Способ получения собачьего -интерферона

)5 С 12 М 1 НИЕ ИЗОБРЕТЕНИ О К ПАТЕНТ 2 ернационалГауптман(АТ)ольф и Пете БАЧЬЕГО гт биоехноло.олучения вестью, Печень с рН 80, зкснием фенола двого проед, актив урал,ной сится к бизтехспособу получе- антивирусной Изобре огии, авещ способу оферона актиРнос гью полученияФормулы в частности бачьего , н ение от именно ств с Иб ф ф,САС .Д ";" Г АА гФ лай Оч Йи Ю СТС ТС ф Сб Ф М САС АТ Ад /АСС А.,СТ Т(". Уу7С ГАС АСС ЯС 7 Т 1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Берингер Ингельгейм ИнтГмбХ (ОЕ)(54) СПОСОБ ГОЧУЧЕНИЯ СОИНТЕРЭЕРОНА(57) Изобретение относится кгии, в частности к способу иществ с антивирусной активнособаки инкубируют в буферетрагируюг ДНК с использова Нс 5 Ай /Ъ Мдр ТСС САС СТС ССС САС АСдиализа и осаждения этанолом, ДНК центрифугируют, диализуют и осаждают этанолом, Полученную ДН К длиной более 50 т.п,о. частично переваривают эндонуклеазой Яац ЗА, фракицонируют по величине путем электрофореза и выделяют фрагменты длиной 10-23 т.п.о которые после дефосфорилирования клонируют вааЬба-ЕМВ 3 (-ЗА), Полученную библиотеку генов скринируют с помощью радиоактивно маркированных интерфероновых генов человека, выделяют гомологичные последовательности ДНК, субклониГу:от их в векторе рОС 9 и вводят в экспрегеируешие плазмиды. Голучднными при ."том векторами трансформирую. .Стамм Е, соИ с последующим вы елением ко. ечного продукта, Выход целедукта составляет не менее Зх 105ности интерферона на 1 л культере,лы,1669402 55 60 М юР ЕЕа ж ИВ ТСТ СТО ОТС СЛС СТС АТС. 75 70 65 тАт, бР Су ВЕ р 4 Е Н.ь Йг Ю гу р" Аэ Ф Зю ЗсЪ ФФЛСС СЛС ЛЛС СТС 1 ТС СЛС СТО ТТС ТСС ССС ЯЛС АСС ТСС ТСТ ССТ 90 80 Аа р М Ь. цг 1 ги йг йЬ йЬ йи Ф В ф М 4(СТ ТСЫ ЛАС ИТС ЛСТ СТС СТО СЛС СЛЛ СИ ТСС ТСС ССО СТС ТСТ 105 100 М Щ 1 д 4 А/ й Йи Щ б Ас Р, Щр фу .ф И( САЬ СТО. САТ САС СТС САЯ ССС ТСТ ССС СТО СЛО СЛС ССЯ С(Ж 120 115 110 Ь/,46 Йй у. Рф ЙФ Ис 1 Ж Щ ФФг 1 и ффгф З СТО ССС И 9 АСС ССС СТС ЛТС СЛТ И(. .ЛС ТСС АСС СТС. АСС АСС 135 130 рд, Му Мг Зе Йг ф Й 14 4 о 4 у 4 ь Хе, 3 ЧТЛС ТТО САЛ ЛСО ЛТС ТСС СТС ТЛС СТ 1 СЛЛ СЛС ЯСС ЛЛС СЛС АСС 1505 140 И, ЯЕ а гФ Р, У Рг . ВССС ТОТ ССС ТСС (ИС Л 1 С. С.1 С ССЛ ССЛ ЛЛ ЛТС ССС. АЯЛ ТСС 1 ТС 165 160 Г)5 6 Зсмк Ж- П ф АЪ ф 4 М МгУ Щ Ау ЖУТТС ТСС ТСО АСЛ ЛТС ТТС САЛ СЛЛ ИЛ ЛТС ЛСС ЛСО ЛСС ААА ТЫ 4. аЕ, И Хе Ии Ю Ф 6 Ю СЮ СЫ С(З СТС СИ СЫ ФС- СЮ (ЖС СТС Способ получения собачьего интерферона заключается в том, что собачью печень инкубируют в присутствии буфера с рН = 8,0 с последующей экстракцией с использованием фенола, диализом и осаждением ДНК этанолом, которую в присутствии буфера центрифигируют с последующим диализом и осаждением этанолом, полученную при этом ДНК с длиной более 50 кб подвергают частичному перевариванию эндонуклеазой Яао ЭА в присутствии буфера с рН = 7.5 с последующим фракционированием по размеру путем электрофореза и выделением фрагментов с длиной 10-43 кб, которые после дефосфорилирования клонируют в лямбда-вектореавОба-ЕМВ 1.3(-ЗА), с последующим умножением, полученную ген-библиотеку ДНК подвергают скринингу 5 с помощью радиоактивно меченых интерфероновых генов человека с выделением гомо- логичных последовательностей ДНК, которые подвергают субклонированию в векторе рОС 9, с последующим умножением 10 и введением в экспрессирующие плазмиды,и полученными при этом векторами трансформируют Е,соИ с последующим выделением конечного продукта.П р и м е р, Выделение ДНК собаки.Замороженную ткань печени собаки размалывают в жидком азоте до тонкого порошка и в течение 3 ч при 55 С, инкубируют в 0,5 М этидендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 10 мМ трис-НО, рН 8,0, 0,5 додецилсульфата натрия (ДСН), 0,1 мг/мл протеиназы К (20 мл/г ткани). Полученный вязкий раствор освобождают от белка путем экстракции фенолом и трехкратной экстракции смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25;24:1 по объему), диализуют в буфере 5 мМ трисНС 1, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ ИаС и ДНК осаждают двумя объемами этанола, После полного высушивания е вакууме ДНК растворяют в ТЕ-буфере 10 мМ трис-НО, рН 8 О, 1 мМ ЭДТА) при 4 С и вместе с 1,273 г СэС 1/мл раствора центрифугируют в течение 62 ч при 20 С со скоростью 20000 об/мин. После удаления хлорида цезия фракции, содержащие ДНК. диализуют в ТЕ-буфере и затем ДНК осаждают двумя обьемами этанола, промывают 70-ным этанолом, высушивают и снова растворяют в ТЕ-буфере (4 С).Готовый ДНК-препарат свободен от РНК и имеет длину более 50 т.п,о, (определено путем электрофореза е 0,450-ном агарозном геле).Частичное переваривание эчцонуклеазой и фракционирование по ели)ине ДНК собаки,50 мкг ДНК инкубируют прл 37 С с 2,0 ед. Яаи ЗА е 450 мкл реакцио,ой реды(О мМтрис-НС 1, рН 7,5 ",0 мМ Л)9 12, 1 мМ дитиотреитопа), Через 40 и 60 мин отбира ют 225 мкл среды и с)лешиеа)о) с 15 мМ ЭДТА и путем нагревания до 70" С е течение 10 мин прекр.,ща ст реакцию Добавляют ацетат натрия до концентрации 0,3 М, рН 6,0, /НК осаждают д.)баелением 2,5 обьемов зтанолона, После растворения в ТЕ-буфере ДНК разделяют го галичине электро 4)срезом в течение ночи е О,",50- ном агерозном геле в ТВЕ-буфер.,10,8 г/л трис-НС 1, 5,5 г/л борной кислоты, 0,93 г/л (г 4 а 2 ЭДТА) примерно приВ/см. При помс щи маркеров (переваренная с псмощьа Есой и Н 1 гО 11 и переваренная с помощью Нпс 1 11 лямбда-ДНК) вырез эют кусок геля с ДН К длиной 10-23 тысяч пар оснований (далее т.п.о) ДНК электроэлюируют из геля е ) ечение 3 ч при 300 3 в камере для диализа (буфер 0,1 хТВЕ), очищают хроматографией на ),еленке Эл)отип-Д и осаждают этанолом, Для того, чтобы предотвратить самолигирование фрагментов ДНК, которое может привеси к искусственным гибридам последовательностей собачьей ДНК и к слишком большим и таким образом более40 10 Построение библиотеки геномной ДНК собаки,Дефосфорилированные длиной 10-23 т.п,о, фрагменты ДНК собаки клонируют в лямбда-векторе, например Лямбда-ЕМВ 1-3 или -ЗА, с 6-А-Т-С-липкими концами, полученными путем удаления внутреннего Ватт) Н 1-фрагмента фаговой ДН К,Вектор выращивают в штамме Е.со 1 с супрессорным факторол ЯорГ например, Г.с 1 НМ 526 538 ипи 539, в содержащем 5 мМ гуль)э)а магнияВ-б.-ьоне (10 г/л трип)снэ, 5 г/л дрож,ее,го эксграк)а и 5 г/и пор)лстс)о нэтри ), осажда)т)т попиэтилентпиколем и очища);)г путем двукоа:ното центр)фу ираван) я в .ра .иен,. плотно",ти )О (; СяСл,ээстеог)а, 40 , 5 ООО об ми 20 С), Г 1 ссле диал;эа против ТЕ-бу+.ра фвгоеук ДНК ")сэг)Гжцаю от белка птедв кра) ной э),. ) раки смесью фенола с хлороформом и из)а),лот)ым спио)ом (25/24/1 по эбьему, и деук-л)ной экстра кцли .месью хлоро)с)"а с изоамиловым с .),) о,л )24 у " по Обеу,конце трирую п,тем ссажде ия этан э.гм.Дпя получения к)лечных фрагментов ЕЛВ ЗА 50 мкг фл свой Д К в течение 2 ) при .)7 С в 15 мк: реакцион)сй среды (О м)пу )ри"-НС рН 7,5, 1 О:лМ М 9 С 12, 1 мМ дчтлотреитолэ) полностью .;еревар ва)от с помощью Веп Н с пс . щью 15 мМ ЭДТА е т;.ч;чие 10 мин гри 70 С прекращл)от реэкцию ы ДНК осаждают) сн; пол)о избежание обг,вт )сто легирсвания с-,)ед)ий фрагмент дополительно разрезают ., помощью Есой и отделенный олигонукпеотид уцаляю: путем осаждения изспропанологл, При этом переваренную Вап Н 1 пямбда-ДНК полностью переваривают Есой 1 в течение 2 ч при 37 С в 450 мкл 10 мЧ грис-НС 1, рН 7,5, 1 ОО,лМ МаС 1, 10 мМ 15 неспособным упаковываться в лямбда-фагиДНК-кускам, расфракционированные по величине фрагменты ДНК дефосфорилируют, Для этого ДНК инкубируют в течение 30 мин при 37 С в 140 мкл реакционной среды (50 20 мМ трис-НС 1, рН 9,5, 10 мМ М 9 О 2, 0,1 мМацетата цинка, 1 мМ спермидина) вместе с 5 ед. фосфатазы из кишечника теленка, добавляют следующие 5 ед. фермента и инкубируют 30 мин, После добавки ЭДТА до 25 конечной концентрации 25 мМ ДНК экстрагируют однократно с помощью смеси фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25 24:1 по объему), двукратно с помощью смеси хлороформа с иэоамиловым спиртом 30 (24/1 по объему) и трехкратно с помощьюдиэтилового эфира, осаждают этанолом, высушивают и растворяют в 0,1 хТЕ-буфере.МдС 2, реакцию прекращают путем добавки 15 мМ ЭДТА и 10 мин нагревания до 70 С, После добавки ацетата натрия до конечной концентрации 0,3 М три больших фрагмента ДНК осаждают с помощью 0,6 объема изопропанола в течение 15 мин при 0 С, промывают два раза 0.45 М ацетатом натрия и 0,6 объема изопропанола и однократно 0,3 М ацетатом натрия и 2,5 объема этанолэ и растворяют в 15 мкл 0,1 хТЕ-буфера, При этом ВавН/Есой-линкеры остаются в растворе, ЕМВ ЗА-фрагменты (8 мкг) объединяют с 5 мкг ДНК собаки длиной 10 - 23 т.п.о. и 10 ед. Т 4-ДНК-лигазы и инкубируют в течение ночи при 14 С и один день при 4 С в 50 мкл буфера для лигирования (66 мМ транс-НО, рН 7,2, 0,1 М,йаС, 10 мМ МдС 2, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ АТФ), Лигированную ДНК-смесь упаковывают в зрелые фаговые лямбда-частицы посредством известной ин витро лямбда-упаковывающей системы. Компоненты этой системы, т.е. ультразвуковой экстракт (УЭ) лиээта, полученный путем замораживания - размораживания (далее: ЛЗР буферы М 1 и А), приготавливают известным образом. По 10 мкл лигированной ДНК-смеси втечение 2 мин инкубируют при комнатной температуре вместе с 25 мкл УЭ, который также как и ЛЗР в течение 30 мин размораживают из льда, смешивают со 100 мкл ЛЗР и инкубируют далее в течение 60 мин при комнатной температуре, Упакованную смесь разбавляют 150 мкл лямбда-разбавителя (100 мМ трис-НС, рН 7,5, 10 мМ МдЯ 04, 1 мМ ЭДТА) и хранят при 4"С.Аликвоту упакованных лямбда-фагов титруют на штамме Е.со ИМ 528 30 рГ. В целом получают примерно 1 х 10 неэависи 6мых рекомбинантных ДНК собаки, Остаток упакованного материала размножают путем нанесения на газон ИМ 528 с плотностью 30000 бляшкообразующих единиц (бое) на чашку Петри диаметром 13,5 см с 1.В-агаром, содержащим сульфат магния,Скрининг библиотеки для поиска генов интерферона.Для идентификации рекомбинантных фагов, которые содержат гены собачьего интерферона, используют радиоактивно меченые гены альфа-интерферона человека, Для этого полностью переваривают по 10 мкг высокомолекулярной собачьей ДНК рестриктазами Есой и НпО , разделяют электрофореэом на 0,8-ном агароэном геле и переносят на нитроцеллюлоэные фильтры, Из экспрессионной плаэмиды рЕВЗЗ выделяЮт Нпб -фрагмент длиной 845 пар оснований (по), который содержит протеинкодирующую область для зрелого альфаАВС-интерферона человека,ДНК метят Р с применением известных методов.5 Нитроцеллюлоэные фильтры предварительно гибридиэуют в течение 7 ч при 65 Св 5 х ССПЕ (0,9 М йаС 50 мМ йаНгР 04, 5мМ ЭДТА, рН 7,4), 5 х раствор Денхардта(0,1фикол, синтетический полисахарид с10 мол,массой 400000),0,1 ф, поливинилпирролидон, 0,1 ф, эльбумин сыворотки рогатогоскота, 0,17 ь ДСН, 20 мг/мл ДНК из спермылосося и затем с 13 х 10" сргп маркированнойпробы гибридиэуют в таком же растворе, но15 беэ ДНК иэ спермы лосося. После инкубации при 65 С в течение ночи фильтр промывают четырехкратно в течение 1 - 1,5 ч вЗхССР (0,45 йаС, 45 мМ цитрата натрия),0,1; ДСН при 65 С и экспонируют в тече 20 ние 7 дней. Появление нескольких полосдоказывает наличие семейства генов альфаин 1 ерферонэ у собак.1000000 рекомбинан; ных лямбда-фаговнаносят на Е,со ЙМ 528 плотностью 3000025 бое/13,5 см пластины. Двукратные нитроцеллюлоэные реплики изготовляют с каждой пластины. После обработки в течение 2ч при 80 С фильтры промывают в течение1,5 ч при 65 С в 1 М йаС,10 мМ трис-НС рН30 8 0; 0,16 ДСН, предварительно гибридизуют в течение ночи, как описано выше, и втечение 24 ч гибридизуют с 1,5 х 10 сргп радиоактивной пробы эльфа-интерферона нэфильтр. После трехкратного скрининга пол 35 учают 9 клонов собачьего а -интерферона,которые дают положительные сигналы гибридизации,Характеристика рекомбинантных фагов,40 Из 9 гибридизующихся с а -интерфероном человека рекомбинантов готовят фаговую ДНК, ДНК переваривают с помощьюЕсоШ ВагпН, НпО , Рз 1, ВдН, Ягпа, иразделяют электрофореэом в 0,8 ф,-ном аа 45 розном геле.Величину фрагментов определяют известным образом, Положгние рестрикционных мест внутри Лямбда-вставкиопределяют путем частичного рестрикцион 50 ного переваривания лямбда-ДНК. маркировки правых и левых липких концовлямбда-ветвеи синтетическими меченымиР олигонуклеотидами с последующимэлектрофореэом в 0,45-ном агароэном ге 55 ле.Субклонирование генов а-интерферона собаки,Рестрикционный фрагмент клона Саальфа-2. который гибридизуется с а-ин 1669402 1 Отерфероновым маркером человека, субклонируют в полученное обработкой рестрикционными энзиг.ами место клонирования вектора р.С 9, производного рВ Я 322. Вставка постороннего ДНК-фрагмента приводит к прерыванию 1 ас-Е-гена ( галактозидаэы) и таким образом изменяет фенотип трансформированного плазмидой штамма Е,со 1 М 101 от 1 ас + до 1 ас - . В результате индуцированный изопропилтиогалактозидом (ИПТГ) штамм 1 М 101 не может расщеплять до синего красителя бесцветный субстрат-аналог 5-бром-хлор-индолил- /3-О-галактоэид(Х-САЕ). Колонии бактерий с фенотипом 1 ас поэтому распознают по белой окраске,Ипата-фрагмент длиной 3,7 т.п.о, из клона Са-альфа 11 - 2 элюируют из агароэного геля, очищают хроматограФией на колонке Элютип-Д и примерно в 10-кратном молярном избытке лигируют с 40 нг разрезанного с помощью Згпа и дефосфорилированного вектора рОС 9, трансформируют в Е, со 1 М 101 и заливают вместе с 1 В-Топ-агаром, содержащим 0,2 мг/мл Х-ОА 1, О, 17 мг/мл ИПТГи 0,1 мг/мл ампициллина. Белые колонии выращивают в 5 мл В-бульона, содержащего 0,1 мг/мл ампициллина, в течение ночи при 37 С и подвергают скри ингу известным образом, Полученную ппи этом плаэмиду называют рАеч 50. Таким же обра-.,Ом Я ет(а 1-фрагмент длиной 2,4 т. 111( ГОГО же лямбда-ч.г 1 она субклонипуют 1 р.С 9, Полученную плазмиду нагьеезот гА( е,ДНК-последовательность генов соб чьего а -инге; ферона из клона Са-альфа- 2 НОО 1-все-.вку длиной 3,7 т.1:. пллзе(иды рАН 2 (Зва-фрагмент длиной 1,7 т,п,о, субклон Са- а 1-2, подвергаюг анализу для определения последовател,ности а "лино- кисло(ных Остатков. 60 мкг ЦНК 1 з плазмиды рАН 2 полностью -ереваривают с помощью НпО 111, фрагмент длиной 1,7 т.п,о, выдег:яют из 1;4-ного агарозного геля и очищают, как описано выше, 15 мкг этого фрагмента в 100 мкл буфера для лигирования подвергают лигированию с ".4 ед, Т 4- ДНК-лиГазье ГЕри 14 С в те ение ночи и затем подвергают самолиги,ов.-нию в течениепней, Ът лигированную ДНК дпобят н,е маленькие части в ледяной банг с помощью 20-секундных ультразвуковых иллпульсов (всего 1 ПО.). ДНК-концы восстанавливают в те еение 2 ч при 14 С л 25 С мкл рЕ; кционной Срвды (50 мМ триСНС 1, О". 75, О мМ М 9 С 12, 1 м",4 д.:тиотреи.е=."а 0 5 мг/мл а":,бул(ина сыворотки кр,геного рогатое О ечеота, по 0,1 мМ ОАТР,5 10 15 20 25 3,. г Е 3 40 45 55 ОСТР, ОСТР, ОТТР с помощью 15 ед большого фрагмента Е,со 1-полимеразы(фрагмента Кленова), После концентрированияпутем осаждения этанолом предварительнообработанную таким образом ДН К разделяют в 1 О/.-ном агароэном геле и ДНК-фрагменты длиной 0,351,0 т.п.о, выделяют иочищают. Примерно в 10-кратном молярномизбытке фрагменты лигируют с разрезанной Яетеа и дефосфорилированной репликативной формой бактериофага М 13 Гпр 8 итрансформируют Е,со М 101, Однонитевую ДНК рекомбинантных фагов выделяюти после связывания с синтетическим олигонуклеотидом осуществляют двунитевойсинтез в 4 отдельные реакции с использованием фрагмента Кленова Е.со ДНК-полимеразы,Аналогично анализируют НпО 11-фрагмент длиной 1,9 т п,о. иэ плазмиды рАН 4(Ягла Субклон длиной 2,4 кб иэ Са-альфа),Конструирование экспрессионнойплазмиды рВН 100.Все ферментные реакции осуществляют в указанных изготовителями условиях. 7мкг плазмиды рЕР 103 линеаризируют в50 м л реакционной соеды с помощьюрес Г; икц анной эндонуклеаэы НОО 1 г 1 ог 7.:,( А Е 9 ОС И 10 л(К,:а1 ОР:.еО ЕЯ,О. сгл 1 гдрля О; Г;гг;л, е и;-тн;.йЭКГ; Г,11"1 11 НООЛ 1 н ОДНО" дат,сйКСГЪа1 ЧИ И СЛ 1 ЕС,Ю )ЕНЬЛ- С ХЛООФЙ;,1 Гл 1 Д Н КОСа е , Г Елз ;1 НОй е",аэЬ ЛПблЕ",ЕН 1 ЕМ О,ОбЬ.лла "М раСтВПра,ГО 1 Натрия. рН ,5,и 2% мел зтано,"а, Осадок ДНК после центрифугиоования промывают Однократно70;4-еым раствором этанола ДНК высу (ивают и затем осадок после цантрифугирован 1 я раствореот в 20 мкл Е-буфера (10 мМтрис, р," 8,0, 1 мМ ЭДТА). По : мкг синтетическил ОГл ИГгДЕЗОКС 1 ЧУКЛЕО 1 И ЛОВО(АЯС Е, Л 4 А-Е.:.АТСЕЛГСТ) И О(САТС Г ЕТА)фосс,.е ,:иру:ст0 е 1 л реакинс го растора п;доблвле н,1 1 О ед,4 1 Н. (полиНуК."епе :,.;КИНаэЫ) и 1 л("Л АР НваКцИКв. Еуг ",еи, ГС ь 1 е;че"лие 4.". мо;. Рег кциоОСОБЕ, 1 гя НлаКЕТ 0 М (Н"ТНЫЛ 1 НаГрвваНИЕ. Мдо 7 г 0( О 5 мкге раствора Г 1 лазчлды и фосфьрн: "рованных алие Онуклеот (/ в с 1 еш 1,вап Г лагреь- от в .ечеа и" 5 мин,л,гГО,ае ,ас евор .1 ул(ждь-ог,з СдГеэп; о мкл 1 О л лие.". чсГо Гф ( е. Ил,ЕР,м, 1669402 1240 45 50 трис, рН 7,5, 100 мМ М 9 С 2, 200 мМ ДТТ-дитиотреитола, 1 мМ АТР, 500 мкг/мл альбу- минЬ сыворотки крупного рогатого скота), а также 2 мкл воды и 10 ед. Т 4-ДНК-лигазы, Реакцию ведут 40 ч при 4 С и прерывают 10-минутным нагреванием при 70 С.2 мкл продукта реакции в 30 мкл раствора переваривают 10 ед, рестрикционной эндонуклеазы Бас в течение 3 ч при 37 С, Реакцию прерывают путем 10-минутного нагревания до 70 С, 5 мкл этой реакционной смеси в 30 мкл среды лигируют с 10 ед, Т 4-ПНК при 14 С в течение 16 ч. 200 мкл штамма Е.со 1 НВ 101 смешивают с 10 мкл продукта реакции лигирования. Бактерии выдерживают в течение 45 мин на льду и затем нагревают в течение 2 мин до 42 С, чтобы сделать возможным поглощение ДНК. Затем суспензию бактерий инкубируют снова при 0 С в течение 10 мин, После этого трансформированные бактерии наносят наВ-агар, который содержит 50 мкг/мл ампициллина,Из образовавшихся колоний бактерий отбирают произвольно 12 и из них выделяют плазмиды, Суммарную ДНК разрезают с помощью рестрикционной эндонуклеазы Бас и ДНК разделяют в агарозном геле(10 ь, 1 хТВЕ-буфер). ПеремещениеДНК в виделинейной молекулы размером 4400 п.о, подтверждает введение сайта рестрикции аеас в плазмиду, Одну из этих плаэмид произвольно отбирают. ДНК из соответствующего выделения еще раз трансформируют в штамм Е.со 1 НВ 101. Иэ полученных трансформированных бактерий выбирают одну колонию и выращивают в большем масштабе, Выделенную плаэмиду разрезают рестрикционными эндонуклеаэами ЕсоЯ 1 и ВащН 1, ДНК разделяют в 1"ном агарозном геле и меньший фрагмент выделяют из геля путем электроэлюции. Этот ЕсоЯ - ВавН ДНК-фрагмент длиной 460 п.о, анализируют для определения последовательности аминокислотных остатков. Полученную плаэмиду называют рЯН 100.Прямая экспрессия зрелого интерферонасобаки (СаИФН а 1).5 мкг плазмиды рЯН 100 полностью разрезают с помощью рестрикционной эндонуклеазы ВащН 1 и затем 5 а -концевые фосфаты удаляютс помощью щелочной фосфатазы кишечника теленка. 30 мкг плазмиды рАН 4 переваривают с помощью ВагпН 1. После электрофоретического разделения ДНК в эгарозном геле ДНК-фрагменты длиной 0,6 т.п.о, которые содержат всю кодирующую последовательность для СаЕМ-альфа, выделяют из геля и очищают. 5 10 15 20 25 30 35 1 мкг этих ДНК-фрагментов длиной 0,6 т,п,о, и 25 нг разрезанной рЯН 100-векторной ДНК в 10 мкл буфера для лигирования (66 мМ трис-НС 1, рН 7,2, 0,1 М 1 чаС 1, 10 мМ М 9 С 2, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ АТР) лигируют с 10 ед. Т 4-ДНК-лигазы при 14 С в течение 24 ч.Клетки Е.со НВ 101 трансформируют 5 мкл продукта лигирования и наносят наВ- агар, который содержит 50 мкг/мл ампициллина.Из образовавшихся колоний изолируют в микромасштабе плаэмиду и характеризуют путем рестрикционного анализа с различными ферментами. Плазмиду, которая содержит ген интерферона и триптофановый промотор в одной и той же ориентации, называют рАН 104. Эта плаэмида представляет собой промежуточную стадию получения окончательной экспрессион ной плазмиды для зрелого Са-ИФН-альфа 1.Конструкция экспрессионной плазмиды рАН 4/2. 7 пмоль ВатН 1-фрагмента длиной 0,6 т,п.о, из плазмиды рАН 4 смешивают с 1 нмоль синтетического олигонуклеотида (б(ТОССАСО ТОСССОАС), который предварительно фосфорилируют с помощью Т 4- полинуклеотидкиназы, общий обьем доводят водой до 34 мкл. 15-мерный олигонуклеотид содержит кодирующую последовательность для 5 Й-концевых аминокислот зрелого а -интерферона собаки, Раствор нагревают в течение 5 мин до 100 С и затем охлаждают, причем находящийся в большом избытке олигонуклеотид привязывается к комплементарному участку однонитевой ДН К.Двунитевой синтез, исходя из связанного с олигонуклеотидом затравки, осуществляют в 70 мкл реакционной среды (50 мМ трис-Н С 1, рН 7,5, 10 мМ М 9 С 12, 1 мМ дитиотреитола, 0,5 мг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота, по 1 мМ ИМАТР, НОТР, с 1 СТР, аттР) с 35 ед. фрагмента Кленова ДН К-полимеразы 1 штамма Е,со 11 в течение 90 мин при 22 С. Реакцию прекращают путем добавки 20 мМ ЭДТА, белки удаляют экстракцией смеси фенола с хлороформом. ДНК осаждают этанолом после добавления 0,1 объема ЗМ раствора ацетата натрия, рН 6, и промывают 70-ным этанолом. Оставшиеся однонитевые ДНК- участки удаляют с помощью Я-нуклеазы. Для этого высушенный ДНК-осадок расворяют в ЗОО мкл 51-реакционного буфера (4 мМ ацетата цинка, 30 мМ ацетата натрия, 250 мМ МаС 1,5 глицерина, рН 4,6) и инкубируют в течение 2 ч при 14 С со 150 ед.51-нуклеазы, Реакцию прерывают добавлением 20 мМ ЭДТА, Белки удаля от путемэкстракции фенолом и хлороформом. После добавки 0,15 объема ЗМ раствора ацетата натрия и 0,6 объема изопропанола ДНК осаждают при 0 С из водной фазы и промывают 70-ным этанолом. Полученную ДНК переваривают с 60 ед, Ры в течение 2,5 ч при 37 С и затем разделяют электрофорезом в 2 -ном агароэном геле, Фрагменты ДНК длиной 300 п,о, выделяют и очищают.ЗО мкг плаэмиды рАН 104 переваривают с 50 ед, Яас в течение 2 ч при 37 С, фермент инактивируют в течение 10 мин при 70 С, После добавления по 0,5 мМ всех четырех дезоксинуклеотидов и 30 ед, полимераэы Кленова инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре, чтобы сделать тупыми концы ДНК, Белки удаляют путем экстракции фенолом и хлороформом и ДНК осаждают этанолом, Полученную ДНК частично разрезают 20 ед. Рэ 11 в течение 40 мин при 37 С и реакцию поерывают добавлением 20 мМ ЭДТА. ДНК разделяют электрофорезом в агарозном геле. Фрагменты длиной 4,3 т,п.о. изолируют и очищают,Полученная ДНК и описанный выше ДНК-фрагмент длиной О,З т,п,о. лигируют в 10 мкл буфера для лигирования с 10 ед, Т 4-ДНК-в течение 20 ч при 14" С. Продуктом лигирования трансформируют клетки Е,со ЕВ 101 и наносят на содержащий ампици- лин 1 В-агар. Образовавшиеся колонии бактерий переносят нэ свежие эгаоовые пластины, а также на нитроцеллюлозные фильтры, которые наложены нз эгаровые пластины. После инкубации при 37 С батерии лигируютл ДН К после денатуоирования связывают с нроцеллюлоэол, Остатки клеток удаляют путем инкубзции в течение 16 ч при 65 С в промывном растьоре (1 МйаС 150 мМ трис-НС 1, рН 8,0, 1 мв 1 ЭДТА, 0,1 ДСН), Фильтры затем глбрирзуют в 10 мл раствора (О 9 МйаО, 90 мМ трис-НС 1, рН 7,5, 6 мМ ЭДТА, 0,1 оДСН, 0,1 мкг/мл РНК иэ Е,со 1) с 2 х 10 сргп меченого Р7 32 о л и г о д е з о к с и н у к л е о т и д а б(ТСССАССТОСССОАС) в течение 3 ч гри 47 ОС. 18 пмоль олигон/клеогидг и 18 пмоль (у-зР) АТР (3000 С 1/м оль) с 20 мкл буфера 70 мМ трис-НС 1, рН /,6, 10 мМ М 9 С 12, 5 мМ дигиэтреитола) инкубируют в присутствии 10 ед, Т 4-полинукл огидкиназы г. течение ,5 мин при 37"С. Реакци оекрагцают добавление л 25 мМ ЭДТА и пееключившуюся радиоактивносгь отделяют путем хро:.латографии на колонке, содержащей мл блогеля Рб-ОС,Фильтры промывают 4 раза в течение 30 мин при 47"С, Промывной раствор соотвегсгвует использованно.,у для гибридизации раствору без добавки сРНК Фильтры 5 10 15 20 25 Зч 35 40 1 г 50 ;-г.,экспонируют при 80 С, Из колоний бактерий, которые дают нэ ауторадиограмме положительный сигнал гибридизации,выделяют плэзмидную ДНК. После разделения электрофореэом в агарозном геле выделяют рестрикционные фрагменты длиной0,5 т.п.окоторые подвергают анализу последовательностей аминокислот,Плазмиду с желаемой структурой называют рАН 4/2, Она позволяет осуществлятьэкспрессию зрелого СаИФН-альфа в штамме Е,со 1,Получение плазмиды рАН 4/3.Подготовленный для бактериальнойэкспрессии СаИФН-альфа-ген иэ плазмиды рАН 4/2 субконируют в плазмидномвекторе раг-рАТЕБ 103,0,5 мкг Н 1 пд- фрагмента длиной 0,5т.п.о. плээмиды рАН 4/2 и 25 нг разрезанного с помощью Н 1 пб 11 и Вагп Н 1 и очищенногона геле плаэмидного вектора раг-рАТЕВ 103в 10 мкл буфера для лигирования инкубируют в присутствии 5 ед Т 4-ДНК-лигазы в течение 3 ч при 22 С. Клетки Е,со 11 НВ 101трансформируют 5 мкл продукта реакции инаносят наВ-агар, содержащий 50 мкг/млампициллина, Из образовавшихся колонийбактерий произвольно отбирают 6 и иэ нихвыделяют плазмиды. Плазмиду, которая обладает желаемгй стрчктурЮ называютрАН 4,л,Э когре",с лл ив уерф" ооное й активности; ш-э".-. 1:.со 1, г 1 В 101, ссдеркэщеплахмлду рАН 4/2 или рН/3.100 мл бэктери. ьной куль у ы ипкуби(-Лкруют при 37. при и;е- см в.- эчии ьплот: до -:ижс ка,.:,н," оп ,Аплот ости при 600л д с . аей н:. содер . цсй, -и тоф,. с,;ре -гэн е на ,л Сред,.: . гН)7 М;, З,Ь г К; РО, 1:Н 7.Л,с Ма.эН. 0,5 Г аз21 .фя-г. ,иокислоткисло ьй идролизэт, 11 глокозь мМ",у 5 г/, ,1 мМ СэС 2,тиг ,. н-;1, :, мг1-цисн на, 20 мг Зф -и до акрилсвол кислотыдчк-орда, тси тфэно",рона. необязап;.ьно 50-10 мг а" ицпинз -агембактси центр.".ф .ую ." ече г, 5 минпри ,000 об/мин, . ярок угпендируют в1/10 (кул.трэл:.,нс г:. обьема охпаже-ногольдом . Ьеоэ ":,0 ц", р Гл оН Я,0, Зпь.:- охлч,",,; льдлм двзж.,ыв ь .ен е ЗО с рдэр.:и и м,.пзю увырээьукэ .20 к ц, 100) ,:". рру.;ных клеток удаляю ье; чие 0 мин при10000 об/мин 14") и нлдосдгч ую жидкость после стерльои 1 и ьтр,. цил испытьвают нэ интерферсч.;вч э гогт посстехе, в которой пзмсрг,апетаеский з, ект;:езпкчл;,е и . .се1669402 16 Составитель Т, ЗабойкинаРедактор Н, Гунько Техред М.Моргентал Корректор О. Кравцова Заказ 2688 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101. Тест-система: А(АТСС СЯ 1. 1542) опухоль у собаки везикулярный стоматитный вирус.Активность интерферона в единицах на литр бактериальной культуры составляет 3,2 х 10 и 3,0 х 10 для штаммов Е.со 1, трансформированных плазмидами рАН 4/2 и рАН 4/3 соответственно,Формула изобретения Способ получения собачьего а-интерферона, заключающийся в том, что ткань печени собаки инкубируют в присутствии буфера рН 8,0, экстрагируют фенолом, диализуют и осаждают ДНК этанолом, которую в присутствии буфера центрифугируют, диализуют и осаждают этанолом, полученную при этом ДНК с длиной более 50 т.п.о. подвергают частичному перевариванию зндонуклеазой Яац ЗА в присутствии буфера рН 7,5 с последующим фракционированием по размеру путем электрофореза, выделением фрагментов с длиной 10 - 43 т.п,окоторые после дефосфорилирования клонируют в лямбда-векторе ав Ьба-ЕМ В .3(-ЗА) и умножают, полученную ген-библиотеку ДН К подвергают скрин ингу с помощью радиоактивно меченых интерфероновых генов человека с выделением гомологичных последовательностей ДНК, Ява-фрагмент с длиной 2,4 т.п.о. отработанного клона Саа 11-2 лигируют разрезанным с помощью Ява 1 и дефосфорилированным вектором рОС 9, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют бактерии Е.соИ 1 М 101 и отбирают устойчивые к ампициллину клоны, содержащие плазмиду рАН 4, переваривают ВавН 1, полученный фрагмент длиной 0,6 т.п,о. лигируют с векторной ДНК плазмиды рВН 100, предварительно разрезанной рестрикционной эндонуклеазой ВавН 1 с помощью Т 4-ДН К-лигазы удаляют 55-концевые фосфатные остатки щелочной фосфатээой кишечника теленка, выделяют плазмиду рАН 104, которую переваривают Бас, концы полученной ДНК затупляют с помощью полимеразы Кленова в присутствии бАТР, бОТР, ОСТР и бТТР, полученную ДНК обрабатывают Рзт 1, и выделяют фрагментдлиной 5 4,3 т.п.о. и ВавН 1-фрагмент длиной 0,6т.п,о, из плазмиды рАН 4, лигируют с олигонуклеотидом й(ТО ССАССТОСССОАС), предварительно обработанным Т 4- полинуклеотидной киназой, олигонуклеотид ную затравку удлиняют с помощьюфрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 штамма Е,со 1 в присутствии бАТР, бОТР, бСТР и бТТР и полученную ДНК осаждают, оставшиесяоднонитевые участки ДНК уда ляют с помощью 51-нуклеаэы и полученнуюДНК осаждают, переваривают Рзт и выделяют фрагмент ДНК длиной 0,3 т.п.окоторый лигируют с фрагментом длиной 4,3 т.п.о. с помощью Т 4-ДРК-лигазы с получе нием экспрессионной плазмиды рАН 4/2,Н 1 пб 1 1-ВавН 1-фрагмент длиной 0,5 т.п,о, экспрессионной плазмиды рАН 4/2 лигируют с разрезанным Н 1 пб 11 и ВавНплазмидным вектором раг-рАТЕВ 103 с помощью 25 Т 4-ДНК-лигазы с получением экспрессионной плазмиды рАН 4/3, полученными экспрессионными плазмидами трансформируют штамм Е.соНВ 101 и трансформанты культивируют, выделяют 30 белок, очищают его путем добавлениясульфата аммония до 65 ф,-ного насыщения, центрифугирования, суспендирования полученного центрифугата в буферном растворе, диализа центрифугирования диэлизата, 35 двухстадийной колоночной хроматографиис использованием на второй стадии связанного с ионитом моноклонального энти-собачьего интерферонового иммуноглобулина с последующей эволюцией связанного с ан тителом интерферона раствором, содержащим лимонную кислоту, доведением элюата до рН 4,5 и хроматографией полученного супернатанта на катионите и элюцией раствором ацетата аммония.