Способ получения человеческого инсулина

)5 А 61 К 37/2 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) ЕН ИСАНИЕ ИЗО К ПАТЕНТУ е относится к биологической превращения человеческого еловеческий инсулин.ретения является повышеевого продукта,ый способ включает предшественника инсулина в нсулин, причем такой предет формунк-Рве-суз ------ суз В) (Вде В - водород, химически или ферментаивно расщепляемый аминокислотный оста(21) 4203477/14(72) Брюс Хилл ФВальтер ФрансВальден (ОЯ)(54) СПОСОБ ПОГО ИНСУЛИНА Изобретенихимии и касаетсяпроинсулина в чЦелью изобние чистоты целПредлагаемвращение пречеловеческий ишественник имеА 1) С"ч1(А) Суз -1 д Компани (ОЯ)энк, Ричард Юджин Хини,Проути и Марк Роберт Ресегзоп, О.О. и Ясе 1 пег, , 1971, 246, р. 6786-6791. УЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКО(57) Использование: для получения человеческого инсулина из человеческого проинсулина. Цель: повышение чистоты целевого продукта. Сущность изобретения; предшественник человеческого инсулина обрабатываюттрипсином и карбоксипептидазой В в водной среде, содержащей на моль предшественника человеческого инсулина 0,1- 10 моль одного или более ионов металла из числа тех, которые имеют порядковые номера 21 - 34, 39-52, 57 - 84 и 89-92. Положительный эффект: образуется минимальное количество побочного продукта. 9 з.п,ф-лы, 6 табл ки или ферментативно ептидная часть, имею- мере два аминокислот - ОН, Аг 9 - У или 1 уз-У, окислотный остаток илиимеющая по крайней ислотных остатка; часть представляет собой А- го инсулина; часть от В - ставляет собой В-цепь нсулина; Х обозначает единена с А-цепью челона у аминогруппы А - 1 с еского инсулина у карппы В - 30, причем эта ь ферментативно отщепва,отобеихА-цепии В-цебатывают предшественник улинатрипсином и карбокв водной среде, содерток или химичес расщепляемая и щая по крайней ных остатка; Я 1 где У - ОН, амин пептидная часть мере два аминок от А - 1 до А - 21 цепь человеческо 1 до Впред человеческого и часть, которая со веческого инсули В-цепью человеч боксильной гру часть может быт лена, и без разры пи, в котором обра человеческого инс сипептидазой Вжащем на 1 моль предшественника человеческого инсулина приблизительно 0,1 - 10 моль одного или более иона металла из числа тех металлов, которые имеют порядковые номера 21 - 34, 39 - 52, 57 - 84 и 89 - 92.Способ применяется к предшественникам человеческого инсулина вышеупомянутой формулы, наиболее предпочтительным из которых является сам человеческий инсулин.Термин "предшественник человеческого инсулина" относится к молекуле, которая, во-первых, содержит А-цепь человеческого инсулина и В-цепь человеческого инсулина; во-вторых имеет по крайней мере три дисульфидн. е связи, представленные соединением серы каждой из частей Суз, расположенных в А- и В-цепях у (а) А - 6 и А - 11, (б) А - 7 и В - 7 и (в) А - 20 и Всоответственно, и, в-третьих, имеет отщепляемую соединительную часть, которая присоединена к А-цепи человеческого инсулина у аминогруппы А - 1 и к В-цепи человеческого инсулина у карбоксильной группы В-ЗО.Группа й представляет собой водород, аминокислотный остаток или пептидную часть, имеющую по крайней мере два аминокислотных остатка. В тех случаях, когда В представляет собой аминокислотный остаток или пептидную часть, й обозначает группу, отщепляемую от продукта предшественника инсулина без потери целостности остаточной структуры инсулина, Из большого разнообразия аминокислотных остатков или пептидных частей любые квалифицируются в пределах определения группы Я, Примерами расщепляемых аминокислотных остатков являются основные аминокислоты, такие, как аргинин (Агд) или лизин ( уз), а также пептидные части, заканчивающиеся у карбоксильной группы такими аминокислотными остатками. Они признаны как чувствительные к расщеплению при обработке протеолитическим ферментом трипсином, Другим примером расщепляемого аминокислотного остатка является метионин (Мет), а также пептидная часть, имеющая Мес у его карбоксильного окончания. Они могут отщепляться посредством обработки вианогенбромидом. Другим примером является триптофан (Тгр) или пептидная часть, содержащая Тгр у его карбоксильного окончания, Он отщепляется при обработке М-бромсукцинимидом.Группа Я 1 представляет собой гидроксил, аргинин, лизин или пептид, имеющий аргинин или лизин в его аминоконце. Когда К представляет собой аргинин, лизин или пептид, имеющий любой из этих остатков в 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 его аминоконце, аминокислота или пептид будут отщепляться в условиях предлагаемого способа с образованием продукта, в котором В 1 представляет собой гидроксил.Соединительной частью Х предшественника инсулина может быть любая из широкого круга структур. Предпочтительно частью Х является полипептид. Полипептид, как правило, содержит по крайней мере 2, предпочтительно 2 - 35, наиболее предпочтительно 6 ваминокислотных остатков, Часть Х присоединена к А-цепи у аминогруппы положения А - 1 и к В-цепи у карбоксильной группы положения В - 30. Наиболее предпочтительно, если соединительной частью Х, когда это пептид, является природный соединительный пептид человеческого проинсулина, имеющий формулу- Агд - Агд - 61 ц - Аа - А 1 ц - Азр - 1 еи - 61 г - Ч а 1-61 е - 61 п - Ча 1-61 цецуу - 61 у - Рго у - Аа - 6 у - Бег -ео - 61 п - Рго -еи-А 1 а - 1 ец - 6 ц - 61 у - Яег -еп - 6 и -уз - Агд - ,Хотя предпочтительно использовать природную соединительную последовательность, приведенную выше, для соединительного пептида могут быть использованы более короткие пептидные последовательности, Единственным требованием является то, чтобы они имели достаточную длину для возможности образования правильной дисульфидной связи между А- и В-цепями и чтобы они были отщепляемыми от предшественника инсулина с сопровождающимся образованием инсулина, Типичным дипептидом, который может быть использован, является - Агд - Агд - , Кроме того, могут быть использованы модификации вышеупомянутого дипептида, имеющие формулы - Агд - Х- Агд - , где Х представляет собой по крайней мере один аминокислотный остаток, Весьма и редпочтител ьными соедин ител ьными пептидами являются -Агд - Агд -узАгд-, а также пептиды с более длинной цепью, имеющие структуру - Агд-Агд-Х -г уз-Нгд - , где Х представляет собой по2крайней мере один аминокислотный остаток, и предпочтительно, по крайней мере два аминокислотных остатка. Эти последние включают природный соединительный пептид.Способ осуществляют в водной среде. Термин "водная среда" подразумевает присутствие воды; однако он не исключает присутствия органических растворителей, смешивающихся с водой, таких, как метанол, этанол, ацетон, К, М-диметилформамид . и т,п. Предшественник человеческого инсулина присутствует в водной среде при концентрации приблизительно до 2 мМ.Предпочтительно, если концентрация предшественника человеческого инсулина значительно ниже, приблизительно в пределах 0,1 - 10 мМ; более предпочтительная концентрация приблизительно 0,5-5 мМ; наиболее предпочтительна концентрация приблизительно 1 - 3 мМ.Превращение осуществляют при любой температуре из широкого диапазона температур, как правило приблизительно при 0 - 40"С. Предпочтительно реакцию осуществляют при температуре приблизительно 4 - 25 С, наиболее предпочтительно при температуре приблизительно 10-15 С.. рН реакционной смеси может варьироваться в диапазоне приблизительно 4 - 12. Лучшие результаты достигаются при тщательном контроле рН, так чтобы реакция осуществлялась при рН в диапазоне приблизительно 6 - 9, предпочтительно 7 - 8, при точном регулировании приблизительно 7,2 - 7,6.Регулирование рН, как правило, проводят с использованием буферного вещества. Может быть применен в любой из широкого круга типичных буферов, Примерами пригодных буферов являются ТР (трис(гидроксиметил)аминометан), этилендиамин, триэтаноламин, глицин, НЕРЕЯ (М-гидроксиэтилпиперазин-М -2-этанульфоновая кислота) и т.п.Количество трипсина и карбоксипептидазы В, обычно используемое в способе, зависит от двух ферментов и от количества предшественника человеческого инсулина. Ферменты могут быть введены в реакционную смесь в растворе и, с использованием признанных методик, могут быть иммобилизированы на пригодной подложке.Карбоксипептидаза В, как правило, присутствует в количестве относительно предшественника человеческого инсулина приблизительно от 1:10 до 1:5000, предпочтительно от 1:500 до 1:3500 и наиболее предпочтительно от 1:1000 до 1:3000.Трипсин, как правило, присутствует в количестве относительно предшественника человеческого инсулина приблизительно от 1:20 до 1:250000, предпочтительно приблизительно от 1:20 до 1:250000, предпочтительно приблизительно от 1:300 до 1:20000 и наиболее предпочтительно приблизительно от 1:5000 до 1:15000. Отношение карбоксипептидазы В к трипсину в реакционной смеси также представляет собой важный параметр. Как правило, отношение карбоксипептидазы В к трипсину составляет приблизительно от 1:1 до 10:1 и предпочтительно от 2;1 до 5:1.5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Установлено, что присутствие определенного количества одного иона металла или более из широкого круга ионов металла значительно уменьшает количество ОезТЬг(ВЗО) - Ь 1, образующееся во время реакции.Хотя чрезвычайно предпочтительны ионы определенных металлов, обнаружено, что пригоден широкий круг таких ионов. Металлы ионы которых могут быть использованы, следующие: скандий, Яс, титан Т, ванадий Ч, хром Сг, марганец Мп, железо Ре, кобальт Со, никель М, медь Си, цинк 2 п, галлий Оа, германий бе, мышьяк Аз, селен Яе, иттрий У, цирконий Лг, ниобий МЬ, молибден Мо, технеций Тс, рутений Во, родий КЬ, палладий Рб, серебро А 9, кадмий Сб, индий и, олово Яп, сурьма ЯЬ, теллур Те, лантана, церий Се, празеодим Рг, неодим Мб, прометий Рщ, самарий Ягп, европий Ец, гадолиний Ос, тербий ТЬ, диспрозий Оу, гольмий Но, эрбий Ег, тулий Тщ, иттербий УЬ, лютецийц, гафний Н 1, тантал Та, вольфрам Я, рений йе, осмий Оз, иридий г, платина Рт, золото Ао, ртуть Нд, таллий Т, свинец РЬ, висмут В, полоний Ро,актиний Ас, торий ТЬ, протактиний Ра и уран О,Хотя ионы любого из вышеперечисленных металлов могут быть использованы в и редлагаемом способе, ч резвы чайно и редпочтительными подклассами сужающегося объема и потому повышенного предпочтительно являются следующие:(5) никель.В соответствии с настоящим способом ионы одного или более вышеперечисленных металлов добавляют в реакционную смесь предшественника человеческого инсулина, Количество ионов из числа упомянутых металлов в совокупности, присутствующей в реакционной смеси, составляет приблизительно 0,1 - 10 моль на моль предшественника человеческого инсулина, Используемое фактическое количество предпочтительно находится у нижней границы вышеприведенного интервала ц, как правило, составляет приблизительно 0,1-2 моль на моль предшественника человеческого инсулина, Наиболее предпочтительное количество составляет приблизительно 0,3 - 1 моль на моль предшественника человеческого инсу 1829939лина и идеально - приблизительно 0,33 - 0,6 моль на моль предшественника человеческого инсулина.Реакцию конверсии обычно осуществляют в течение 2 - 48 ч, как правило 8 - 16 ч. Реакцию можно контролировать посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии; время реакции тщательно координируют с получением человеческо о инсулина,Неожиданным является то, что количество произведенного Оеэ - Тйг(ВЗО) - й 1 может быть уменьшено посредством введения в реакционную смесь одного или более ионов металла из другого класса металлов, Эдополнительное усовершенствование очевидно, в частности, когда количество первого иона металла составляет интервал приблизительно 0,1 - 0,6 моль на моль предшественника человеческого инсулина, В высшей степени благоприятно добавлять ионы металла, выбранного из группы, состоящей из бериллия Ве, магния М 9, кальция Са, стронция Яг, бария Ва, радия Ка, предпочтительно ионы кальция, бария, стронция или магния и наиболее предпочтительно ионы кальция.Количество второго иона металла варьируется приблизительно от 0,5 - до 5 моль на моль предшественника человеческого инсулина, предпочтительно от 1 до 2 моль на моль предшественника человеческого инсулина.Способ осуществляют путем растворения предшественника человеческого инсулина в водной среде. Конечная смесь как правило, имеет концентрацию приблизительно 1 - 3 мМ и рН около 8, Затем добавляют ион металла второго класса (если таковой используется), Обычно СаС 12 добавляют до концентрации около 5 мМ, когда используется вышеприведенная концентрация предшественника человеческого инсулина, Ион металла первого класса, обычно М (1), затем прибавляют до концентрации около 0,5 моль на моль предшественника человеческого инсулина, рН смеси доводят до 73 - 7,5 и добавляют карбоксипептидазу В (около 1:2500 от массы предшественника человеческого инсулина) с последующим добавлением трипсина (около 1:12500 от массы предшественника человеческого инсулина). Реакцию продолжают, поддерживая температуру смеси около 12 С. Продвижение реакции тщательно контролируют посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии,Способ иллюстрируется следующимипримерами,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 П р и м е р 1. Человеческий проинсулин (и Р 1) растворяют в 20 мМ буферного раствора этилендиамина (ЭДА), рН 7,0, при концентрации 10,85 г/л, Смесь разделяют на две порции, К первой порции прибавляют свиную панкреатическую карбоксипептидазу В (СрВ) до конечной концентрации 3,74 мг/л. Этот раствор разделяют на шесть одномиллилитровых аликвот, после чего прибавляют бычий панкреатический трипсин, ранее обработанный тазилфенилаланилх. лорметилкетоном (трипсин-ТФХК), при кон. центрацях 1,0; 1,4; 1,8; 2,8; 3,6 и 5,4 мг/л соответственно. Каждый образец инкубируют в течение 8 ч при 23 С. Уровни ОезРпг(ВЗО) - й 1 (см.табл,1) определяю- высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).Вторую порцию раствора йР 1 разделяют на пять одномиллилитровых аликвот. СрВ прибавляют до концентрации 1,1; 1,5;2,2; 3,7 и 5,4 мг/л соответственно. Затем к каждой аликвоте прибавляют трипсин- ТФХК до концентрации 2,71 мг/л. Каждый образец инкубируют в течение 8 ч при 23 С. Результаты приведены в табл.2.В табл.1, 2 количество ОеЯ - Рпг(ВЗО)- п 1 выражено как процентное содержание й 1, определенное высокоэффективной жидкостной хроматографией. Как показываю данные, при заданных уровнях СрВ содер жание ОеЯ - Тйг(ВЗО)-п 1 снижается путем уменьшения уровней трипсина. Наоборот, при заданных уровнях трипсина повышение СрВ приводит к пониженным уровням Оеэ - ТЬг(ВЗО) - Ь 1,П р и м е р 2, йР 1 (60 мг) растворяют в 20 мМ этилендиамина (6,0 мл), рН 7,5 - 8,0 Свиную карбоксипептидазу В и бычий трип син-ТФХК прибавляют последовательно с получением соотношения субстрат (Р 1);фер мент, равного 5000:1:1 по массе дл йР 1;СрВ;трипсин-ТФХК, Двухмиллилитро вые емкости инкубируют при температуре 12, 24 и 37 С в течение периодов времени необходимых для достижения максималь. ного выхода й 1, как измерено высокоэффек. тивной жидкостной хроматографией, т.е. 14 6 и 4 ч соответственно, Как показано е табл,3, более низкие температуры способст. вуют меньшему образованию ОеэТ 1 г(ВЗО) - Ь 1,П р и м е р 3, йР 1(360 мг) растворяют в 20 мл 20 мМ глицина, рН 7,65. Раствор разделяют на 10,0 мл аликвоты, и к одной аликвоте добавляют ион кальция при 5 мМ. Каждую аликвоту далее разделяют на три порции, Порцию из аликвоты, содержащей ион кальция, и порцию из аликвоты без содержания иона кальция обрабатывают сле 1829939 105 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 дующим образом. Для одной группы прибавляют ион цинка с получением относительно ЬР 1 малярного отношения, равного 0,33, Для другой группы прибавляют ион никеля с получением относительно 1 Р 1 молярного отношения, равного 0,36. Ферменты прибавляют ко всем смесям с получением массовых соотношений ЬР 1:СрВ:трипсин-ТФХК,500:5:1. рН каждой смеси доводят до 7,65 - 7,7, и смеси инкубируют при 12 С в течение 16 ч, Результаты, приведенные в табл.4, демонстрируют влияние никеля и цинка в снижении уровня образования Оез - Т 1 г(ВЗО) - 11. Они также показывают усиление этого влияния кальцием,Количественный анализ составляет менее обнэруживаемого предела, который равен 0,20 о 11П р и м е р 4, ЬР 1 (245 мг) растворяют в 12,0 мл 50 мМ глицина, рН 7,4. Ион кальция прибавляют из 1 М основного раствора СаС 2 с получением конечной концентрации 5 мМ. Никельиз 0,11 М основного раствора %С 2 прибавляют к 2 мл аликвотам с получением одного образца с молярным отношением 0,24; 0,37; 0,44; 0,51 и 0,58. СрВ прибавляют к каждой пробирке с получением концентрации 7,4 мкг/мл (4,87 мг/мл основного раствора), после чего прибавляют трипсин-ТФХК с получением конечной концентрации 2,96 мкг/мл (1,6 мг/мл основного раствора). рН всех образцов доводят до 7,40, и каждый образец инкубируют при 12 С. Реакции прекращают через 12 ч и измеряют уровни содержания Оез - Т 1 г(ВЗО) - 11 и Ь 1. Результаты, приведенные в табл.5, показывают, что повышенные уровни никеля приводят к пониженному производству ОеЯ - Т 1 г(ВЗО) - 11.П р и м е р 5. 1 Р 1 (936 мг) растворяют в 36 мл 5 мМ глицина и рН смеси доводят до 7,8 - 8,0. Ион кальция прибавляют как СаС 2 (1 М основной раствор) до концентрации 5 мМ, Извлекают аликвоты, каждая объемом 3 мл, и ионы различных металлов прибавляют при концентрации, приведенной в табл.б. После уравновешивания при 12 С прибавляют ферменты с получением массовых соотношений 1 Р 1:СрВ:трипсин - ТФХК - 13,500:5:1.Образцы инкубируют при 12 С в течение 13 ч и осуществляют измерение на содержание Ь 1 и Оез - ТЬг(ВЗО) - Ь 1. Результаты, приведенные в табл,б, показывают, как любой из широкого круга ионов металла эффективен в снижении производства Оез - ТЬ г(В 3 О) - р 1,П р и м е р б. Ь Р 1 (448,5 г), растворенный в 15 мМ буферном растворе глицина, рН 7,4(33,0 л), охлаждают и сохраняют при 12 С. Кальцийприбавляют до концентрации 5 мМ в виде 1,0 М основного раствора СаС 2 (0,165 л). После перемешивания в течение 10 мин прибавляют никельс получением молярного отношения М : ЬР 1, равного 0,44;1, путем прибавления твердого ВС 2 6 Н 20 (5,0 г). Раствор осторожно перемешивают в течение 10 мин, и СрВ (36,8 мл, 179,4 мг) прибавляют из 4,87 мг/мл основного раствора. Затем прибавляют трипсин-ТФХК (35,9 мл, 35,9 мг) из 1,0 мг/мл основного раствора. Реакция достигает завершения через 10 ч, как измеряется максимальным производством 11. При сборе смесь содержит около 0,29 ОезТпг(ВЗО) - 11, что приближается к пределу обнаружения данного соединения,Формула изобретения 1. Способ получения человеческого инсулина путем конверсии предшественника человеческого инсулина общей формулы(В) (В) (В-зо) где В - водород, химически или ферментативно расщепляемый аминокислотный остаток, или химически или ферментативно расщепляемая пептидная часть, имеющая по крайней мере два аминокислотных остатка;Й 1 ОН, Аг 9 - У, илиуз - У, где У - ОН, аминокислотный остаток или пептидная часть, имеющая по крайней мере два аминокислотных остатка;часть от А - 1 до А - 21 - А-цепь человеческого инсулина, часть от В - 1 до Ви Х - часть, которая связана с А-цепью инсулина у аминогруппы А - 1 и с В-цепью инсулина у карбоксильной группы В - 30, причем, эта часть может ферментативно расщепляться без разрыва А-цепи и В-цепи,с использованием трипсина и карбоксипептидазы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, обрабатывают предшественник человеческого инсулина, находящийся в водной среде в концентрации до 20 мМ, трипсином в количестве, составляющем в пересчете на вес предшественника человеческого инсулина от 1:2.000 до 1:15,000, и карбоксипептидазой В в количестве, составляющем в пересчете на вес предшественника челове1829939 12 Таблица 1 Влияние повышения уровней трипсина на трансформацию пР 1 Таблица 2 Влияние повышения уровня СрВ на трансформацию пР 1 ческого инсулина от 1.2.000 до 1:10,000, и ричем водная среда содержит на 1 моль предшественника человеческого инсулина на 0,1-10 моль ионов одного или нескольких металлов из группы, включающей Ю, 2 п, Со иСб,2. Способ по 1, отл ича ющийся тем, что предшественник человеческого инсулина присутствует в водной среде в концентрации 1 - 3 мМ,3. Способ по п.1 или п.2, о т л и ч а ющ и й с я тем, что ион металла присутствует в количестве 0,33 - 0,6 моль на 1 моль предшественника человеческого инсулина.4. Спогэб по пп. 1-3, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что массовое соотношение карбоксипептидазы В и трипсина составляет от 1:1 до 5:1.5, Способ по пп, 1 - 4, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что ионом металла является ион металла, выбираемый из группы, включающей никель и цинк,6. Способ по п.5, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что ионом металла является ион никеля.5 7. Способ по пп. 1 - 6, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что ионом второго металла являетсяион, выбираемый из группы, включающейкальций, барий, стронций и магний, добавляемый к смеси.10 8, Способ по п,7, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что ионам металла является ион кальция,9, Способ по пп.7 и 8,отл ичэ ю щийс я тем, что ион металла присутствует в15 количестве около 5 моль на 1 моль предшественника человеческого инсулина.10. Способ по пп. 1 - 9, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что предшественником человеческого инсулина является человеческий про 20 инсулин.14 1829939Таблица 3 Температурный эффектТаблица 4 Влияние металлов на трансформацию ЬР 1аблица 5 Влияние изменяющейся концентрации М(И)ТаблицаВлияние различных двухвалентных катион1829939 16 15 Продолжение табл. 6 10 15 20 25 30 35 Составитель В, БрусиловскаяТехред М. Моргентал Корректор Г, Кос Редактор Г, Бельская Заказ 2483 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101