Способ получения гибридных плазмид, содержащих структурные гены и вектор, передающий устройчивость к гигромицину в и g 418

(59 4 Г 12 И 15/00 ЗОБРЕ ОПИСАНН ПАТЕНТУ ИЯ ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) ЭлиЛилли Энд Компани (08)(72) Роберт Фрэнк Сантерре (08)и Рамачандра Нагараджа Рао (1 Ы)(54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНЫХ ПЛАЗМИД, СОДЕРЖАЩИХ СТРУКТУРНЫЕГЕНЫ И ВЕКТОР, ПЕРЕДА 10 ЩИ УСТОЙЧИВОСТЬ К ГИГРОМИЦИНУ В И С 418, о т ЯО 1250174 л и ч а ю щ и й с я тем, что получают вектор, передающий устойчиврстьк гигромицину В и 0418 путем обработки плазмиды рКС 203 ферментомрестрикции Вд 1 11 с. образованиемфрагмента 7,5 кв Вр 1 11, или ферментами рестрикции В 81 11 и Яа 1 1 с образованием фрагмента 1,51 квЗа 1 1/Вд 1 11, или ферментами,рестрикции Ба 1 1 и ЕсоК 1 с образованиемфрагмента 1,65 кв ЕсоР. 1/Ба 1 1, поПУЧенные таким образом фрагментыплазмиды рКС 203 смешивают с фрагментами, которыесодержат структурныегены, и сшивают ДНК лигаэой фага Т 4.12501 П р и м е р 29. Конструированиеплазмиды рКС 264 (фиг. 8) и трансформант Е.со 1 х К 12 ВЕ 783/рКС 264.А. ЕсоК Т рестрикция плазмиды рКС 259.Рестрикцию проводят в соответствии с методикой примера 28, с тем исклю 5довательской лаборатории, Пеория,Иллинойс., под номером В,В. Связывание и трансформация,аПроводят реакцию при 16 С в течение 16 ч примерно 4 бл каждой изплазмид рКС 261 и плазмиды рПК 222Нае ТТ рестрикционных фрагментов(10 мМ) АТФ, 5 ул связывающей смеси Ои 1/гл Т 4 ДНК-лигазы (105 единиц).После завершения реакции инкубированием при 70 С в течение 5 мин полученную связанную смесь охлаждаютна льду. Затем ДНК трансформируют в . 5Е.со 1 К 12 ВЕ 1041, хранящуюся в коллекции культур Северной региональной исследовательской. лабораторииПеория, Иллинойс, под номеромВ, в соответствии с методикой 20трансформации примера 25. Трансформанты, содержащие только требуемую,3,6 кв, плазмиду рКС 275, обозначе-нр как Е.со 11 К 12 ВЕ 1041/рКС 275.Такой трансформант отбирают, выращивают 25на пластине, культивируют и используютдля последующих выделений плазмиды, Какналичие 394 пср 1 ас-содержащегофрагмента, так и детальную структуруплазмиды рКС 275 удобно определять с 30помощью гель-электрофорезного и рестрикционного ферментного анализов,Поскольку плазмида рКС 261 имееттри Нае ТТ рестрикционных участка,частичное Нае ТТ переваривание приводит к смеси различных Нае ТТфрагментов, а далее к конструкциикак плазмиды рКС 275, так и различных обратных изомеров плазмидырКС 275. Рекомбинантные плазмиды Ообеих ориентаций получают так жев связи с тем, что "394 пйр 1 ас-содержащий фрагмент может быть связанв любом направлении. Различно ориентированные изомеры плазмид, а также 45полученные в результате трансформанты могут быть легко выделены и идентифицированы традиционными средствами, Рестрикционный участок и функциональная карта плазмиды рКС 275 пред"ставлены на фиг. 8. 74 6чением, что используют плазмиду рКС 259 и ЕсоК Т рестрикционный Фермент с 10 Х реакционной смесью (500 мМ ИаС 1, 1000 мМ трис-НСР, рН 7,5, 10 мМ МрС 1), а не плазмиду рПК 222 и Нае ТТ рестрикциенный фермент с реакционной смесью. Полученные ЕсоК 1 рестрикционные фрагменты растворяют в 5 /л мМ ИаС 1.Б. ЕсоК Т рестрикция плазмиды УЕр 24 для последующего выделения г РДНК;Выделяют плазмиду УЕр 24 из Е.со 1 К 12 ВЕ 1139/УЕр 24 в соответствии с методикой примера 1. Е.со 11 К 12 ВЕ 1139/УЕр 24 представляет собой штамм, хранящийся в коллекции культур Северной региональной исследовательской лабораторий, Пеория, Иллинойс, под номером В. Требуемое ЕсоК 1 переваривание плазмиды УЕр 24 проводят по методике примера 29 А. Полученные ЕсоК Т рестрикционные фрагменты растворяют в 5 рл 5 мМ НаС 1.В. Связывание и трансформация.Плазмиду рКС 259, обработанную ЕсоК Т, и плазмиду УЕр 24 (соответственно приготовленные в примерах 29 А и Б) связывают и затем тран" сформируют в Е.со 11 К 12 ВЕ 783 по методике примера 28 В. Трансформанты, содержащие только желаемую,7,2 кв придающую устойчивость к гигромицину В, апрамицину и С 418 плазмиду, обозначают как Е со 1 з К 12 ВЕ 783/рКС 264. Такой трансформант традиционным образом отбирают, выра щивают на пластине, культивируют и используют для последующих выделений плазмиды.20 ДНК может быть связана в любом направлении, следовательно, плазмиду рКС 264, как и плазмиды с обрат" нойориентацией, получают по указан. ной процедуре. Различные плазмиды и полученные трансформанты могут быть легко выделены и идентиФицированы традиционными способами. Рестрикцион; ный участок и функциональная карта плазмиды рКС 264 представлены на фиг,8.,П р и м е р 30. Конструирование плазмид рЬ 0314 и рЬ 0315 и трансформанты Е,со 11 К 12 ВЕ 783/рЬ 0314 и Е.со 1 х К 12 ВЕ 783/рЬ 0315,А. Вя 1 11 рестрикция плазмиды рКС 259.1250 17Рестрикцию проводят в соответствии с методикой примера 28 В, с тем исключением, что используют плазмиду рКС 259 и Вя 1 П рестрикционный. Фермент с реакционной смесью, а не плазмиду рЬР 222 и Нае 11 рестрикционный фермент с реакционной смесью. Полученный в результате продукт Вя 1 11 переваривания растворяют в 5 мМ ИаС 1.Б, Вр 1 11 рестрикция плазмиды 10 рЯЧ 5 ррс., Рестрикцию проводят по методике примера 28 В, с тем исключением, что используют плазмиду р 8758 р и Вя 1 11 рестрикционный фермент с реакционной 15 смесью, а не плазмиду рПК 222 и Нае 11 рестрикционный Фермент с реакционной смесью. Полученный продукт Вя 1 11 переваривания растворяют .в 5 мМ ИаС 1.В. Связывание и трансформация. 20Связывание проводят.по методике примера 28 В, с тем исключением, что используют Вя 1 11 переваренные плазмиды рКС 259 и р 8758 рс, а не плазмиды рКС 261 и р 02222. Полученную связан ную смесь используют для трансформации в Е.со 11 К 12 ВЕ 783 (по методике трансформации УепзпЕ 1974) на ТД- пластинах, содержащих 200 уг/мл антибиотика гигромицина В. Некоторые 30 из трансформантов, как видно из гельэлектрофореза и других испытаний, содержат только требуемую плазмиду рЬ 0314 или плазмиду рЬ 0315. Такие трансформанты отбирают, выращивают на пластинках и культивируют. Они представляют собой требуемые трансформанты Е.со 1 К 12 ВЕ 83/рЬ 0314 и Е.со 1 К 12 ВЕ 783/рЬ 0315. Трансформанты используют для последующего 40 выделения плазмид рЬ 0314 и рЬ 0315В результате получают рекомбинантные плазмиды двух ориентаций, потому что ДНК-фрагменты связываются в любом направлении. 45 1Требуемые плазмиды легко различить и идентифицировать с помощью традиционных рестрикционного ферментативного и гель-электрофорезного анализа. Рестрикционный участок и функциональО ная карта каждой из плазмид рЬ 0314 и рЬ 0315 представлены на Фиг.9. Добавление Вя 1 11 связующих кБас 1 переваренному окончанию плазмиды рКС 257 проводят по известнойметодике. Бс. ЛопЬейа 1 1981, 1. МО 1.В.о 1, 152:317. Вя 1 11 /с 1/КАГАТКТГ/ и другие связующие являются доступными из Коллаборатив Рйсерч Инк ,1365 Мэн Стрит Вальтам, МА 02154;Б. Связывание .и трансформация.Линейную плазмиду рКС 257 с Вя 1 11 окончанием связывают с В 81 11 переваренной плазмидой р 875 ррс (приготовленной в примере ЗОБ) в соответ ствии с методикой примера ЗОВ. Связанную смесь. используют для трансформации в Е.со 1 К 12 ВЕ 783 также по методике примера ЗОВ. Полученные в результате трансформанты Е.соТГ К 12 ВЕ 783/рЬ 0316 и Е.со 1 К 12. ВЕ 783/рЬ 0317 используют для выделения плазмид рЬ 0316 и рЬ 0317. Как и в примере ЗОВ, получают плазмиды двух ориентаций, в зависимости от ориентации вставленного придающего устойчивость. фрагмента. Плазмиды и полученные трансформанты могут быть легко различны и идентифицированы традиционными способами. Рестрикционный участок и функциональная карта П р и м е р 31. Конструирование клеток Мышь ЬсМ /рЬ 0314.55Конструкцию готовят в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что используют плазмиду 174 8рЬ 0314, а не рКС 214. Сконструированные таким образом трансформантыМышь Ьс 1 /рЬ 0314 затем выращиваютв массовой культуре,П р и м е р 32. Конструированиеклеток Мышь Ьс 1 с /р 10315,Конструкцию получают по методикепримера. 4, с тем исключением, чтоиспользуют плазмиду рЬ 0315, а не плазмиду рКС 214. Сконструированные такимобразом Мышь Ьс 1 /рЬ 0315 трансформанты затем выращивают в массовой .культуре.П р"и м е р 33, Конструированиеплазмид рЬОЗ 16 и рЬ 0317 и трансформанты Е.со 1 х К 12 ВЕ 783/рЬ 0316 иЕ.со 11 К 12 ВЕ 783/рЬ 0317.А. Бас 1-рестрикция плазмидырКС 257 и добавление В 81 11 связуюФщих. Рестрикцию проводят по методике примера 28 Б, с тем исключением, что используют Бас 1 рестрикционный фермент с 10 Х реакционной смесью (600 мМ ИаС 1, 100 мМ трис-НСВ, рН 7,4, 100 мМ М 8 С 1 ), а не плазмиду рПК 222 и Нае 11 рестрикционный фермен с реакционной смесью.20 лучают плазмиды двух ориентаций, в зависимости от ориентации вставленного, придающего устойчивость фрагмента. Плазмиды и пелученные трансформанты легко различают и идентифицируют традиционными способами. Рестрикционный участок и функциональная карта плазмид рЬ 0320 и рЬ 0321 представлены на Фиг.9.П р и м е р 38. Конструирование клеток Мьппь Ьс 1 с /рЬО"20 и Мьппь 11 с /рЬ 0321.Конструкции готовят каждую отдельно по методике примера 4, с тем исключением, что используют плазмиды рЬ 0320 и рЬ 0321, а не плазмиду рКС 214. Сконструированные таким образом трансформанты Мышь Ьс 1 с /рЬ 0320 и Мышь ЬС 1 с /рЬ 0321 затем выращивают в массовой культуре.П р и м е р 39. Конструирование плазмиды рКС 273 и трансформант Е.со. К 12 ВЕ 783/рКС 273.А, Конструкция 2 ри цга ген"содер"жащей линейной:ДНК с ВашН 1 и Ба 1 окончаниями. Инкубируют при 37 С в течение 1 ч, а затем 5 мин при 70 С около 5 рл(5 /г) плазмиды рУЕр 24 в ТЕ-буфере, 5 рл ДТТ, 5 мл (1000 мг/мл) БСА, 25 рл воды, 5 рл (5 единиц) Ваш 11 рестрикционного фермента и 5 рл 10 Х реакционной смеси (1500 мМ ИаС 1, 60 мМ трис-НС 1, рН 7,9, 60 мМ МяС 3 ), Охлаждают на льду ВашН 1 переваренную ДНК, осаждают этанолом, а затем растворяют в 30 мл воды, к которой прибавляют 5 рл 10 Х указанной реакционной смеси, 5 рл ДТТ, 5,Рл (1000 мг/мл) БСА и. 5 рл (5 единиц) Ба 1 1 рестрикционного фермента. По" лученную смесь инкубируют при 37 С в течение 1 ч, затем при 70 С в течение 5 мин и, наконец, охлаждают до 4 С. Затем смесь экстрагируют из фенола и смесью хлороформ - изоаминовый спирт (24:1), после чего осаждают этанолом. Полученный осадок содержит требуемую линейную ДНК. Ее растворяют в 5 рл 5 мМ ЫаС 1 и хранятапри 4 С для дальнейшего использова" ния.,Б. Конструкция гена устойчивости к гигромицину В, содержащего линей" ную ДНК с ВашН 1 и Ба 1 1 окончаниями.Линейную ДНК конструируют по методике примера 39 А, с тем исключением,50 19 1250174плазмид рЬ 0316 и рЬ 0317 представ лены на Фиг.9.П р и м е р 34 Конструирование клеток Мьппь Ье 1 с /р 10316 и 1 чьппь Ь 1 с /рЬОЗ 17.Конструкции, каждую отдельно, гото" вят по методике примера 4, с тем исклочением, что используют плазмиды рЬ 0316 и рЬ 0317, а не плазмиду рКС 214. Сконструированные таким об разом трансформанты Кышь Ьс 1 /рЬ 0316 и Мышь Ь 1 с /рЬ 0317 затем отдельно выращивают.в массовой культуре.П р и м е р 35. Конструирование плазмид рЬ 0318 и рЬ 0319 и трансформанты Е.со 11 К 12 ВЕ 783/рЬ 0318 и Е;со 1 К 12 ВЕ 783/рЬ 0319.Конструкции готовят по методике примера 33, с тем исключением, что используют плазмиду рКС 261, а не 20 плазмиду рКС 257. Трансформанты Е.со 1 з К 12 ВЕ 783/рЬ 0318 и Е.со 11 К 12 ВЕ 783/рЬ 0319 используют для выделения плазмид рЬ 0318 и рЬ 0319. Как и в примере ЗОВ, получают плаз" 25 миды двух ориентаций, в зависимости от ориентации вставленного, придающего устойчивость Фрагмента. Плазмиды и полученные трансформанты легко различают и идентифицируют традици- З 0 онными способами. Рестрикционный участок и функциональная карта плазмид рЬО 318 и рЬ 0319 представлены на фиг,9П р и м е р 36. Конструирование клеток Мышь Ьс 1 с /рЬ 0318 и Мьппь ЬС 1 с /рЬ 0319.Конструкции готовят каждую отдельно в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что используют плазмиды рЬ 0318 и рЬ 0319, а не плазмиду рКС 214. Сконструированные таким образом плазмиды Мышь Ьс 1 с /рЬ 0318 и Мыпь Ьй 1 с /рЬ 0319 затем отдельно выращивают в массовой 45 культуре.П р и м е р 37. Конструирование пл амид рЬ 0320 и рЬ 0321 и трансформанты Е.со 1 х К 12 ВЕ 1041/рЬ 0310 и Е,со 1 х К 12 ВЕ 1041/рЬ 0321.Конструкции готовят по методике примера 33, с тем исключением, что используют плазмиду рКС 275, а не плазмиду рКС 257, Полученные трансформанты Е.со 11 К 12 ВЕ 1041/рЬ 0320 и Е.со 11 К 12 ВЕ 1041/рЬ 0321 использу- ют для выделения плазмид рЬ 0320 и рЬ 0321, Как и в примере ЗОВ, по21 1250 что используют плазмиду рКС 259, а не плазмиду УЕр 24. Получают осадок, содержащий требуемую линейную ДНК. По-следнюю растворяют в 5 р л 5 мМ ИаС 1 и хранят при 4 С для дальнейшего использования.В. Связывание и трансформация.Связывание и трансформацию в Е.со 1 К 12 ВЕ 783 проводят по методике примера 28 В, с тем исключением, что Ю связывают фрагменты ДНК, приготовленные в примерах 39 А .и Б, а не, Нае 11 фрагменты плазмид рПК 222 и рКС 261. Их используют в последующих трансформациях. Некоторые из полученных трансформантов, как видно из гель-электрофореза и других тестов содержат требуемую плазмиду, Та- .кой трансформант - Есо 11 К 12ВЕ 783/рКС 273 - отбирают, выращивают 20на пластине, культивируют и исполь- .зуют для последующего выделения плазмиды рКС 273. Рестрикционный участок и функциональная карта плазмиды рКС 273 представлена на фиг.10. 25П р и м е р 40, Конструирование клеток БассЬагощусез сетечзхае/рКС 273.Дрожжи ЯассЬатовусез сетечзае выращивают в смеси 1%-ного дрожжево" ЗО го экстракта (2%-ный бактопептон) и 1%-ной глюкозы, используя традиционные микробиологические процедуры. Трансформацию плазмиды рКС 273 в дрожжи проводят по известной методике. Н 1 ппеп ет а 1. 1978, Ртпс. Лат. Асад. Яс. ПЯА 75: 1929. Отбирают трансформанты по их способности к росту в минимальной среде с недостатком урацила (ита фенотип). Пта -трансфор манты последовательно испытывают на способность к росту в комплексной среде, дополненной 200.мг/мл гигромицина В. Такая доза является леталь-, ной для нетрансформироланных клеток 45 БассЬатошусез сетешзае рКС 273. Трансформантные клетки растут на . этих средах, тогда как нетрансформированные БассЬатотпусез сетеч 1 зае погибают. 50П р и м е р 41Конструирование плазмиды рЬ 0378 и трансформант Е.со 1 х К 12 ВЕ 783/рЬ 0378.А. Рзт 1 рестрикция плазмиды :рВК 322.55Рестрикцию проводят по методике примера 28 Б, с тем исключением, что,используют плазмиду рВР 322 и Рзт 1 174 22рестрикционный фермент с 10 Х реакционной смесью (500 мМ МаС 1, 60 мМ трис.НС 1, рН 7,4, 60 мММдС 1 ),а не плазмидурПК 222 и Нае 11 рестрикционный фермент, с ре ак цион ной смесью. Получе нный продукт Рзт 1.переваривания растворяютв 5 мл 5 мМ ИаС 1,Б, Рзт 1 рестрикция плазмидырКС 264.Рестрикцию проводят по методикепримера 41 А, с тем исключением, чтоиспользуют плазмиду рКС 264, а неплазмиду рВР 322, Полученный продуктРзт 1 переваривания растворяют в5,рл 5 мМ БаС 1,ГВ. Связывание и трансформация.Связывание и трансформацию Е.со 11К 12 ВЕ 783 проводят по методике рримера 28 Б, с тем исключением, что свя-зывают фрагменты ДНК, приготовленныев примерах 41 А и Б, а не Нае 11 фрагменты плазмид рПК 222 и рКС 261, и используют для последующей трансформации. Некоторые из трансформантов,как показывает антибиотический отбор, гель-электрофорез и другиеиспытания, содержат требуемую плазмиду. Такой трансформант - Е.со 1 хК 12 ВЕ 783/рЬ 0378 - отбирают, выращивают на пластине, культивируют и используют для последующего выделенияплазмид рЬ 0378,Как и в примере ЗОВ, получают плазмиды двух ориентаций, в зависимости от ориентациивставленного, придающего устойчивость фрагмента. Следовательно, в дополнение к плазмиде рЬ 0378, указанная процедура также генерирует плазмиды с обратной ориен- тацией. Эти плазмиды и полученные трансдюрманты легко различить и идентифицировать традиционными способами.Рестрикционный участок и функциональная карта плазмиды рЬ 0378 представлены на фиг. 10,П р и м е р 42, .Конструированиеклеток Бассйатовусез сетеч 1 заерЬ 0378,Трансформацию проводят по методикепримера 40, с тем исключением, чтоиспользуют плазмиду рЬ 0378, содержащую ген устойчивости к С 418 а неплазмиду рКС 273. Трансформанты идентифицируют традиционным скринингомреципиентных клеток дрожжей на налиТаблица 1 Тип клеток Концентрация антибиотикав культуральной среде,г/мл 0 200 400 Е.со 1 д К 1 Е.со 1 з. К 12 ВЕ 827/рКС 203Е.со 11 К 12 ВЕ 827Е.со 11 К 12 ВЕ 827/рКС 214Е.со 11 К 12 ВЕ 827/рКС 2 15 Т ь Ьй 1 с ь Ьй 1 /рКС 214 ппь 1.е 1 с" /рКС- рост есть; - отсутствие роста;Я/Т - испытание не прово ось.Табл а 2 Концентрации антибиотикв культуральной среде,р г/мл ип клет 0+ Мышь ЬОс" /рКС 214 Мышь Ьс 1 /рКС 215 23 1250174 24чие плаэмиды ДНК. Таким обраэом, же-сегечдзхае рЕ 0378 легко идентифицилаемые трансформанты БассЬ 4".отпусеаруются и выделяются.1 ЮР ЫБ 03201 ИЯИБ) Я. рОИ(" 12 Л 8 Б) ХрОЛ 4 1 " 14.3 МИ Ц р 03. 1-135 нь) 5. ООтЯЬЬ) б,рОЗЯ "й,5 нЧ 7.р 1 0315(" 14, ЗКЪ) дрИ 0317 П 5 М лАТ ж/л Составитель Л.ЧибисаТехред Н.Бонкало Зимокосов тОРОВ ЕТОР ВКТОР Тираж 490 осуцарственного к елам изобретений и сква, Ж-Э 5, Раушск ОДПИСН Ф мятежа Сс ткРытий я наб., О 1 13035 д. 4 Пр Проектна одственно-полигр екав 4311/60ВНИИБ иятие, г. Ужгород2. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что плазмиду рКС 222получают обработкой плазмиды рКС 7Ферментами рестрикции Ба 1 1 и Вя 1 1с последующим сшиванием полученныхфрагментов с фрагментами 2,75 квБа 1 1/В 81 11.3. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что плазмиду рБС 701получают сшиванием Фрагментов 7,5 квВеТ 11.4. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем,что плазмиду рКС 257получают обработкой плазмиды рБС 70.1ферментом рестрикции Нае 11, а затем полученные фрагменты сшивают.5. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что плазмиду рКС 261получают обработкой плазмиды рКС 257ферментом рестрикции Бас 1, а затемполученные фрагменты сшивают.6. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что плазмиду рКС 275получают обработкой ферментом Нае 11плазмиды рКС 261 и р 13 К 222, а затемполученные Фрагменты сшивают.7, Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что плазмиду рКС 264получают обработкой ферментом рестрикции Есор 1 плазмид рКС 259 и уЕР 24,затем полученные фрагменты сшивают.8, Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что плазмиды рКС 214и рКС 215 получают обработкой плаз.миды рБ 75 дре ферментом рестрикцииВеТ 11 с последующим сшиванием полученных фрагментов с 7,5 кв Вя 1 11фрагментами плазмиды рКС 203,9. Способ по п.1, о т л и ч а.ю -щ и й с я тем, что плазмиды рСЭ 1и рСВ 2 получают обработкой плазмиды рТ,С 669 Ферментом рестрикцииВаш Н 1 с последующим сшиванием полученных фрагментов с 7,5 кв ВяТ 1 Тфрагментами плазмиды рКС 203.10. Способ по п.1, о т л и ч а -ю щ и й с я тем, что плазмидырСЭЗ и рС 04 получают обработкойплазмиды рФ 4 ферментом рестрикцииНхпй 111 и добавлением Нпй 111связки к 7,5 кв Нпй 111 фрагментуплазмиды рКС 203 с последующим сшиванием фрагментов.11. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что фрагмент 1,62 квЕсор 1/Ба 1 1 получают обработкойплазмиды рКС 222 Ферментами рестрикции Есор 1 и Ба 1 1. 12, Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что фрагмент 1,51 кв Ба 1 Т/ВВТ 11 получают обработкой плазмиды рКС 222 ферментами рестрикции Бас Т и Вр 1 11.13. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что плазмиды рСР 10 и рС 011 получают обработкой плазмидырБ 75 ррс ферментом рестрикции ВеТ 11 и добавлением к 1,5 1 кв Есор 1/Ба 1 Т фрагменту плазмиды рКС 203 Вр 1 11связки, а затем полученные Фрагменты сшивают.14, Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что плазмиды рСВ 12 и рСП 13 получают обработкой плазмиды рБ 75 ярс ферментом рестрикции Вр 1 1 Т и добавлением к 1,65 кв Есор Т/Ба 1 1 фрагменту плазмиды 1 рКС 203 В 81 11 связки, а затем полученные фрагменты сшивают.15. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что плазмиды рСЭ 14 и рСР 15 получают обработкой плазмиды рЯ 758 рй Ферментом рестрикции Вя 1 Т 1 и добавлениемк 2,75 кв Ба/Вф 9 фрагмеь ту плазмидырКС 203 ВЦ связки,а затем полученные Фрагментысшивают.16. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что плазмиды р 10314и рЬ 0315 получают обработкой плазмидрКС 259 и рБ 758 р ферментом рестрикции Вр 1 11, а затем полученные фрагменты сшивают.17, Способ по п.1, о т л и ч а ю - .щ и й с я тем, что плазмиды рЬ 0316и рЬ 0317 получают обработкой плазми- .ды рКС 257 ферментом рестрикции Ба 1 Т, добавлением ВяТ связки к Бас 1 окончанию линейной последовательности ДНК и обработкой плазмиды рБ 758 рс ферментом, рестрикции.,В 81 11, а затем полученные фрагменты сшивают.18. Способ по п,1, о т л и ч а ю - .щ и й с я тем, что плазмиды рЬ 0320 и рЬ 0321 получают обработкой плазмиды рКС 275 ферментом рестрикции Бас 1, добавлением Вр 1 11 связки к Бас 1 окончанию линейной последовательности ДНК и обработкой плазмиды рБЧ 58 рс ферментом рестрикции Вд 1 11, затем полученные фрагменты сшивают.19. Способ по и. 1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что плазмиду рЬ 0378 получают обработкой плазмиды рВК 322 ферментом рестрикции рБС 1 и плазмиды рКС 264 ферментом рестрикции рБс 1, затем полученные Фрагменты сшивают.1250174 Эппендорфа емкостью 1,5 мл и центрифугируют около 15 с. Если нет другихуказаний, все манипуляции осуществляются при комнатной температуре. Образовавшийся верхний слой осторожноудаляют тонким наконечником аспиратора, и клеточный осадок суспендируют примерно в 100 рл свежеприготовленного лиэоцимного. раствора, который содержит 2 мг/мл лиэоцима, 50 ммглюкозы, 10 мм ЦДТА (пиклогександи-аминотетраацетата) и 25 мм трис-НСГ(рН 8,0). После инкубации при 0 Св течение 30 мин прибавляют примерно200 рл щелочного раствора НДС (натрийдодецилсульфата) (0,2 н. МаОН,1% НДС) и трубку осторожно встряхивают, а затем выдерживают 15 мин при0 С. Прибавляют примерно 150 рл3-молярного ацетата натрия (приготовленного растворением 3 моль ацетата натрия в минимальном количествеводы, установлением,рН 4,8 с помощьюледяной уксусной кислоты, а затем доведением объема до 1 л) и затем содержимое трубки осторожно перемешивают перевертыванием в течение нескольких секунд, во время которых образуется сгусток ДНК.аТрубку вьдерживают при 0 С в течение 60 мин, а затем центрифугируют 5 мин, получая почти прозрачныйверхний слой. Переносят примерно 0,4 мл верхнего слоя во вторую центрифужную трубку, куда добавляют 1 мл холодного этанола. После вьдерживания . трубки при -20 С в течение 30 мин полученный осадок собирают цеитрифугированием (2 мин) и удалением верхнего слоя аспиратором. Растворяют собранный таким образом осадок в 100 Цл 0,1 молярном ацетате натрия (0,05 М трис-НС 1, рН 8) и повторно осаждают добавлением 2 объемов холодного этанола. После 10 мин при 20 С осадок собирают центрифугированием, как описано вышее. Он представляет собой требуемую плазмиду ДНК Е.со 1 д 32225..Б,Трансформация Е,со 11 ЛК 225 плазмиды ДНК и вьделение плаэмиды рКС 203.Растворяют осадок Е.со 1 ЛК 225 плазмиды ДНК в примерно 100 р л 0,1- молярного ацетата натрия (0,05 М трис-НС 3, рН .8) и осаждают 2 объемами холодного этанола. Собирают полученную плазмиду ДНК и затем растворя ют примернов 40 рл воды илн разбав 10 20 35 Изобретение относится к генной инженерии, а именно к получению гибридных плаэмид, содержащих последовательность ДНК, передающую устойчивость к гигромицину, 5На фиг. 1-10 представлены картыплазмид рКС 203, р 875 ррс, рКС 2 14,рКС 215, рКС 222, рБС 701, рКС 257,рКС 259, рКС 261, рНС 275, рКС 259рКС 261, рКС 275, рКС 264, р 1,0378и рКС 273 соответственно.В описании использована следующаятерминология.Структурный ген - последовательность ДНК, которая кодирует полипептид.Контрольный элемент - последовательность ДНК, которая частично промотирует и регулирует экспрессиюструктурального гена.Эукариотный промотор - последовательность ДНК, которая частично промотирует и регулирует экспрессиюструктурального гена в эукариотнойклетке25Прокариотный репликон - последовательность ДНК, которая контролируети регулирует репликацию ДНК в прокариотной клетке.Клонирующий вектор рекомбинантной 30ДНК - любой агент, включая, плазмиды,3бактериофаги и вирусы, состоящий измолекулы ДНК, к которой могут бытьдобавлены один или более допольительных сегментов ДНК.Трансформация - введение ДНК вреципиент вклетку хозяина, котороеизменяет генотип и, следовательно,приводит к стабильному и наследуемому изменению в клетке-реципиенте. 40Вставной изомер - одна из двух илиболее возможных рекомбинантных молекул ДНК, образовавшихся при вставкефрагмента ДНК, в один из двух илиболее совместных центров на реципи(фиг.1).А. Вьделение плазмиды ДНК иэ Е.со 11ЛВ 225. 50Культивируют бактерии Е.со 1 х 52225ляют буфером и, наконец, используют для трансформации Е.со 1 К 12 ВЕ 827 в соответствии с методикой трансформации (Ъепздп 1 с, 1974, Се 11 3:315). Е,со 11 К 12 ВЕ 827 хранится вАмерикан ской коллекциитипов культурРокквилл, Мэрилэнд, номер АТСС 31911. Полученные трансформанты отбирают на ТД- агаре (1% триптона, 0,5 дрожжевого экстракта, 0,5 хлористого натрия, О 1,5 , агара., рН. 7,4), содержащем 200 рг/мл антибиотика гигромицина В. Некоторые из трансформантов, как показано гель-электрофорезом и другими тестами, содержат как большие, так и меньшие (15 кв) плазмиды и являются устойчивыми как к антибиотику ампициллину, так и к гигромицину В. Другие трансформанты содержат только меньшую, чем 15 кв плазмиду 20 и являются устойчивыми к антибиотикам гигромицину В и С 418, но являются чувствительными к ампициллину.Трансформанты последнего типа помещают на ТД-агар, содержащий 1 мг/мл 25 антибиотика гигромицина В, и культивируют с использованием стандартных микробиологических методик. Используют полученные клетки в соответствии с процедурой примера 1 А для выделения описанной устойчивой к гигромицину В и С 418 15 кв плазмиды-. плазмиды рКС 203. Наличие генов устойчивости к антибиотикам гигромицину В и С 418 в плазмиде рКС 203 подтверждается последующей трансформацией и селекционным анализом.П р и м е р 2. Выделение генов устойчивости к антибиотикам гигроми-, цину В и С 418 и контрольных элементов. 15 35 Обрабатывают примерно 5 р г плазмиды рКС 203 ДНК,381 11 рестрикционным ферментом в соответствии с известной методикой, Рестрикционные ферменты и 45 инструкции, могут быть получены из следующих источников: Бетесда Рисерч Лабораториз Инк., Бокс 6010, Рокквилл, Мэрилэнд 20850, Боерингер Маннхейм Биохемикалс 7941 Кастлевей Драйв П.О, 50 Бокс 50816 Индианаполис. Индиана46250, Нью Инглэнд Био Лабс., Инк.283 Кэбот. Беверли, Массачусеттс01915, Рисерч Продактс Милс Лабораториз Инк., Элкхарт, Индиана 46515. Из 55 7,5, 5,8 и 0,5 кв фрагментов собирают 7,5 кв Вя 1 1 Т фрагмент, содержащий требуемые гены устойчивости к антибиотикам гигромицину В и С 418 и контрольные элементы. Это подтверждается трансформацией и селекционным анализом, который показывает, что клетки, которые обычно являются чувствительными к антибиотикам гигромицину В и С 418, являются устойчивыми при трансформации 7,5 кв Вя 1 11 фрагмента.П р и м е р 3. Конструирование плазмид рКС 214 (Фиг,2) и рКС 215 (фиг.4) и трансформантов Е.со 1 х К 12 ВЕ 827/рКС 214 и Е.со 11 К 12 ВЕ 827/рКС 215,Плазмида рБЧ 5 ррс,(фиг.2), конструкция которой описана Муллиганом и Бергом, 1980, БсМепсе 209/4463/: 1422, имеет только один участок Вя 1 11 в ярс-гене, Клонирование позволяет осуществить экспрессию генов устойчивости кантибиотикам гигромицинуВ иС 418Обрабатывают около 5 г плазмидырЯ 75 рр ДНК Вя 1 11 рестрикционнымферментом в соответствии с известнойметодикой. После инактивации Фермента при нагревании в течение 5 минопри 70 С смешивают примерно 1 р гДНК в соотношении 1:1 с 7,5 кв Вя 1 11Фрагментом рКС 203. фрагменты соединяют, используя ДНК-лигазу фага Т 4.ДНК-лигаза и инструкции могут бытьполучены из следующих источников:Бетесда Рисерч Лабораториз, Бокс 6010,Рокквилл, Мэрилэнд 20850,Лигатированную смесь используютдля трансформации Е.со 1 х К 12 ВЕ 827в соответствии с известной методикой(Уепз.п 1 1974, Се 11 3:315) на ТДпластинах, содержащих 100 рг/мл каждого из антибиотиков ампициллина иапрамицина. Рекомбинантные клоны помещают на ТД-пластины, содержащие100,рг/мл ампициллинаи 200 уг/млантибиотика гигромицина В. Около по-ловины рекомбинантных клонов, устой-.чивых к антибиотику,гигромицину В,содержат плазмиду рКС 214 (фиг,3),тогда как остальные содержат плазмиду рКС 215,Выделяют плазмиду ДНК из приведенных клонов в соответствии с методикой примера 1 А и идентифицируют рестрикционным ферментным анализом.Так же индентифицируют сконструированные плазмиды рКС 214 и рКС 215 исконструированные трансформантыЕ.со 11 К 12 ВЕ 827/рКС 214 и Е.со 11 К 12ВЕ 827/рКС 215 и затем выделяют длядальнейшего использования.П р и м е р 4. Конструированиеклеток Мьппь ЬФ /рКС 214,Культивируют клетки Мышь ЬФ регулярным сохранением клеток в средесодержащей минимум основной среды ссолями Ирла (Еаг 1 е) и неосновных ааминокислот (Еар 1 е 1959, Ясепсе130:432), 107 объем/объем сывороткиноворожденного теленка и 292 г/млглютамина. Культивированные такимобразом клетки Мьппь ЬгЕ затем трансформируют плазмидой рКС 214 известным способом по методике Виглера ссотр. 1979, Ргос,Наг.Асад.Ясх.ПЯА76/3/:1373, с тем исключением, чтоприбавляют 100-300 нг плазмиды ДНКна каждую пластину в 1 мл осажденного фосфата кальция. Культивируютсреду описанным образом. После 4 ч.инкубации при 37 С среду переносятасвежую среду и культивируют клеткиеще 20 ч. В это время осуществляютдавление отбора антибиотиком - гигромицином В, заменяя среду селективной, дополнительно содержащей 751000 нг/мл антибиотика гигромицинаВ. Предпочтительная концентрация антибиотика для селекционной среды200 иг/мл. Селективную среду заменяют после первого дня, затем через "два дня и, наконец, на каждый третий день в течение 2-3 недель, вовремя которых вырастают трансформантные клоны. Колонии собирают вручную,используя пипетку, и выращивают вмассовой культуре при непрерывномдавлении отбора. Культивированныетаким образом устойчивые к гигромицину В клетки включают требуемыетрансформанты Хьппь ЬСЕ рКС 214.П р и м е р 5. Конструированиеклеток Мьппь Ьг 1 с рКС 215.Конструируют клетки Мьппь Ьг 1 срКС 215 в соответствии с методикойпримера 4, с тем исключением, чтодля трансформации используют неплазмиду рКС 214, а плазмиду рКС 215.Сконструированные таким образомтрансформанты Мышь ЬгЕ рКС 216 затем выращивают в массовой культуре.П р и м е р 6, Устойчивость тран-сформантов к .антибиотикам гигромицину В и С 418,Способность плазмид рКС 203, рКС 214и рКС 215 придавать устойчивость к ан.тибиотикам гигромицину В и С 418 опре"деляют путем испытания трансформированных и не трансформированных клеток Е.со 1 и Мьшь ЬгЕ на рост всреде с различным количеством анти"биотиков Среда.и условия культивирования для клеток Е.со 1 и Мьппь Ьг 1 сто же, что и в примерах 1 А и 4. Результаты испытаний устойчивости кгигромицину В даны в табл1, к гигро 10 мицину С 418 - в табл.2.Клетки Мьппь Ьг 1 с рКС 214 и Мьппь ЬгГрКС 215 не только воспроизводятся приконцентрации 400 пг/мл, но выживаюти при,более высоких концентрациях,15 превышающих 1000 рг/мл.П р и м е р 7, Конструированиеплазмид рСД 1 и рСД 2 и трансформантов Е.со 11 К 12 ВЕ 827/рСД 1 и Е.со 1К 12 ВЕ 827/рСД 220вПлазмида рЬС 669 конструкция которой описана Спагепге апд РгазЬпе1981, Ргос, Наг. Асад. Яс 1, ПЯА78/4/:2199, содержит единственныйрестрикционный ВАНЧ участок в цитохромном гене, Клонирование 7,5 квВрЛ 11 фрагмента плазмиды рКС 203 вэтот участок позволяет произвестиэкспрессию гена устойчивости к антибиотику гигромицину В, Требуемуювставку легко осуществить, так какВя 1 11 фрагменты содержат 5 протяженностей с последовательностью ГАТК,,которые являются идентичными,5-типротяженностям ВашН 1 фрагментов.З 5 Следовательно, Вя 1 11 фрагменты иВаш 11 фрагменты являются совместимыми и могут быть легко связаны для,получения рекомбинантов .Плазмиды рСД 1 и рСД 2 и трансфор 4 О манты Е,со 11 К 12 ВЕ 827/рСД 1 и Е.со 11К 12 ВЕ 827/рСД 2 конструируют в соответствии с методикой примера 3 с,но с использованием плазмиды рЬС 699с одним участком ВашН 1 вместо плаз 45 миды рЯ 75 ррг. В зависимости от ориентации Вр 1 1 фрагмента получаютплазмиды с двумя ориентациями. Плазмида рСД 1 означает рекомбинантныеплазмиды, в которых Яа 1 рестрикционный участок ближе к цга-гену. Плазмида рСД 2 означает плазмиды с обратнойориентацией.П р и м е р 8. Конструированиеклеток ЯассЬагоюусез сеге 1 зае/рСД 1Выращивают дрожжи ЯассЬагошусезсегечзае на 17 дрожжевом экстракте1250174 5015 20 30 5055 цедур. Трансформацию плазмиды рСД 1в дрожжи осуществляют в соответствиис известной методикой Нппеп аг а 11.1978, Ргос. Наг. Асад. Яс. БЯА75;1929. Отбирают трансформанты придобавлении летальных доз антибиотика гигромицина В к культуральнойсреде,П р и м е р 9, Конструированиеклеток ЯассЬагошусез сегечзае/рСД 2.Трансформанты конструируют в соответствии с методикой примера 8 стем исключением, что используютплазмиду рСД 2 вместо плазмиды рСД 1П р и м е р 10, Конструированиеплазмид рСДЗ и рСД 4 и трансформантовЕ.со 1 К 12 ВЕ 827/рСДЗ и Е.со 1 К 12ВЕ 827/рСД 4Плазмида р 04, конструкция которойописана Яо 1 п 1 сЕ 1981, СеП 24135,содержит большую часть Аденовируса 2(Л 2) позднего промотора на карте,скоординированной 15,4 (Есор 1) до16,6 (Нпй 111). Клонирование 7,5 квВр 1 11 Фрагмента плазмиды рКС 203 вНпд 1 П участок плазмиды р 04 позволяет произвести экспрессию гена устойчивости к антибиотику гигромицину В. Требуемую конструкцию получают при добавлении в соответствии с известной методикой Ульриха с сотр. (1977 Яс 1 епсе 196: 1313) Ндпд 111 связок к 7,5 кв Вя 1 11 фрагменту и последующего связывания модифицированного таким образом фрагмента с Нжй 111 обработанной плазмидой р 04 при использовании Т 4 ДНК-лигазы. (Нпй 111 /Й/ККААГКТТГГ/ и другие связки доступны из Коллаборатив Рисерч Инк., 1365 Мэйн Стрит, Вальтам, МА 02154) После обеспечения 7,5 кв Вя 1 11 Фрагмента Нпй П 1 связками проводят связывание Фрагмента в плазмиду р 04 для образования плазмид рСДЗ и рСД 4 в соответствии с методикой примера 3. Последующую трансформацию в Е,со 1 х К 12 ВЕ 827 для образования Есо 11 К 12 ВЕ 827/рСДЗ и Е.со 1 К 12 ВЕ 827/рСД 4 также проводят в соответствии с методикой примера 3.Как и в примерах 3 и 7, плазмиды двух ориентаций получают в зависимости от ориентации вставленного придающего устойчивость фрагмента. Плазми" да рСДЗ означает рекомбинантные плаэмиды, в которых Яа 1 1 рестрикционный участок вставленного придающего устойчивость к антибиотику гигромицину В фрагмента ближе с Есор 1 центру АЙ 2 промотора. Плазмида рСД 4 означает плаэмиды с обратной ориентацией.П р и м е р 11. Конструирование клеток Мышь 1.с 1 с /рСДЗ.Проводят в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что используют плазмиду рСДЗ вместо плазмиды рКС 214.П, р и м е р 12. Конструирование клеток Мышь 1 Ис /рСД 4.Проводят по методике примера 4, с тем исключением, что используют плазмиду рСД 4 вместо плазмиды рКС 215.П р и м е р 13, Конструирование плазмиды рКС 222 и трансформанта Е.со 1 х К 12 ВЕ 827/рКС 222.А, Выделение 2,75 кв Яа 1 1/В 81 11Фрагмента плазмиды рКС 203.Обрабатывают. известным способом пометодике, упомянутой в примере 3,примерно 5 Уг плазмиды рКС 203 ДНК Яа 1 1 иВя 1 11 рестрикционными ферментами.Выделяют традиционным способом 2,75 квФрагмент, который содержит гены и контрольные последовательности устойчивости к антибиотикам гигромици ну В и 0418.Б. Связывание и окончательное конструирование.35Обрабатывают примерно 5 рг плазмиды рКС 7, конструкция которой описана Рао и Роджером, 1979, Се 11, 7:79, Яа 1 1 и Вр 1 11 рестрикционныйи фер- ,1 О ментами. После инактивации ферментовопри нагревании при 70 С в течение 5 мин примерно 1 Юг ДНК смешивают в соотношении 1:1 с 2,75 кв Яа 1 1/Вя 1 11 фрагментом рКС 203, Соединяют фрагменты, используя Т 4 ДНК-лигазу, в соответствии с методикой примера 3. Полученную плазмиду рКС 222 трансформируют в Е.со 1 К 12 также по методике примера 3. Получают приданную устойчивость к антибиотикам ампициллину, гиромицину В и С 418.П р и м е р 14. Выделение 1,51 квЯас 1/Вр 1 11 фрагмента плазмиды рКС 222 (фиг. 5), придающего устойчивость к гигромицину В.Выделяют требуемый фрагмент ДНКв соответствии с методикой примера13 А с тем исключением, что для рестрикционного переваривания В 81 11 сформации используют плазмиду рСД 11, используют Бас 1, а не Яа 1 1. а не плазмиду рКС 214. СконструироП р и м е р 15. Выделение 1,65 кв ванная таким образом Мышь Ьс 1 й/рСД 11 ЕсоР, 1/Ба 1 1 фрагмента плазмиды 5 может быть выращена в массовой кульрКС 222, придающего устойчивость к туре.гигромицину С 418. П р и м е р 19. КонструированиеВыделяют требуемый фрагмент ДНК в , плазмид рСД 12 и рСД 13 и трансфорсоответствии с методикой примера 13 А, мантов Е.со 1 К 12 ВЕ 827/рСД 12 и с тем исключением, что для рестрикци О .Е.со 1 К 12 ВЕ 827/рСД 13,онного переваривания используют Плазмиды конструируют в соответЕсой 1, а не Вя 1 11, с За 1 1. ствии с методикой примеров 3 и 101П р и м е р 16, Конструирование с тем исключением, что 1,65 квплазмид рСД 10 и рСД 11 и трансформан- ЕсоК 1/Яа 1 1 фрагмент плазмидытов Е.со 1 К 12 ВЕ 827/рСД 10 и Е.со 1 5 рКС 222 используют вместо 7,5 квК 12 ВЕ 827/рСД 1 1, Вя 1 11 .фрагмента плазмиды рКс 203и Вд 1 11, а не Нпс 1 П 1 связки приКонструируют требуемые плазмидысоединяют к придающему устойчивостьпо методике примеров 3 и 10, .с темисключением, что используют 1,51 квк антибиотику фрагменту. 120 фрагмент с Вя 1 11 связками вставляас 1/Вр 1 11 фрагмент плазмиды. рКС 222 вместо 7,5 кв Вр 1 11 фраг ют в плазмиду. Р 85 Ярс в соответствиимента плазмиды рКС 203 и к придающемус методикой примера 3.Как и в примере 16 получают плазустойчивость к антибиотикам фрагментуприсоединяют я ф а не 1 п 25В 1 11 Н Й 111миды двух ориентаций, ПлазмидарСД 12 означает рекомбинаитныесвязки. 1,51 кв фрагмент в Ве 1 11плазмиды, в которых Рзс 1 рестриксвязками вставляют в плазмиду р 875 дрспо методике примера 3.ционный участок уставленного придающего устойчивость к антибиотикуС 4 18 фрагмента ближе к Нпд 1 Пплазмиды двух ориентаций в зависиЗО участку ар-гена, Плазмида рСД 13мости от ориентации вставленногоозначает плазмиды с обратной ориенфрагмента, придающего устойчивостьтацией.к антибиотику. Плазмида рСД 10 означает рекомбинантные плазмиды, в коТрансформация плазмид рСД 12 и рС 13в Е.со 1 К 12 ВЕ 827 соответственно сторых Ача 1 рестрикционный участоквставленного придающего устойчивость 35 образованием Е.со 1 д К 12 ВЕ 827/рСД 12к гигромицину В фрагмента ближе кН пд 1 П астку барс-гена. П аз а водится в соответствии с методикойрСД 11 означает плазмиды с обратнойпримера 3, с тем исключением чтоФ . Вориентацией.для селекции трансформантов используа мид СД 10 иТрансформацию плазмид рСД40 ют антибиотик С 418, а не гигроми рСД 11 в Е.со 1 К 12 ВЕ 827 с образовацин,В.кием соответственно Е.со 1 К 12 П р и м е р 20. КонструированиеВЕ 827/рСД 10 и Е,со 1 х К 12 ВЕ 827/рСД 11 клеток Мышь Ьск /рСД 12.осуществляют по методике примера 3. Конструирование осуществляют в соП р им е р 17. Конструирование .ответствии с методикой примера 4, с45клеток Мьппь Ьй 1 с /рСД 10. тем исключением, что при трансформаКонструирование осуществляют в со- ции используют плазмиду рСД 12, а неответствии с методикой примера 4 с плазмиду рКС 214 и для селекции трантем исключением, что используют плаз сформантов используют антибиотик миду рСД 10, а не плазмиду рКС 214 С 418, а не гигромицин В. Сконструи 50.при трансформации. Сконструированная рованные таким образом Мьппьтаким образом Мьппь Ьс 1 /рСД 10 может Ьс 1 /рСД 12 могут быть выращены вбыть выращена в массовой культуре.массовой культуре.П р и м е р 18. КонструированиеП р и м е р 21. Конструированиеклеток Мьппь Ьс 1 с /рСД 11, клеток Мьппь ЬС 1 с /рСД 13.Проводят конструированйе в соответ. Конструирование осуществляют в соствии с методикой примера 4 с тем ответствии с методикой примера 4, сисключением, что в процедуре тран- тем исключением, что при трансформа- -т- м(10 мл трис-НС, рН 8,0, 1 мм ЭДТУК)5 /йл ДТТ (100 мм дитиотрейтола),5 рл (1000 рг/рл) БСА (бычьего сы 5 вороточного альбумина),.25 Ил воды,5 рл 10 Х реакционной смеси (600 мМИаС 1, 100 мМ трис-НС 0, рН 7,4,100 мМ МяС 1 ) 5 р(л (5 единиц) Вя 1 11рестрикционйого Аермента. Реакциюв10 заканчивают инкубированием при 70 Св течение 5 мин, затем реакционнуюсмесь выливают на лед, экстрагируютфенолом и смесью хлороформа с изоами.ловым спиртом (24:1), затем осажда 15 ют этанолом. Растворяют полученныеВп 1 11 рестрикционные фрагменты в.5 рл 5 мМ хлористого натрия и затемсвязывают. Связывание проводят привзаимодействии 1 рл Ве 1 11 рестрикти 20 рованной ДНК с примерно 38 у л воды,5,/Ол(10 мМ) АТФ, 5/Мл связывающейсмеси (500 мМ трис-НСВ, рН 7,8,200 мМ дитиотрейтола, 100 мМ МяС 1). и 1 Юл Т 4 ДНК-лигазы (10. Нью Ине о25 глэнд Биолаб единиц) при 16 С в течение 16 ч,Реакцию заканчивают инкубированиемпри 70 С в течение 5 мин, После охлаждения на льду используют получен 30 ную связанную смесь для трансформации Е.со 11 К 12 ВЕ 827 по известной методике транформации УепздпЫ 1974,на ТД-пластинах, содержащих 200 р г/лантибиотика гигромицина В. Некоторые из трансформантов, как показывает гель-электроАорез, содержат только требуемую, о 7,3 кв плазмиду.Такой трансформант Е,со 1 х К 12ВЕ 829/рБС 701 - отбирают на пластинах40 с ТД-агаром, содержащих 200 рг/рлантибиотика гигромицина В,. а затем.культивируют, используя традиционныемикробиологические методики. Полученные клетки используют для выделе 45 ния плазмиды рБС 701 в соответствии сметодикой примера 1 А. Наличие геновустойчивости к антибиотику гигромицину В и С 418 в плазмиде рБС 701,кроме того, подтверждается последую 50 щей трансформацией, отбором и рестриктивным Аерментным анализом, Рестрикционный участок и функциональная карта плазмиды , рЯС 701 дана наАиг.6.55 П р и м е р 26. Конструированиеплазмид рКС 257 и рКС 259 и трансформанты Е.со 1 д К 12 ВЕ 783/рКС 257 иЕ.со 1 К 12 ВЕ 783/рКС 259. 11 125ции используют плазмиду рСД 13, а неплазмиду рКС 214, и для селекциитрансАормантов используют антибиотик С 418, а не гигромицин В. СконЬструированные таким образом МышьЬп 1 с /рСД 13 могут быть выращены вмассовой культуре., П р и м е р 22. Конструированиеплазмид рСД 14 и рСД 15 и трансформантов Е.со 1 К 12 ВЕ 827/рСД 14 и Е.со 11ВЕ 827/рСД 15,Выделяют 2,75 кв Ба 1 1/Вр 1 11рагмент плазмиды рКС 203 по методике примера 13. Затем присоединяютмолекулярные связки в соответствиис методикой примера 10, с тем исключением, что используют Вя 1 11, а неН 1 пй 1 Т 1 связки. Полученный фрагментзатем вставляют в плазмиду рБ 758 рппо методике примера 3 для образования желаемой плазмиды,Как и в примере 16, получают плазмиды двух ориентаций. Плазмида рСД 14означает рекомбинантные плазмиды, вкоторых Аа 1 рестрикционный участокпридающего устойчивость к антибиотику Арагмента ближе к Ндпд 111участку дрг.-гена. Плазмида рСД 15означает плазмиды с обратной ориентацией.ТрансАормацию плазмид рСД 4 и рСД 15в Е.со 1 К 12 ВЕ 827 для образованиясоответственно Е.со 1 К 12 ВЕ 827/рСД 14и Е.со 1 К 12 ВЕ 827/рСД 15 также проводят по методике примера 3.П р и м е р 23. Конструированиеклеток Мышь 1,С 1 с /рСД 14.Конструирование осуществляют в соответствии с методикой примера 4, стем исключением, что при трансформации используют плазмиду рСД 14, а неплазмиду рКС 214. СконструированныйМьппь 1.п 1 с /рСД 14 может быть выращенв массовой культуре. П р и м е р 24. Конструирование клеток Мьппь Ьс 1 с /рСД 15.Осуществляют конструирование в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что при трансформации используют плазмиду рСД 15, а не плазмиду рКС 214. Сконструированный таким образом Мышь Ьпк /рСД 14 может быть выращен в массовой культуре.П р и м е р 25. Конструирование плазмиды рБС 701 и трансформант Е.со 1 К 12 ВЕ 827/рБС 701.Инкубируют при 37 С в течение 1 ч примерно 5 рл/5 рг плазмиды рКС 203 0174 1213 1250174 14Плазмиду готовят в соответствии с смесь 10 Х (500 мМ ИаС 1, 60 мМ трисметодикой примера 25, с тем исключе, НС, РН 7,5, 50 мМ МяС 1 ), вместонием, что используют плазмиду РБС 701 плазмиды РЯС 701, В 81 11 рестрикцион-и Нае 11 рестрикционный Фермент и . ного фермента и реакционной смеси.10 Х реакционную смесь (60 мМ трис Плазмида РКС 261 имеет л 3,2 кв и приНС 1, РН 7,4, 60 мМ МяС 1), а не дает устойчивость к гигромицину В.плазмиду РКС 203 и Вр 1 11 рестрикци- Используют полученную связанную реонный Фермент и реакционную смесь, акционную смесь для трансформацииПлазмида РБС 701 содержит более одно- Е,со 1 х К 12 ВЕ 783 в соответствии сго Нае 11 рестрикционного участка, 1 О процедурой трансформации примера 25,следовательно Нае 11 перевариваниеТрансформанты - Е.со 1 К 12и последующее связывание приводят ВЕ 783/РКС 261 - отбирают и испольк смеси различных плазмид. зуют для выделения плазмиды РКС 261Полученную связанную смесь, кото- в соответствии с примером 1 А. Налирая содержит требуемую придающую 15 чие гена устойчивости к антибиотикуустойчивость к гигромицину В,4,2 кв гигромицину В в плазмиде РКС 261 подплазмиду РКС 257, а также придающую тверждается последующей трансформаустойчивость к апрамицину, гигроми- цией, отбором и анализом последовацину В и С 418,. 5,0 кв, плазмиду . тельности ДНК. Рестрикционный учасРКС 259, используют для трансформа ток и Функциональная карта плазмидыции в Е.со 1 К 12 ВЕ 873 (хранится РКС 261 показаны на Фиг.7..в коллекции культур Северной регио- П р и м е р 28. Конструирование.нальной исследовательской лаборато- нлазмиды РКС 275 (фиг. 8) и трансфор-,рии, Пеория, Иллинойс, под номером мант Е.со 1 К 12 ВЕ 1041/РКС 275.В) по методике трансформации 25 А, Частичная Нае 1 Е рестрикцияпримера 25, плазмиды РКС 261.Отбирают требуемые трансформанты, Инкубируют при 37 С в течение 1 чпомещают на пластину с ТД-агаром, примерно 5 рл (5 рг) плазмиды РКС 261,содержащим 200 рг/мл антибиотика выделенной в примере 27, в ТЕ-буферегигромицина В, а затем культивируют з 0 5 рл ДТТ, 5 рл (.1000 мг/мл) БСА,каждый отдельно, традиционными ми рл воды, 5 рл (5 единиц).Нае 1кробиологическими методами. Трансфор- рестрикционного фермента и 5,/л 10 Хманты, содержащие РКС 257, легко и реакционной смеси, После завершенияудобно идентифицируют с помощью реакции инкубирования при 70 С в тескрининга на устойчивость к гигроми- З 5 чение 5 мин реакционную смесь охлажцину В, а трансформанты, содержащие дают на льду, экстрагируют Фенолом иплазмиду РКС 259, идентифицируют с смесью хлороформ - изоамиловый спиртпомощью скрининга на устойчивость к (24:1), а затем осаждают этанолом.апрамицину и гигромицину В. Трансфор , Полученные Нае 11 рестрикционныеманты Е.со 1 К 12 ВЕ 783/РКС 257 и 40 фрагменты растворяют в 5 рл 5 мМЕ.со 13. К 12 ВЕ 783/РКС 259 используют НаС 1,для выделения плазмид РКС 257 и РКС 259В. Выделение . 394 пс р 1 ас фрагменсоответственно по методике примера та, содержащего Нае 1 окончание.1 А. Наличие генов устойчивости к ан-.тибиотикам в соответствующих плазми р Рно 5 рл (5 рг) плазмидыПримерно 5 лдах подтверждается последующей тран- РПН 222, выделенной на Е.со 1 К 12сформацией, отбором и рестрикционным ВЕ 1166/рБК 222, в соответствии с меферментным анализом. рестрикционный . тодикой примера 1 в ТЕ-буфере Нае 11участок и Функциональная карта каждой переваривают в соответствии с метоплазмидРКС 257 и РКС 259 показаны икой пРимеРа 28 А с тем исключе50на фиг. 6 и 7 соответственно.ем, что реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч, чтобыП р и м е р 27. Конструирование обеспечить полное, а не частичноеплазмиды РКС 261 и трансформант Е.со 1переваривание. Полученные в резульК 12 ВЕ 783/РКС 261. .тате Нае 11 рестрикционные фрагменПлазмиду готовят по методике при ты растворяют в 5 рл и 5 мМ МаС 1.мера 25, с тем исключением, что ис- . Е.со 1 х К 12 ВЕ 1166/РЧК 222 являетсяпользуют плазмиду РКС 257 Бац ЗА 1 ре- штаммом, хранящимся в коллекциистрикционный Фермент и реакционную культур Северной региональной иссле.