Способ очистки рекомбинантного белка, содержащего последовательность проинсулина

(1 з) А 1 С 07 К 14/ йской Федерации товарным знакам Комитет Р по патентамОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ к авторскому свидетельству(72) Леонова Е.Б., Гаврюченкова Л.П Громова О.А., Хрущева Т.АЦуканов Л.НКорщунов М.А., Михлин В.С., Мел хов В.МБеляев С,В., Вульфсон А.Н Мальцев К.В., Куликов С.В., Морозов С, (71) Всесоюзный научно-исследовательски институт особо чистых бнопрепарато Институт биоорганической химии АН ССС (56) Лабораторный технологический регл мент на получение генно-инженерно инсулина человека. М,: ВНИИ антибнот ков, 1988, с. 74 - 78.(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, СОДЕРЖАЩЕГО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ПРОИНСУЛИНА (57) Использование: биотехнология. Сущность изобретсннч: хроматографи ческая очистка на анионите. С целью новыпения выхода целевого продукта хроматографию проводят на сополимсрс димстакрилата этилснгликоля с 2-гндрокси-диэтиламинопропнлметакрилатом в 0,007 - 0,013 М уксусной кислоте, содержащей 0,15 - 0,30 М ацстата натрия, а белок элюируют 0,81,1 М уксусной кислотой. Выход белка 73%. 2 табл.меров поливинилового спирта (ПВС) и 2-40(, 50 динитрилаэоизомасляной кислоты (ДИНИЗ). Наряду с рБПИ сорбент может применяться и для очистки других белков,.Существенным отличием заявляемогоспособа получения является использование сорбента в новых условиях сорбции и элюции. Наиболее близким по структуре и свойствам к заявляемому сорбенту является анионит "СолоэаАГ, получаемый радикальной суспензионной сополймериэацией Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения генноинженерного инсулина с использованием хроматографических методов очистки на анионитах.Известны методы выделения инсулин- содержащих белков и их аналогов с помощью хроматографии. Технология представляет многостадийный процесс, включающий продуцирование рекомбинантнаго белка," содержащего. последовательность проинсулина (рБПИ); его очистку и переработку" ,Недостатками известных методов является сложная технология получения и очистки, низкие выходы целевых компонентов.Прототипом заявляемого способа является способ получения генно-инженерного инсулина, вклочающий в себя культивирование микроорганизмов - продуцентов инсулинсодержащих белков, - выделение рекомбинэтного белка, содержащего последовательность инсулина(рБПИ), его очистку на ДЕАЕ-Сефароэе в буферном растворе,содержа.цем трис-НО с рН 7,5, элюциейрБПИ раствором 0,25 М ИаС в трис-НО ипоследующим превращением рБПИ в инсулин.Недостатком прототипа является низкий выход рБПИ (около 400) и, как следствие, низкий выход инсулина, Недостатком сорбента является недостаточно высокая эффективность при очистке рБПИ.Целью изобретения является разработка способа получения рБПИ с большим выходом.Более высокий выход рБПИ достигается при проведении очистки на сополимере М,й-диметакрилата этиленгликоля (ДМЭГ)с 2-гидрокси-диэтиламинопропилметакрилатом (ГДЭПМ) с сорбцией белка 0,007- 0,013 М уксусной кислотой, содержащей 0,15-0,30 М ацетата натрия, и элюцией рБПИ 0,8-1,1 М уксусной кислотой, При этомсорбент, получивший наименование ДЕАПСферанит-ОН, получают радикальной сополимеризацией ДМЭГ с ГДЭПМ в присутствии наряду с водным раствором хлористого натрия 11-13 от массы моно 5 10 152030 й,й-диэтиламиноэтилметакрилата с Н,М- метилен-бис-акриламилом в присутствии персульфата аммония и 0,3-3,0 н. водного раствора хлористого натрия.Процесс идет в узком диапазоне всех перечисленных условий, изменение которых приводит к ухудшению условий разделения.П р и м е р 1. На колонку (9 х 45 см), содержащую 3 л ДЕАЕ-Сефарозы, уравновешенную 30 мМ трис-НС буферным раствором и рН 7,5 вводят 30 г рБПИ в 50 л этого же раствора со скоростью 100 мл/мин. По окончании сорбции колонку промывают тем же буфером 3-4-кратным объемом. Элюцию белка с колонки проводят 0,25 М НаС в 30 мМ трис-НС буфере с рН 7,5. После злюции рБПИ колонку регенерируют, промывая раствором 1 М йаС в 30 мМ трис-НО. Для обессоливания Фракции, содержащие белок, наносили на колонку, содержащую 40 л Сефадекса 6-25, уравновешенную 50 мМ раствором бикарбоната аммония, Элюцию проводили тем же буфером, Выход белка 37 УП р и м е р 2. На колонку (9 х 45 см), содержащую 3 л ДЕАЕ-Сферанита ОН с 0,2 М СНзСООйа и 0,01 М уксусной кислотой, вводят 30 г рБПИ в 50 л 0,01 М уксусной кислоты, рН 7,5, Колонку промывают 3-4- кратным обьемом 0,01 М уксусной кислоты. Элюцию белка с колонки проводят 1 М уксусной кислотой, рН 2,0. После элюции колонку регенерируют 500 ь-ной уксусной кислотой, В ход рБПИ 60-73 ф.П р и м е р 3, В условиях примера 2 были проведены опыты по очистке проинсулина на различных сорбентах анионитов сферанит-ОН; полученных при разных соотношениях мономеров. Полученные результаты представлены в табл.1 и 2,П р и м е р 4. Получение рБПИ на прототипе-сорбенте Солоза АГ, негативный,На колонку (9 х 45 см), содержащую 3 л Солозы АГ, уравновешенную 30 мМ трис- НС буфером с рН 7,5, вводят 30 г рБПИ в 50 л этого же раствора со скоростью 100 мл/мин, По окончании сорбции колонку промывают 3-4-кратным объемом того же буфера. После этого колонку промываюттем же буфером, содержащим 1 М йаС. Белок элюировали тем же буфером, содержащим 7 М мочевины и 1 М йаС. Для обессоливания фракции, содержащие белок, наносили на колонку, содержащую 40 л Сефадекса 6-25; уравновешенную 50 мМ раствором бикарбоната аммония, Элюцию проводили тем же буфером. Выход белка 40-50 ф. Чистота не превышает 500.183944 б Таблица 1 Выход рБПИ на различных сорбентах абли Сводная таблица по примерам 1 и форм диметакрилакси-диэтилавзятыхтственно отолонку проп07 - 0013 Мащей 0,15 юируют белоотой. а эти миноп Составитель Е.ХромушинТехред М.Моргентал едактор А.Хейдищ Папп Коррект Заказ 13 Тираж П НПО "Поиск" Роспатента3035, Москва, Ж, Раушская наб., 4 одиисно оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ула изобретения ОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТЛКА, СОДЕРЖАЩЕГО ПОСЛЕЬ НОСТЬ ПРОИНСУЛИ НА, пуопускания бел оксодержа щего через колонку с анионитом и сорбированного белка, опиичатем, что, с целью повышения елка, в качестве анионита исСПОСНОГО БДОВАТЕЛтем ираствораэлюцииющийсявыхода б пользуют сополимерленгликоля с 2-гидроропилметакрилатом,соотношении соотведо 1 : 1, через краствор белка в 0,0ной кислоте, содержацетата натрия, а элМ уксусной кисл 3; 7 ускают уксус М к 0,8