Способ выделения рекомбинантного интерлейкина-2 из бактериальных клеток

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК цв а А 1 ОБР К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ/1381. Бюлт орг ического те М.Р.Бу1 иманис лис А.Р:6 006.0.52(08 АНТН НИХ тех(700 атм). 0 гированием и последокател трис-НС 1 (рН 1 ммоль ЭЛТА я к биотехнообу полученияйкинаиз Изобретени тиос конк бинант ссы ба сп лог рекбио го интерериальных леток, соачеловеной плазмидримекение в гиеской пих ген интерлейк оставе рекомбина К, и может найти нской и микробио же буфером,вину. Осадокнием и раств ка н ед ного додецил ченньп раств фчдексе СрИЛ, диалиенности. изобретениятерлейкинаСеащие А. повьппение выупрощекие спое хода ин я рекомбинантного Л) заключается в соба.Способ интерлейк следующемБиомас (ВКПМ) с НС 1 (рН 8 тиотрейто выделнаРаствор рИЛ-г накосятку с иммоблзованньм лиуравновешенную буфером Аее тем же б Фером, содердодецилсульфата натрия,элюируют несвязавшиеся ибактериалькые белки. рИЛбуферным растворо А, со0,57, попепнпсульфата нат а коло о промываютжащм 0,17,при этомримесные-2 элюирчот тилсуль о ез марле ий разру ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ П 1 НТ СССРОПИСАНИЕ И(54) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ РЕКОМБИГО ИНТЕРЛЕЙКИНАИЗ БАКТЕРИАЛКЛЕТОК(57) Изобретение относится к у Е.со 11 РН 1/рАС 262-33 спендируют в 50 ммоль трис 5), содержащем 5 ммоль пиа (ЛТТ), 1 ммоль фекилмеилфторида, фильтруют чеый фильтр, клетки бантв ают на френч-прессе С 12 Р 21/ОО, с 12 и 15/О нологии и может найти применение вмедицинской и микробиологическойпромьппленности. Целью изобретения является повышение выхода интерлейкинаи упрощение способа. Способвключает разрушение биомассы клетокка френч-прессе, экстракцию бактериальных белков буфером, содержащим2 М и 4 М мочевину, растворении осадка рекомбинантного интерлейкинав27.-ном растворе доделсульфоатанатрия, хроматографию на СефадексеС, хроматографию на лизоцим-сефарозе и хроматографию на сервацеле,Выход рекомбинантного интерлейкина человека составляет 50-557 адок отделяют центрифупромывают в следующейкости: сначала 50 ммоль8,5), 5 ммоль ЛТТ,(буфер А), затем этимопержащим 2 М и 4 М мочеотделяют центрифугироваряют в присутствии 27. -ульфата натрия. Полур Аракционируют наФракции, содерж уот против буфераДалее следует стадия ионообменнойхроматографии на ДЕАЕ-сервацеле, скоторой рИЛэлюируют линейнымградиентом 0-1,5 И КаС 1 в буфере А.рИЛвыходиФ с колонки при концент-рации КаС 1 0,8 М,П р и м е р 1. 150 г клеток Е.со 1 д В 3,1/рАС 262-33, содержащих рИЛ в виде нерастворимых тел включения,суспендируют в 600 мл буферного раствора А, гомогениэируют на Фреичпрессе при давлении 700 атм. Полученную суспенэию центрифугируют 30 минпри 12000 об./мин на центрифуге. Осадок ресуспенднруют и по 3-4 раза промывают сначала буфером А с последующим цеитрифугированием в описанномрежиме, затем буфером А, содержащим2 М мочевину, и буфером А, содержащим4 М мочевину, Осадок суспендируют в40 мл буфера А, содержащего 27 додецилсульфата натрия, при перемещивании растворяют, прогревают 2 мин прио60 С, охлаждают до комнатной температуры и тестируют иммунохнмическимили биологическим методом.Раствор рИЛнаносят на колонку2 ч К 100/100 с себадексом 0-100,уравновешенную 50 ммоль трис-НС 1(рН 8,5) с добавками 5 ммоль ДТТ,1 ммоль бенилметилсульфонилбторидаи 17. додецилсульфат натрия. Фракции,содержащие рИЛ, объединяют и диализуют против буфера Л, Выход рИЛ составляет 807,.Отдиализованный раствор с концентрацией 3-4 10 ИЕ/мл наносят на колон 6,ку К 50/30 с иммобилизованным лизоцимом, приготовленным следующим обраэом,СБВг -активированную себарозу 4 Взаманивают в 1 ммоль НС 1 и суспендируют в 0,1 И растворе бикарбонатанатрия, после чего к сорбенту добавляют раствор лизоцима. Иммобилизациюпроводят в течение 12 ч при 4 С. Концентрация лизоцима при этом состапляет5 мг/мл сорбента, Сорбент отмывают отнесвязавшегося лизоцимя сначала 0,1 И 50раствором бикарбоната натрия, а затем 0,1 И раствором апетата натрия.Сорбцию рИЛпроводят из 50 ммольтрис-НС 1 (рН 8,5), палое колонку промывают тем же буфером, содержащим, 0,17 додецилсульфата натрия. Элюирование рИЛпроводят раствором 50 ммоль трис-НС 1 (рН 8,5), содержащим 0,57 додецилсульфата натрия, Элюирование продукта контролируют спектрофотометрически и иммуноферментным методом анализа. Выход рИЛна этой стадии составляет 80-907.Раствор рИЛ, полученный после аффинной хроматограбии иа колонке с иммобилизованным лизоцимом, разбавляют буфером А в 10 раз и наносят на колонку с ДЕАЕ-сервацеллом (колонка К 50/100), промывают бубером А, Элюирование рИЛосуществляют градиентом 0-1,5 М хлористого натрия в том же буфере. Выход рИЛсоставляет 50-557Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить выход целевого продукта до 50-557, и упростить способ его получения, при этом степень очистки в расчете на удельную активность интер- лейкинасоставляет 3,0 10 ИЕ/мг.6 формуЛа изобретенияСпособ выделения рекомбинантного интерлейкинаиз бактериальных клеток путем разрушения клеток, экстракции белков раствором мочевины, растворения полученного осадка в растворе, содержащем додецилсульбат натрия, гель-хроматографии растворенных белков и последующей очистки целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения способа, экстракцию белков проводят последовательно в растворах 2 И и 4 И мочевины, осадок растворяют в бубере А, содержащем 50 ммоль трис-НС 1 (РН 8,5), 5 ммоль дитиотрейтола,1 ммоль фенилметилсульфонилфторида,2 Х додецилсульфата натрия, а очистку целевого продукта проводят сорбцией белков на колонке с лизоцим-сефарозой в растворе 50 ммоль тряс-НС 1 (рН 8,5) и элюцией целевого продукта тем же раствором, содержащим 0,57 додецилсульбат натрия, а затеи сорбпией белков в буфере А на колонке с ДЕАЕ -сервацеллом и элюцией градиентом 0,0-1,5 И хлористого натрия н бубере А.