрептомицинТетрациклицВанцомицин 30 ГликозидПолиенПейтид 100 ед 300 ед Аминогликозид + Тетрациклин + Гликопептид + 10 30+1 30 П р и м е ч а н и е. ф+ф - чув Некоторые характеристики Апроизводящего З,говеоврогцв ВВЖ11379 штамма отлцчаются от характе- ЗОристик З.гозеоврогцз. КультураАотличается от указанногоштамма по размеру спор, росту в морковной и картоФельной массе, терпимости к ИаС 1 и восстановлению нитрата.Зйгер 1 ошусев говеоврогцв - культура, используемая для полученияАантибиотиков, депонирована исоставляет часть комплекции сырьевой 4 ркультуры ИогЮегп Вед 1 опа 1 ВевеагсЬСепСег, О,Я. 0 ерагЬпепг ог Адг 1 сц 1-.1 цге, Адг 1 сц 11 цга 1 Вевеагсп Зегч 1 е 1,Реог 1 а, 1111 по 1 в 61604, откуда ее берут для использования под номером11379.Как и в случае других микроорганизмов, характеристики А-производящей культуры З 1 гер 1 овусев говеоврогцв ЯВИ 11379 могут подвергать"1ся изменениям. Так, например, искусственные варианты и мутанты штаммаИНВА 11379 могут быть получены в результате обработки различными мутагенами, такими как УФ-облучение,рентгеновское облучение, высокочастотные волны, радиоактивное облучение и обработка химическими веществами. В предлагаемом изобретенииможно использовать все природные иискусственные варианты и мутанты 60Згерощусев говеоврогцв ИВВЬ 11379,которые производят Аантибиотики.Культуральная среда используетсядля роста Ягерсощусев говеоврогцв 65 Антибиотическая чувствительностьантибиотиков представлена втабл. 7. ствителен (зоны ингибирования); ойчин (зон ингибирования нет) . ИВЖ 11379 и мсжет выбираться из большого числа сред. Однако в целях зкономии производства, получения оптимального выхода и легкости выделения продукта некоторые культуральные среды являются предпочтитель:ными. Так, например, предпочтительным источником углерода при крупно" масштабной Ферментации является тапиоковый декстрин, хотя можно использовать также глюкозу, Фруктоэу, галактозу, мальтозу, маннозу, масло хлопкового семени,метилолеат, глицерин, раФинированное соевое масло и т.п. Предпочтительным источником азота является знзнмно-гидролиэованный каэеин, хотя можно применять также растворимый мясной пептон,.соевую муку, соевый гидролизат, соевую крупу, дрожжи, аминокислоты, такие как Ь-.аспаргин и 0 Ь-лейцин, и т.п. Питательные неорганические соли, которые могут вноднться в культуральную среду, представляют собой растворимые соли, способные к образованию ионов калия аммония, хлорида, сульФата, нитрата и т.п. Среди укаэанных солей особенно полезным дляолучения антибиотиков является КЯО . Могут использоваться также мелассная эола вольный диализат и синтетические ьщнеральные смеси. Для получения 3,-21978 антибиотиков предцочктают использовать дистиллированную нли деионизированную воду в Ферментационной среде. Некоторые из минералов, содержащихся в водопроводной воде, например, таких каккальций и карбонат, не способствуют получению антибиотиков.В культуральную среду следует также нключать следовые элементы, необходимые для роста и развития организмов. Такие следовые элементы обычно 5 встречаются в виде примесей в других ингредиентах среды н количествах, достаточных для того., чтобы удовлетворить требованиям роста микроорга-. низма. Иногда при крупномасштабной Ферментации необходимо добавлять небольшие количества (например 0,2 мл/л) антивспенивающего агента, такого как полипрспиленгликоль, еслй нспенивание становится проблемой.Для производства значительных количеств Аантибиотиков предпочтительным способом является погруженная аэробная ферментация н резерву-. аре. Небольшие количества Аан тибиотиков могут быть получены куль туриронанием в змеевиковой колбе. В связи с запаздыванием времени при получении антибиотика, обычнд связанным с инокулированием больших резервуаров споровой формой микроорга низмов, предпочитают использовать вегетативный принивочный материал, который получают инокулиронанием небольшого объема культуральной среды.споровой Формой мицеллиальных 30 фрагментон микроорганизма с образованием свежей, активно растущей культуры микроорганизма. Затем вегетативный прививочный материал переносят н большой резервуар. 35А-производящий микроорганизм можно ныращивать при температурах, лежащих в интервале 20-37 С. Оптимальное получение АС имеет место в температурном интервале 40 30-32 С.Как правило, в процессах аэробнойпогруженной ферментации культуральной среды через нее диспергируют стерильный воздух. Для эффективного произ- . 45 водства Аантибиотиков процент насыщения воздухом при.проведении процесса в резервуаре должен иметь значение выше 20, предпочтительно выше 30 (при 30 С и давлении равном 1 атм). 50При Ферментации в резервуаре пред,почитают поддерживать уровень рН в ферментационной среде н интервале б,5-7,0. Такое регулирование может достигаться в результате добавления . 55 соответствующих количеств, например, гидроокиси натрия (на ранних стадиях цроцесса) .и соляной кислоты (на более поздних стадиях).За цолучением Аанткбиоти ков в ходе ферментации можно следить путем испытания образцов бульона или экстрактов твердого мицеллия на антибиотическую активность против микроорганизмов, чувствительных к дейст- у вию антибиотиков, Одним из микроорганизмов для испытания таких антибиотиков, является М 1 сгососсця 1 ц 1 еця. Биологический анализ предпочтительно осуществляют при использовании бумажно-дисковой методики на чашах с агаром.После получения в условиях погруженной аэробной Ферментации Аантибиотики могут быть выделены из ферментационной среды известными в этой области способами.Антибиотическая активность, полученная в ходе ферментации А-произнодящего, обычно содержится в бульоне. Поэтому максимум регенерации Аантибиотиков достигается в результате первоначальной фильтрации с целью удаления мицелиальной массы. Отфильтрованный бульон может быть оЧищен различными способами с образованием Асмеси. Предпочтительный способ заключается в экстракции и осаждении с образованием Асмеси.Дальнейшая очистка и разделение АС смеси и индивидуальных АС факторов заключаются в дополнительной адсорбции и экстракции, Подходящий адсорбционный материал для очистки АС смеси и факторов включает анионообменные смолы: сильнооснонные (полистирол, Био-Рад АС 1 и 2, Био-Рекс, Дауэкс 1 и 2, Амберлит 1 ВА 400, 401, 410), умеренноосновные эпоксиполиаминные (БиоРекс 5 и Дуолит АЗОВ) и слабоосновные полистирольные или фонольные полиамины (Био-Рад АОЗ, Дуолит А, А, Амберлит 1 ВА.68, 1 Н 45, щ 4 В), силикагель, флоризил, полимерные адсорбенты (ХАЭ 2 и 4), нысокопористый полимер (Диаион НР) . Сефадекс РСи 6-50, Био-Гель Ри Р, обратимо фазовые смолы (силикагель С 8 и Ся), углерод, ДЕАЕ целлюлоза и ДЕАЕ Сефадекс, полиамид, окись алюминия и микроцеллюлоза.Источники: био-Рад и био-Гель смолы - Био-Рад Лаборатории. Ричмонд, Калифорния; амберлит и ХАЮ смолы - НоИв апй Наая Со Филадельфия, Ра.; дуолитные смолы - 01 ащопй ЯИащгосК СИегп 1 са 1, Рейкой СЫу, Са 1.; сефадексовые смолы - РИагвас 1 а Р 1 пе СИеш АВ, 1)рряа 1 а Яыейеп; дуоксовые смолы - Вою СИейпса 1 Со., ММ 1 апй, М 1 сИ.; Диаион - МИяцЫяМ СИеппса 1 1 пйця 11 ея ЬЙ., ТоКуо, 1 арап. ХАР смолы силикагель С(ви Се = Е МегсК. Ранпя 1 аЖ, бегтпапу.С другой стороны, культуральные твердые вещества, включающие компо- ненты среды и мицелия, могут испольэонаться без экстракции и разделения, но предпочтительно после удаления воды, в качестве источника Аантибиотиков, Так, например, культуральную средуможно сушить лиофилизациейО 13 10 0,5 1,0 018 1,0 . 0,5 0,5 Ие 1 евег 1 а допогвЬоеае111076-4 ЯрО ЯТ 16 рО 4,0 4,0 ИТ И ИТ не испытаны.Минимальные ингибиторные концен- руют некоторые бактерии согласно ис трации, при которых АС смесьпытанню раэбавлением на агаре, суммии основные АС Факторы ингиби- рованы в табл. 9. Т а б л и ц а 9 Организм (аэробный) МИК, мг/мл есь 0,5 81 арпу 1 ососсцв ацгецв 3055 1,0 025 0 13 Огоцр 0 81 гер 1 ососсцв 282 0,25 2,0 1 О 0 13О 13 0,5 0,25 0,5О 2,0 1,0 0,5 ь 32,0 Ч 1 гЫапв 81 гер 1 ососсцв 16,0 32,0 Асмесь и индивидуальныеАС Факторы всегда находятсяв виде соли натрия, АиА"21978 С смеси и индивидуальныеАС антибиотические ФакторыСо С С С С 4 и Сингибируют Одним иэ важных аспектов изобретения является тот Факт что Аантибиотики ингибируют рост микроорганизмов, являющихся устойчивыми по 60 отношению к другим антибиотикам. рост некоторых патогенных микроорганизмов, особенно грамположительных . бактерий. Минимальные ингибирующие концентрации (МИК), при которых АФакторы и АС .смеси ингибируют выбранные бактерии согласно установленному стандартному испытанию разбавлением на агаре, суммированы в табл. 5.Т ал и ц а 8 В табл, 10 суммированы значения МИК разбавлением на агаре)АС Факторов С 4 р С 1 С 2 р СуС 4и С про тив некоторых микроорганизмов при использовании методик разбавления на агаре (10) .1 11 1 111( 1 1 1 1 ГЧ ОО ОЪ СЧ Ом с о о л а (Ч ьЮ о ъ о Ю л Ф й 0 о ол4. Ою Ф . 4 41 с1 1 11 11 111 11 111 о л о ъ л л фФ 1ц О Э оо о а 44 (ч О( А Э Ф ф Л ф 4 н эо З И О ОЪ йф йР Ф о оо мо оооо охх хох 1 ф Э26 25 1071226 АС антибиотики также инги- факторов С, С, и С против.различбируют рост некоторых аэробных бак- . ных анаэробных бактерий при испольтерий. В табл. 11 суммированы актив- . зовании стандартного испытания разности АС смеси и АС бавлением на агаре.Т а б л и ц а 11 МИК мкг/мл Испытуемый организм С.( С 2 Смесь 1,0 1 0 1,0 0,5 1,08 . 8 1,0 0,5 8 1 О 1 08 4 1,0 0,5 1,0 2 0,5 8 КцЬасйег 1 цп( аегойас 1 епв -Рергососсцв авассЬаР;го 1 д 11 сцв 2 1 0 1,0 (0,5 0,5 1,0 1,0 2 0505 РерСососсця ргеуоИ. Рер 1 оя 1 герососсцвапаегоЬця 0,25 2 1,0 1 О 0,25 0,25 1,0 Рерйоягерососсцв1 п 1 егп(ей 1 ця 2 4 1,0 0,5 1,0 0,25 1,0 Ргор 1 оп 1 ЬасСег 1 цш аспея 1Вас 1 егоЫев Ггад 111 я .128 8 2 1,0 0,5 О,25 Я 28 Я 28 128 И 28 128 128 РцьоЬасег 1 цп( Яуп(Ь 1 овцБ 128 У 128 16,АС Факторы демонстрируют 1 п у 1 чо антибактериальную активность против экспериментальных бактериальных инфекций. В том.случае, когда две дозы испытуемого соединения применяют на мымах, иллюстрирующих инФекции, наблюдаемую активность измеряют как ЕОО значение (эффективная1071226 28 27 Продолжение табл, 12 8 Сгер 1 осрссцв руоцепеа Яйгер 1 ососсца Антибиотик рпецшоп 1 аеЛ Г ее еж МТС ЕРШ ЕРШВИХС ЕРФШШЕМЕЩ М 1 С 1АС АС .4 АС 0,88 0,5 0,25 0,16 13 0,10 0,5 0,36 0 06 0,053 0,17 0,06 0,18 0,03 0,043 АС смесь 0,13 0,13 0,10,5 Эритромицин 0,13 0,13 0,64 7,3 0,5 А 21978 С Факторы .и АС25 смесь являются эффективными агентами для лечения пиелонефритов. Так, например, при экспериментальном передаваемом по наследству заражении пиелонефритом у крыс Афакто .ры обеспечивают защиту от укаэанного заболевания, которая превосходит действие ваномицина. Вданном. случае применяют бактериальную куль": туру .Зсгерйососсцв Йаеса 11 в(601 Е), .З 5 которую выращивают на ТгурЫсаве. соевом .агаре (ВВИ, суспендируют в сердечно-мозговом бульоне для вли- вания(ВВЬ), взятом 0,2 мл порциями и .замороженном в жидком азоте. Бак-. 4 О . териальные суспензии для инокулирования крыс готовят ежедневно путем эасеивания 60 мл колб ТгурЮсаве .соевым бульоном (ВВЬ) иэ заморожен ных ампул и выращиванием культуры в течение ночи при 37 С при встряохивании, Культуру разбавляют до кон+ центрации 5 -10 э колоний-образующих единиц на 1 мл. Испытуемые соедине-. ния вводят подкожно раэ в день в течение 7 дн. Все соединения суспен дируют. в 0,125-ном растворе карбо- ксиметилцеллюлоэы.Экспериментальное инфицирование крыс пр 6 водят по следующей методике. Самок. случайно подобранных белых . Якрыс (Сох-Ю 3.враг) весом 190-210 г. анестеэируют путем внутрибрюшинной иньекции 12 г метогекситала натрия: Экспериментальную модельпиелонеф- рита основывают на исследовании Оцве щ и Вцвоп, согласно. которому левый мо 81 арЬу 1 ососсцв ацгеце 2 ЕРМО1ЯИК, мг/мл, разбавление на агаре.2ЭМИК, подкожное применение.МИК, оральное применение. 5 Е т4 и ВЕ Е четочник закупоривают на 20 мин, после чего в бедренную вену вводят0,.5 мл иснытуемого организма., Антимикробиальную терапию начинают через 4-5 ч после инфицирования. Через 4 ч после последнего лечения. крыс умертвляют и левую почку удаляют и гомогенизируют в диспергирую-. щем устройстве Пиа 11, содержащем 9 мл физиологического. раствора. Такая обработка. представляет собой 10 разбавление ткани почки. Дополнительное десятикратное разбавление основано на ожидаемом количестве бактериальных клеток, присутствующих в ткани гомогената. Наконец, некоторые образцы сделанных разбав" лений помещают на дублированные чаши с агаром, которые инкубируют в . течение ночи при 37 С. Терапевтические результаты выражают двумя путямиг (Х) процентом крыс, почки которых.насчитывают менее 10 на. 1 г почечной ткани, обозначаемые как фвылеченные.ф, и-.(11) процентом крыс с по крайней мере 4-1 одо понижением бактериального титра йо сравнению с инфицированными контрольными поч- . ками,. Контрольных крыс обрабатывают 0,125%-,ным раствором карбоксиметилцеллюлозы. Число жизнеспособных клеток почечной ткани у контрольных крыс зараженных 8. Гаеса 1 з.в, лежит в интервале 1,2 х 108-4,6 х 108 на 1 г гомогенизированной ткани.. Результаты данных исследованийсуммированы в табл. 13.Зо 29 1071226 Т а блица 13 Дозировка длякрыс мг/кгх 7 крыс с4-1 одо пониженйемтитра,вылечившихсякрыс,. Ъ МИК,мг/мл Антибиотик 12 0 33 55 ВанцомицинАСАСАС 3 1 0 0 50 0,25 100 89 1 0 0,13 1,0 78 78 АС комплекс 0,25 1,0 89 Хп ч 11 го восприимчивость Я. Хаеса 11 з Оцае штамма.1 Подкожное применение,Т а б л и ц а 14 г/кг АС Мыши Крысы 50 70-75 160 175-190 169+10 Смесь 150 Т а б л и ц а 15 Концентрация, г/т Улучшение, В КормприростКонцентрациякорма, г Улучшение, В Прирост веса,. г Эксперимент Обработка 77 З1,741 Ш 734 410 750 414 КонтрольАС 25 1,80 431 Данные по токсичности основныхАС факторов и АС смесисуммированы в табл. 14Фактор С 250 365 479+32 д С 150-250 175 204 т 17 В том случае, когда в качестве антибактериального агента используется АС смесь или АС фактор, последние можно применять орально или парентерально.АСсмесь или фактор обычно может при"меняться совместно с фармацевтичес- ЗО ки применимым носителем или разбави-.телем, Дозировка А"21978 С смеси илифактора зависит от большого числаобстоятельств, таких, например, какприрода и тяжесть особого инфицирования, подлежащего лечению. Соответствующие дозированные интервалыи/или дозировочные единицы для применения могут быть определены на основании значения МИК и ЕО , а такжеданных по токсичности, рассматрива- "О емых совместно с такими Факторами,.как пациент или хозяин, а также инфицирующий микроорганизм, А антибиотики могут использоватьсятакже в качестве агентов,.промоти рующих рост животных. Так, например,у цыплят А"21978 смесь увеличиваетприрост веса и эффективность потребления пищи. В табл 15 суммированырезультаты двух испытаний, демон стрирующих такую активность.1 8 1,665 423 704 КонтрольАС 25 683 1,582 4,99 2,12 432 П р и м е ч а н и е, Значение в об аботкех 100 а улучшения,значение контроля В данных испытаниях АСсмесь вводят в пищу животных с кон"центрацией 25 г/т пищи, Антибиотикдают четырьмя повторениями восьмиптицам, при этом каждой проводятдублированное изучение во временипо сериям (всего восемь повторенийна восьми птицах или 64 птицы) . Пернод испытаний составляет 21 деньот 7 до 28 дня жизни птицы, Данныепо повышению эффективности роста(прирост веса, потребление пищи иэффективность питания) сравниваютданными, полученными при 40 повторениях одновременной контрольнойобработки.Обычно Аантибиотики эффективны при промотировании ростадомашней птицы в том случае, когдаих применяют совместно с пищей животных в количестве 1-100 г А антибиотика на 1 т пищи животного.П р и м е р 1: ФерментацияАС в колбе со встряхиванием.Лиофилизированную гранулу 81 гер 1 о-.вусез гоэеоерогцз ЮРАСЬ 11379 растворяют в 1-2 мл стерилизованной воды.Полученный раствор используют дляинокулирования косого агара, имеющего следующий состав,.- Ъ;Глюкоза ,0,5Дрожжевой экстракт 0,2СаСОЗ 0,3Овощйой сок20,0Агар 2,0Неустановленное значение рН равно 6,1; значение рН после автоклавного процесса 5,9,У/8 сок, СаврЬе 11 Яоцр СоИнокулированный скос инкубируютпри 30 С в течение 70 дн. Зрелуюкультуру на косом .агаре заливаютстерильной деионизированной водой(10 мл) и отскабливают стерильнойпипеткой для того, чтобы ослабитьспоры. Часть (1 мл) полученныХ врезультате суспензии спор используют для инокулирования вегетативнойсреды, имеющей следующий состав, %:ТгурСсазе соевый бульон 3,0 .Декстрин 2,5Вода (деионизированная)Ва 11 воге В 1 о 1 од 1 са 1 ЬаЬ.,СосИецч 111 е, Мй,Инокулированную вегетативную.среду инкубируют в 250 мл эрленмейровской колбе при 30 С в течение48 ч во встряхивающем устройстве,вращающемся через дугу диаметром5 см со скоростью 250 об/мин.Такую инкубированную вегетативную среду (0,5 мл):используют для20, инокулирования 50 мл продукционнойсреды, имеющей следующий состав,г/л:Глюкоза 7,5Тапиоковый декстринф 30,0Энзиматический гидролизат25 казеина 5,0Энзимно-гидролизованный,казеинф+ф 5,0К 2304. 174Аспарагин безводный 1,3230 Деионизированная вола До 1 лБачабек 11, А.Е. 81 а 1 еу, Со,ОесаСцг, 111,НЬ Авве А, ЯИеГЕ 11 д СИеппса 1Со, М.1.З 5 "АвЬег ЕНС, АвЬег ЬаЬ., 1 цпеац,Юзс,Инокулированную продукционнуюсреду инкубируют в 250 мл эрленмейеровской колбе при 30 С в течение40 6-7 дн. в шейкере, вращающемся через дугу диаметром 5 см со скоростью 250 об/мин.П р и м е р 2, Ферментация в резервуареА. 21978 С, С тем, чтобыполучить больший объем прививочно 45го материала, 10 мл инкубированнойвегетативной среды используют дляинокулирования 400 мл среды во 2-йстадии вегетативного роста, имеющейтот же состав, что и вегетативнаясреда. Такую среду на 2-й стадии инкубируют в 2 л колбг в течение 48 чпри 30 дс в шейкере, вращающемся через дугу диаметром 5 см со скоростью 250 об/мин,55 Инкубированную вегетативную среду на 2-й стадии роста (800 мл).используют для инокулирования 100 л.стерильной продукционной среды, имеющей тот же состав, что и в приме 60 ре 1, Инокулированную продукционную среду Ферментируют в 165 л Ферментационном резервуаре в течение6-8 дн. при 30 С. Ферментационнуюсреду аэрируют стерильным. воздухом65 под давлением 1 атм с тем, чтобы226 34135 л) . Активный материал элюируют0,5 н. уксусной кислотой, собираютприблизительно 120 л фракции и каждую иэ них испытывают на биологическую активность.Высокоактивные Фракции -объединяют и сушат на холоде с образованием278 г Асмеси, имеющей коричневую окраску. (1100 ед./мг). Фракции, имеющие низкую активность, О объединяют с образованием 238 г коричневой АС смеси (880 ед./мг)Дальнейшая очистка АС смеси. Часть более активной АСсмеси (150 г), элюированной с колонки с 1 ВА, суспендируют в воде(600 мл), рН поддерживают равным6,5 с тем, чтобы полностью раство"рить суспендированный препарат, идобавляют достаточное количествосухого силикагеля (Огасе, сорт 62)с тем, чтобы абсорбировать водныйраствор. Такой влажный силикагелевыйпрепарат помещают в 30 л силикагелевую колонку (Сгасе 62,10 х 375 см),обработанную ацетонитрилом(силикагель предварительно промывают водойс целью удаления мелких частиц, затем колонку набивают силикагелем,суспендированным в воде, и силикагелевую колонку промывают 30 л ацетонитрила). После нагрузки колонкупромывают ацетонитрилом (15 л), затем проявляют смесью ацетонитрилвода (4:1) и собирают 4 л фракции,За ходом злюирования следят с помощью биологического анализа, снимая силикагелевую ТСХ (СН СИЙ 20/3:1)биоавтограмму. Фракции, содержащиелишь АС смесь (фракции 43-60),объединяют, концентрируют в вакуумеи сушат на холоде с образованием86,2 г желтоватого очищенногоА 21978 С комплекса (1160 ед./иг) .Фракции 21-29, содержащие факторы0 и С, объединяют и сушат на холоде с образованием 13 г желтоватогопорошка, обладающего низкой биологической активностью.Полученную таким образом очищенную АС смесь (30 г) подвергают дополнительному обеспечиваниюпутем суспендирования 30 г смесив минимальном количестве воды и,смешивания с небольшим количеством еиликагеля (тип Р, 10-20 мкм Яиапгцш1 пйизСгея, 341, Кар 1 ап ОгШе, Ра 1 гй 1 е 16, 0.1. 07006) с целью абсорбциираствора. Влажную силикагелевую смесьсуспендируют в смеси ацетонитрил: метанол (4:1) и заполняют ею стеклянно-свинцовую колонку(внешний диаметр4 х 30 см), присоединенную к стеклянной колонке (внешний диаметр 4 х 30 см),содержащей 2,8 л силикагеля, Суспендированный в смеси ацетонитрил:метанол (4:1) силикагель предварительно промывают водой и затеи смесь зз 1071 поддерживать 30-ное насыщение воздухом при перемешивании общепринятыми мешалками со скоростью 200- 300 об/иин.Разделение АС антибиотической смеси, Весь ферментационный 5 бульон (1600 галлонов), полученный по примеру 1, Фильтруют на фильтровальном прессе с использованием 3 фильтрующего средства (целит 545, 1 оппв Мапч 111 е) . Осадок на Фильтре промывают водой с образованием Филь- трата в количестве 4100 л, имеющего концентрацию 230 ед./мл, рН фильтрата поддерживают равным 3,5 с помощью НС 1 и подкисленный фильтрат выдерживают при комнатной температуре в течение 16 ч с целью осаждения активных факторов. В суспензию добавляют фильтрующее средство (О,75 целита 545), полученный осадок отделяют фильтрацией. Осадок на фильтре 2 О экстрагируют дважды 410 л метанола, каждый раз перемешивая в течение 1 ч перед фильтрованием, К объединенным метанольным экстрактам (720 л) добавляют воду (0,1 объема .или 72 л) . рН этого раствора поддерживают равным 6,5-7,0 с помощью МаОН. Полученный раствор концентрируют в вакууме до 1/20 объема (30 л) с целью уда" ления метанола, в Моде концентриро- ЗО вания по мере надобности добавляют дистиллированную воду, При перемешивании добавляют н-бутанол (3/4 объема или 22 л). рН полученного в ре" зультате раствора поддерживают рав ным 3,0 с помощью НС 1, фазы разделяют и н -бутанольиую Фазу, содержащую активность, концентрируют в вакууме до остатка. Этот остаток растворяют в минимальном количестве метй р иола, метанольный раствор добавляют в ацетон (30 объемов с целью осаждения основной части АС, Осадок отделяют .фильтрацией и сушат с образованием 247 г сырой 45 АС смеси (780 ед,/мг) .Метанолацетоновый фильтрат, содержащий оставшуюся часть Асмеси (фактор А и В), концентрируют до остатка, который растворяют в трет-бутаноле: НО (5:1) и сушат на холоде с образованием 169 ГА смеси../П р и м е р 3. Очистка Асмеси. Сырую Асмесь (734 г), полученную по примеру 2, суспендируют в воде (25 л), рН суспенэии устанавливают равным 6,5 с помощью 5 н. НаОН с тем, чтобы полностью растворить материал, Этот раствор пропускают через колонку, содержа щую 27 л ионообменной среды (ацетатный цикл смолы (1 ЯА, йо)ип Наав Со), Колонку промывают водой (4 объема или 108 л) и затем 0,1 н. уксусной кислотой (5 объемов или 65107122 б б 5 Изобретение относится к получению антибиотических Асмесей,главным образом к получению смесиАС, содержащей микробиологически активные родственные факторыСц , С, С, СЗ, С и Су. Смеси 5Аи АС получают погруженной аэробной ферментацией штамма11379. Индивицуальные АС факторы разделяют и выделяют хроматографией. Аи АС смеси, 10АС факторы и их фармацевтически применимые соли представляютсобой антибактериальные агенты и способствуют росту домашней птицы.АС смеси представляют собой родственные кислотные пептидныеантибиотики. К данному классу антибиотиков относятся кристалломицин,амфомицин, заомицин, аспартоцин иглюамицин 113.Среди укаэанных антибиотиков,как полагают, церексин А, церексин Ви бревестин являются антибиотикаминаиболее родственными новый АСантибиотиками.: Известен способ получения антибиотической смеси, включающий культивирование штамма 5758 или 8092 вкультуральной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, в азробных условиях до З 0достижения значительной антибиотической активности 2 1.Однако антибиотики, полученныеданным способом.,не обладают ростостимулирующей активностью для домашних птиц.Цель изобретения - расширениеассортимента антибиотиков.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу получения антибиотической смеси проводят культивирование штамма ЯСгер 1 ощусев гозеозро гцз ЯРРИ 11379 в аэробных условиях насреде, содержащей источники углерода,азота и минеральных солей,с последую щим выделением отдельных компонентовсмеси.П р и м е р. Фактор С А обозначен как смесь АС. Солисмесей Аи АС, а такжеиндивидуальные А.факторы Со,С 1 С, С, С 4 и С составляют частьизобретения.В АС смеси Факторы С, С. и С являются основными, а ФакторыС, С 4,и С - факторами, присутствующими в небольших количествах.Антибиотические вещества, полученные по предлагаемому способу,произвольно обозначены как Аантибиотики. Термин Аантибиотики применяется в целях сокращения с тем, чтобы обозначить А 21978и АС смеси, АфакторыСоф С , Сг С 4 и С, а также их Фрмацевтически применимые соли.Предлагаемый способ обеспечивает получение Аантибиотической смеси в результате погруженной аэробной культивации щтамма 81 герйощусев гозеозрогцз БРРАЛ 11379 или его Апроизводящего мутанта, а также антибиотической смеси АС и факторов Ср, С, С , СЗ и С , которые являются ее компонентами.Изобретение предусматривает также способ получения Асмеси, .который заключается в культивировании штамма 81 гер 1 овусез гозеоэрогцз ЫРРА 11379 или А-производящего мутанта в культурной среде, содержащей ассимилируемые источники карбогидрата, азота и неорганических солей, в условиях погруженной аэробной ферментации до получения .значительного количества антибиотической активности.После получения достаточного уровня антибиотической активности Асмесь отделяют Фильтрацией Ферментационного бульона, понижают рН Фильтрата до значения ниже 3, дают смеси осаждаться и полученную смесь отделяют Фильтрацией. Выделенную смесь можно подвергнуть дополнительной очистке с помощью зкстракционной техники. Для выделения индивидуальной А. С и факторов необходимо использовать хроматографическое разделение. Аантибиотики Мнгибируют рост патогенных организмов, особенно грамположительных бактерий.На фиг. 1-7 представлены ИК-спект- . ры (таблетки КВ) следующих АС антибиотиков (в виде натриевых солей): Фиг. 1 - Асмесь 1 фиг.2- АС Фактор С,; Фиг. 3- АС фактор С ;фиг,4 - АСфактор С, фиг. 5 - АС фак% ф тор Со, фиг. б - Афактор С 4,. фиг, 7 - АС фактор С.АС факторы представляют собой родственно связанные цептидные антибиотики. В результате ферментации.регенерируется до шести анэибиотических факторов и образуется Асмесь. Индивидуальные Факторы Со, С 1, С, СЗ, С, и С выделяются в виде индивидуальных соединений.Афакторы представляют собой родственно связанные кислотные, циклические полипептидные антибиоти-. ки, несущие жирно-кислотную ациальную группу при концевой аминогруппе. При гидролизе каждый из Факторов образует следукщие аминокислоты, моль:Аспартовые кислоты 4Глицин 2Алании 1Серин 1Теонин 1Триптофан1(55; 10: 35), содержащая 0,2 НОАСи 0,8 пиридина.Вода: метанол:ТГФ(52 р 5:15:32,5),содержащая 0,6 формиата аммония,Вода: метанол: ТГФ(50: 15: 35),содержащая 0,6 формиата аммония,Преимущество системы уксуснаякислота (пиридин по сравнению с формиатом аммония) заключается в том,что первая может быть удалена в ходе сушки вымораживанием, тогда какформиат аммония следует удалять ко=лонной хроматографией (СефадексС).Переменное удаление АСсмеси. Весь ферментационный бульон(9 л), полученный по примеру 1,фильтруют с помощью фильтрующегосредства (Гифло Супер-гель) . Полученный н результате фильтрата раствор (80 л) перемешивают с 2 л неионного макропористого сополимера стирола, поперечно сшитого с дивинилбензолом НР(ионообменная смола.Ю 1 вцЬ 1 зМ СЬев. 1 пй, Ь 1 в, (Токио,Япония) в течение 2 ч. Верхний слс.Ъдекантируют полученную. смолу промывают водой (8 л),. а воду также де"кантируют. Затем смолу перемешиваютс 8 л смеси ацетонитрил: вода (15:85)в течение 15 мин, а растворительудаляют фильтрацией. Затем АСсмесь элюируют со смолы путем перемешивания с 8 л смеси ацетонитрил:вода (2:3) в течение 1 ч и фильтруют. Такую методику повторяют до пол;ного удаления АС смеси. Ука". з анные два фильтрата объединяют и концентрируют в вакууме до образованиямасла, Полученное масло растворяют вминимальном объеме воды, добавляютметанол (2 объема) при нагревании,5а затем - ацетон (30 объемов) дляосаждения АС смеси. Осадок отделяют фильтрацией и сушат в ваккумес с образованием 13,6 г сырья АСсмеси (570 ед,/мг),Сырую АС смесь очищают10 силикагелевой колонной хроматографией, Полученную смесь (1 г) растворяют в минимальном количестве воды,силикагель (Огасе) добавляют дляабсорбции воды, абсорбент шламуют15 в ацетонихриле. Полученный шлампропускают через колонку 1,5 х 40 см ссиликагелем (вегасе) в ацетонитриле. Затем колонку промывают ацетонитрилом. Активность элюируют смесьюацетонитрил: вода (4:1), отбирая25 мл фракции. Фракции анализируютаналогично примеру 3. Фракции 21-46,содержащие большую часть АСсмеси, объединяют, концентрируют донебольшого объема в вакууме и сушатна холоде с образованием 605 мг очищенной АС смеси (Иа соль)(900 ед,/мг) .Получение АС смеси (кислотная .форма) . АС смесь в виЗО де соли натрия (7 г) растворяют вводе (150 мл) и добавляют н-бутанол.(156 мл). рК раствора поддерживаютравным 3,4 с помощью 2 СНЫ при перемешивании в течение 1 ч. Н -Бута 35 нольную фазу отделяют и концентрируют до получения остатка в вакууме.Полученный остаток растворяют в воде и сушат на холоде с образованием6 г АС смеси (кислотная фор-ма) . Индивидуальный АС фактор в виде соли превращают в соответствующие кислотные формы по такой же методике.Получение АС смеси в виденатриевой соли из АС смеси вкислотной форме. АС смесь вIкислотнойформе (50 мг). растворяютв теплом абсолютном этаноле (5 мл),по каплям добавляют 1 н. раствор50ИаОН до достижения раствором рН равного 9,4. Полученный в результатераствор выдерживают при комнатнойтемпературе в течение ночи. Затейосадок Фильтруют и сушат в вакууме собразованием 32 мг АС смеси55 (натриевая форма). Полученная сольсодержит 8 натрия согласно атомноабсорбционному анализу.Используя методику, указаннуювыше, АС смесь в виде солибО кальция получают добавлением СаС 1в этаноле к этанольному растворуАС смеси в кислотной форме.Микробиологический анализ А Ферментационньх и выделенных образцов. Для количественного определе39 1071226 ния активности Ав ферментационном бульоне и в выделенных образцах используют систему бумажных дисков для определения диффузии на агаре при применении М 1 сгососсцэ Си1 ецэ. 5Засеянные. агар-диффузионные чаши готовят путем инокулирования питательной агаровой среды соответствующей концентрацией испытуемой культуры переливая 8 мл агара в каждую 10 иэ пластмассовых чаш Петри (20 х х 100 мм).Ссылочным стандартом этого ана- лиза служит получение Асме 4си, которое используют в расчете на единицу активности. Высокоочищенная Асмесь содержит около 1250 ед./м. В результате получают кривую отклику стандартной дозы, содержащей 150-75-40-20-10 ед./мл, В качестве разбавителя для стандарта и образцов применяют 0,1 М Фосфатный буфер, имеющИй рН равный 6,0Растворы образца и стандарта переносят на 12,7 мм бумажные диски с помощью автоматической пипетуи. Инкубирование проводят при 30 С в течение 16-18 ч.1071226 ИВУ ЯЮ ЭО ИФВЭ фУ Р Редакто Заказ 11726 5 ВНИИПИ по де 35, Мослиал ППП Патент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 РХ Л 1 ж 8 Р О й 7 Л 7жал ою Составитель А. Макаровкулинец Техред С,мигунова Корректор С. Шекмар Тираж 522 Подписиосударственного комитета СССРам изобретений и открытийва, Ж, Раушская наб д. 4/5"Одной из них является аспаргин.ф+Может образовываться из 3-метилглютамина,Каждый из АФакторов содержит жирную кислоту.В табл. 1 суммировано содержание углерода и приведена идентификация жирных кислот, содержащихся в каждом из факторов АС.- г - т 10-Метилдодекановая кислота 5,С 410С Таблица 1 8-Метиллеканова кислота 10-Метил ундекано вая кис лота Тйг-Мо -Огп-Азх-АОо-Азх-Мз-Бег-МеСРк- Кьо 1 23 Н с - и -Тгр -Аз О Н ИС Н С-й - 11 25 гЮУ-Ого-Азх-АДа-Ая-Азх-ЬРоег-Ме Мх- Кмо а Н - специаль кислоты, приче пы.АС ф щее значение Энзимный гидролиз Афакто- а С при использовании карбокси 2ептидазы У подтвердил, что кинуреин представляет собой С-концевую аминокислоту и С-концевая СООН-груп а может этерифицировать гидроксиль ую группу треонинового Фрагмента.Основываясь на вьпае приведенных анных, предполагается следующая труктура АС антибиотиков ый Фрагмент жирной специальные Н-групкторов имеют следую 4 е аноил С40 10-Метилундеканои 0 илдодеканоаноил + С-Ал С-Ал сила 3. Р-А)а Ф Ь-А 8 р Ь-Огп-3-метилглютамовую ки Реакции деградации Эдмана показывают, что триптофан представляет собой К-концевую аминокислоту, а фрагмент аспартовой кислоты - следующую соседнюю аминокислоту.Газово-хроматографическое и масс спектральное исследование АСфактора С 2 показывает, что одна из .следующих формул может описывать структуру этого Фактора (Азх обозначает аспартовую кислоту или аспаргин, а МеС 1 х - 3-метилглютамовую кислоту или 3-метилглютамин) фНе идентифицировано,1АС смеси и факторы (в виде натриевых солей) растворимы в во 50 де и в ки, х щелочи , растворахза исключением растворов со значениями рН 3,5,в нижних спиртах, такихкак метайол, этанол, пропанол и бутанол, а также в диметилформамиде,диметйлсульфоксиде, диоксане и тетрагидрофуране; но лишь незначительнорастворимы или совсем нерастворимы вацетоне, хлороформе, диэтиловом эфире, бензоле, этилацетате и углерод 60 ных растворителях, Солевые формыАС смеси и факторов растворимы -в воде, метаноле, диметилформа"миде и диметилсульфоксиде, но нестворимы в таких растворителях,к этанол бутанол и диоксан1071226 евой соли каждого из АС факторовТаблица 2 В табл, 2 сумчирован приблизительный элементарный состав натриВычислено Найдено Вычислено Найдено Элемент Вычислено Найдено 52,07 52,47 593 12,73 25,84 13 52 2 бр 06 13,38 26,19 Натрий(по разности) 139 140 2,0 1,38 2,56 ПРодолжение табл, 2 Вычислено Найдено Вычислено Най 2 ф 7 глер),0 1 0 В табл. 3 сУммированы наиболеезначйтельные абсорбционные максиммы для каждого из этих веществ,Т а б л и ц а 3 смеси и факв таблеткахиг. 1-7. ИК-максим М АС смесь С О3310 . 3320 3040 3050 3300 30 305 30502910 3040 304 2910 91 2910 92 2910 2840 2840 2840 1650 1650 1665 835 285 2840 655 50 1655 1540 535 153 1535 152 Углерод 52,61 Водород 6,07 Азот 13,63 Кислород 26,28 ИК-спектры А"21978 торов (в виде На соле из КВ представлены н 53,44 54,18 6,28 6,35 1329 13,34 25 рбЗ25,06 53,17 51,87 бф 21 6,05 13,41 13,66 25,84 25,861071226 Продолжение табл. 3Ф ИК-максимумы, см " с,С 2 .С 3 ба с 5 АС смесь о 1450 1445 1450 1395 1395 1450 1455 1445 1450 1385 1395 1395 1395 1400 1310 1225 1220 1240 1215 1225 1160 1155 1160 11.601160 1065 10.65 1055 1065 1060 735 745 745 745 745 745 740 645 555 518 Приблизительные молекулярные весаи молекулярные формулы трех основ- .ных АС факторов суммированы 30в табл. 4.Т.а б л и ц а 4 Продолжение табл, 5 Е, /см 31, нм 35ч 2 оо 1 Ь 27 90 3 3 2 Со 3 33 163 Э 102 16 27 7 а оа ь 7 40С Н И 8 С 7 Н,ЩИЬ 027 б.ированы данные титрования, о дном растворе ля трех основн акторов и Асоли), рК энач 5,7; 5,9; 7,5,8; 5,93; 7б абсорбциФ-абсорбфакторов альном ммированы спектров У х Ай) в нейтр 7 в о 5,621 7 меньшие ы при Т а лиц делениядены вращен соли),о(Ф м+11 9 о (с 0 +16 9 (с.О 60300 0 7 2 4;. Н 27; Н7; Н 2 62 2 2 С 4 С 5 2 0 В табл. 5 онные максим ции трех осн (в форме Яа этаноле. 1215 1220 1155 1160 1060 1065 Ниже сумм рического6-ном во рмамида, д1978 С ф форме 1 а С Смесь Все имею 15-12,+фДва опрНиже прив акторов (На ении в воде ых78 С смесиения:27 7,6АС факторы могут быть разделены методом жидкостной хроматографии при повышенном давлении (НРЪС) с использованием следующих условий:колонка: стекло, 1 х 21 см;набивка: силикагеАь (С 8 Яцапйищрастворитель: вода: метанол: ацетонитрил (95:ЗО:75)содержащий 0,2 уксусной кислоты и 0,2 пиридинаудетектор УФ при 285 нмдавление 100 фунт/дюйм.Времена удерживания для АС факторов (Ба соли) суммированы в табл. 6,0,710 640,56СЗО 470,63 10С 0,53АС факторы и АСсмесь устойчивы в растворах имеюощих рН 2-9, при 5 и 25 фС в течениепо крайней мере 7 дн. Они неустойчи вы при рН равном 11 через 4 ч (полная дезактивация) как при 5, таки при 25 фС.АС и Асмеси, а .также индивидуальные АС факторы 20 Со С С Сэ С 4 иС способны кобразованию солей. Эти соли используются, например, для разделения иочистки смесей и индивидуальных факторов, Кроме того, особенно, ценными 25 являются Фармацевтически применимыесоли, у которых токсичность соединения пд отношению к теплокровнымживотным не превышает токсичности не"солевой Формы 1Аантибиотики содержат допяти свободных карбоксильных групп,которые могут образовывать соли, поэтому изобретение охватывает неполные, смешанные и полные соли такихсоединений. При получении укаэанныхсолей следует избегать значений рНвыше 10 из-за неустойчивости антиби,отиков при таких значениях рН.Аантибиотики содержат также две свободные аминогруппы и по" О этому могут образовывать моно- и дисоли присоединения кислот. Особенноценными являются фармацевтическиприменимые соли щелочных и щелочноземельных металлов, аммиака, а также, 5 соли присоединения кислот. Примерами таких солей щелочных и щелочноземельных металлов антибиотиковАмогут служить соли натрия,калия, лития, цезия, рубидия, бария,кальция и магния. Подходящие аминныесоли Аантибиотиков включаютсоли аммония, первичные, вторичныеи .третичные соли С(4-алкиламмонияа также гидрокси - С -алкиламмониевые соли. В качестве иллюстрацииаминных солей можно привести соли,;полученные по реакции Аантибиотика с гидроокисью аммония, метиламином, втор, бутиламином, иэопропиламином, диэтиламином, диизо- бО пропиламином этаноламином, триэтиламином, З-,амино-пропанолом и. т.п.Соли Аантибиотиков, в которых катионами служат щелочные и 65 щелочно-земельные металлы, получают Таблицаб А фактор 6 1663 10 13 1246 803 3АС смесь может быть отделена от факторов АА, В,.и Е при использовании силикагелевой тонкослойной хроматографии, Предпочтительной системой растворителей 4 является смесь ацетонитрил: вода (3:1), а предпочтительным способом детектированияявляется биоавтограФИЯПриблизительные значения й (дан ные хроматографии указанных АС Факторов (в виде На солей) приведены ниже: ремя, Биоаналиэ (МХсгоин соссцз 1 ц 1 еца)единица/мг А 0,66В 0,57С смесь 0,31Э 051Е 0,48Факторы АС смеси могут быть отделены друг от друга с йспользованием силикагелевой Т С с обрати" мой фазой (Яцап 1 цв сз) . предпочтительная система растворителей представляет собой систему вода."мета- нол:ацетонитрил (45:15:40), которая содержит 0,2 пиридина и 0,2 уксусной кислоты. Для детектирования может использоваться длинноволокновый Уфсвет (365 нм).Приблизительные значения й АС факторов (в виде Иа солейд в такой системе можно записать следующим образом:согласно общепринятым способам., при"меняемым для получения катионных солей. Так, например, свободно-кислотную форму АС растворяют вподходящем растворителе - теплойметаноле или этаноле. К этому раствору добавляют раствор, содержащийстехиометрическое количество желаемого неорганического основания в водном растворе метанола. Полученнуютаким образом соль можно выделить 10обычными способами, такими как фильтрация или выпаривание растворителя,Соли, полученные с помощью органических аминов, могут быть полученыаналогичным способом. Так, например,газообразный или жидкий амин можнодобавлять к раствору АС фактора С в подходящем растворителе,таком как ацетон, а растворитель иизбыток амина могут быть удаленывыпариванием.Примерами подходящих солей присоединения кислот Аантибиотиковмогут служить соли, полученные по .стандартной реакции с органическойили неорганической кислотой, например соляной, серной, фосфорной, уксусной, янтарной, лимонной, молочной, малоиновой, фумаровой, пальмитиновой, холиовой, памовой, слизевой, Р-глютамовой, Р-камфорной, глюк ЗОтаровой, гликолевой, фталевой, винной, лауриновой, среариновой, салициловой, метансульфоновой, бензолсульфоновой, сорбиновой,пикриновой,бензойной, коричной и пр. , 35В ветеринарной фармацевтии хорошоизвестно, что обычно форма применяемого антибиотика не имеет решающего:значения при лечении животного такимантибиотиком. В большинстве случаев 4 Оусловия, существующие в организмеживотного, переводят лекарство в форму, отличную от той, в которой егоприменяли, Поэтому солевая форма, вкоторой применяется лекарство, не 45имеет существенного зиачения. Однако солевую форму можно выбирать, руководствуясь соображениями экономии, удобства и токсичности,Йдентификация А-производящего штамма,Морфология культуры А.6,которая образует Аантибиотики, состоит в спорофорах, которыеотносятся к Весцз Р 1 ех 1 Ь 111 э клас". сификации, Споровые цепи имеют ) 10спор на цепь. Поверхность спор глад. кая.Культура А,6 характеризует"ся производством главным образомспоровой массы красного цвета с 60красновато-коричневым обратимым оттенком. Присутствует также светлокоричневый водно-растворимый пигмент. Эти характеристики полученына трех из 14 агаровых сред в ча шах (1 ЯР Ф 2, 1 ЯР 7, ТРО), Тремя средами являются именно те среды, которые подтверждают обильный воздушный и вегетативный рост.Две .агаровые среды в чашах,1 БР М 4 и глюкоза-испарагиновый агар производят- беловато-серую воздушную споровую массу с желтым обратимым оттенком. Водно-растворимого пигмента не наблюдают, Эти две среды демонстриру-. ют хороший, но не обильный воздушный и вегетативный рост.Используют также девять других агаровых сред, которыеоднако, дают плохой рост или совсем не дают роста и споруляции. Воздушный цвет в том случае, когда он имеется, хотя и является плохим, но относится к беловато-серой цветовой серии.,Меланоидные пигменты отсутствуют. Основными составляющими клеток стенки являются 11,-РАР, глицин, глюкоза и рибозаВсе это указывает на клеточную стенку, относящуюся к типу 1 и к сахарному образцу типа С/В (Е, ВцсЬапоп,М.Е. ЫЬЬопз. Вег-. деуз Мапца 1 ой Ре 1 еги 1 па 11 ге Вас 1 еп.о 1 оду ТЬе Ю 111 ащз, Ы 11 К 3.пз Сов. изд. 8-е, 1974, с. 658.Следующие пять культур сравнивают в лабораторных испытаниях с А,6 Ягер 1 ощусеза 1 Ьоч 1 пасеопз 1 Р 5136; АТСС.15833 Я. сапс 1 Ыцз 1. Р 5141; АТСС 19891Б. водега 1 цз 1 Р 5529; АТСС 23443 Я. гояеозрогцз 1 Р 5122; АТСС 23958Я. зе 1 оп 11 1 Р 5395; АТСС 25497Эти культуры принадлежат к белым и красным .цветовым сериям, имеют спорофорную морфологию ВР типа, гладкуюповерхность спор и в соответствии с 1 БР описаниями являются меланин-отрицательными и не имеют отчетливо вы-. раженного обратимого цвета или водно- растворимых пигментов. Указанные характеристики совместно с образцомдля утилизации углерода и другими вторичными отличительными признаками присущи и культуре А.6.При лабораторном испытании этих культур при сравнении с А.6 четыре из них дают отрицательные результаты. Я, сапйЫцз и Б, зеоп 11 демонстрируют образование желтоватой воздушной споровой массы на многих средах, вследствие чего они отличаются от культуры А 6,. Я,а 1 Ьо 1 пасеопз и Я. пюйега 1 цз демонстрируют отчетливый черный обратимый цвет образуют водно-растворимыепиГменты и производят меланоидные пигменты.Все это отличается от культуры А.6, Согласно предписанию 1 БР разновидность Я, щойега 1 цэ относит-, ся к красновато-коричневому или темно-коричневому обратимому цвету,1071226 однако такие характеристики не относятся к разновидности Я. а 1 Ьоч 1 пасеопэ. Ни одна из перечисленных куль- . тур не является меланин-положительной, Поэтому культура Ъ.6 была классифицирована ГФсаоде Иог 1 аз 5 и Ра 11 о Иа 1 о в 1961 г как штамм Ягерощусез ГозеозроГцэ. Такая классификация основывается на срав нении с опубликованными и прямыми лабораторным сравнениями. Следующие Щ культуральные характеристики суммируют прямые сравнительные исследования.Культуральные характеристики.МорФология. А.6 Я. гозеоэрогцэ, Спороормы от прямых до гиб(В) 5 сЬГду Вегетативный:обильный (5 РЬО) вый (В) ЗсаКраснова-Обильто-.корич-ныйневый, (127)1 й Оливкосветло- во-кокорич-ричненевый вый, пигмент светло- коричневыйрастворимыйпигмент (овсяная мука на агаре) Белый Плохой Белый(Ю) а ХЯРФ 3 Воздушный: значительный (И) а Вегетативный; значительный (10 А 2) ких (ВР) без крючков, петлей илиспиралей. Цепи из более О спор.Поверхность спор гладкая согласно розовый, зато се данным, полученным с помощью скани- светлорующего электронного микроскопа. коричнеСпоры раствоОт.продолговаты 1 От продолговатыхримый. отсуустфро овальных;: до цилиндрических пигментСредний размер :250,85 х 1,78 И 1,01 х 2,47 И ХЯР4 (неорганические солиИнтервал крахмал на агаре)0,65-0 Г 97 х 0,97-2,6 И 0,97-1,3 х 1,63- ВозДУшный: Белый ХоРоший ОРанже 3,25 И хороший (В)Зс 2 ватоРост Цвет Рост Цвет ЗО (Н)6 . , желтый Воздушный: Серо-мор" Вегетатив- Оранже- Обиль- Серо- хороший конная Нет Желто-ко- ный: хоро- зато- ный желтыйГмасса ричневый ший(10 В 1) зеле- (1115) раствоВегета- Коричне- Хоро- Розовый, иыйГ .римый тивный: вый, ра". ший растворй= 35светло- пигмент обильный створимый мый пиг- корич- отсустпигмент мент от- невый вуетотсутст- асутствует раствует вориКартофельная масса 4 О мый Воздушный". Серовато- Нет Нет пигмент .хороший розовый Коричнева ХЯР Ф 5 (глицерин-аспаргиновый Вегетатив- Коричне- Сред- то-оран- агар)ный."обиль- вый, тем" ний жевый, Воздушный, Пурпур- Значи- Белый ный но-корич- раствори значимель- но-бе- тельныйневый ра" . мый пиг- ный(И) 13 Ьа лыйстворнмый . мент от- . Вегетатив- Желто- Хороший Серовато-.пигмент сутствует ный:хоро- вато- (10 С 2) желтый,18 Р Д 1 (триптон-дрожжевой экая ший(ЗВ 7) розо- светлострактный агар) вый Воздушный: Белый Плохой БелыйГ умеренный (И) а вый раствори- (Ю) а раст- мый пигВегетатив- Желтова- Плохой Желтова" вориный: хоро- то-зеле- (10 В 2) то-зеле- мый ший (ОА) .ный, рапигментствори- раство- А,6 ХЯРЭ 7(Я.гозеозрогцз)Гмый пиг- римый (тироэиновый агар)мент от- пигмент Рост Цвет Рост Цветсутст отсутст- Воздушный: Желтова" Обиль- Желтовавует вует .60 обильный то-роэо-. ный то-роэоРост Цвет Рост Цвет (В) 5 абуу вый (В) 5 с 6 выйХЯРФ 2 (дрожжево-солодовый экст- Вегетатив- Краснова-Обиль- Желтоваракт на агаре) ный г (7 Ы 2) то-ко- ный токоричВоэдушный Желтова- Обиль- Оранжево- модифици- ричневый,(11 Е 5) невый, (рбильный " то-рсзо- ный желтый 65 рованный темно-ко- ф светло"ричневый коричйераство- выйримый раство-.пигмент римыйпигмент Модифицированный агар Беннета Воздушный: Нет ОбильЖелтованет ный то-розо(В) 5 ац выйЖелтова- Обиль" Сероватото-ко" ный желтый, ричневый(11 Р,) светло- раствори- коричнемый пиг- вый раст, - мент не вор имый образует- пигмент сяКальций-малатный агар Вегетативный:плохой Воздушный:. Нет Плохой Белый нет (И) а Вегетатив- Краснова- Плохой ный: зна- то-корич" .чительный невый,(7 Ь 12) светло- коричневый растворимыйпигментРаствор Чапека на агаре Желтовато-зеленый,желтоватозеленыйрастворимый1 пигмент 25 Воздушный.:.плохой (Ы)а Белый НетВегетатив-глициновый,агарОбильный(ЩЬ Зелено- Обильвато- ный коричне- (1063) вый,коричневыйрастворимыйпигмент Глицерин Воздушный: плохой Вегетативный;обильный(8 Ь 12) Белый Желтый, светлокоричневыйрастворимыйпигмент 65, ный: плохой Белый Нет З 0Растворимый пигмент не образуетсяАгар ЭмерсонаВоздушный". плохой Обильный Желто(В) 5 сЬ ваторозовый 35Обильный Желтый,Питательный агар Воэдушныйг Значинет тельный(Ю) Ъ Вегетатив- Желтова- Плохой ный:пло- то-серый, хой растворимый пигмент необразу- ется Белый Желтова- то-серый,раство" римый пигмент не образуется Цветя мука Рост Цвет Росттоматная паста и пшеничнана агаре Воздушный: Желтова" Обильобильный то-роэо- ный (Н) 5 сЬ вый (В) 5 сЬ Желтова- то-розовый. 1 ЯР 7(тирозиновыйагар)1 БРФ 7 модиф. (18 Р 37минус тирозин)ТиразиноваяпробаююЖелатиновоеразжижение + +Действие сня- Незначительныйтого молока гидролизГидролизкрахмала , + +Интервал рН 5-11 5-11 Температурный интер"вал, оС 25-40.Восстановлениенитратае +