Способ получения карбоксиметилированных -1, 3-глюканов

;Ф;,Еь:РфЪЮ . ПАТЕНТУ,представляет ьные - водород, лимеризации где и - 0 или лей, отличто 1 -1,3-глфС где хотя бы один иэ Ксобой СНСООН, а остал со средней степенью по (и + 2) от 2 до 1000, целое число, или их со ч а ю щ и й с я тем, кан форм М 22 Юкио Сугино Индастриз Лтд,Я Н яя степе п имею т взаимодной кислометалласледующимта в свобо ГОСУДАРСТЕЗЕКЙЬЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБ ЕТЕКИЙ И ОТКРЫТИЙ(54) ,57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКС МЕТИЛИРОВАННЫХ-1,3-ГЮКАНОВ фор .мулы 1 где сред (и + 2) значения подверга хлоруксу щелочног лочи с п го ироду виде сол/00 А 61 К 1/1 палимеризации вышеуказанные йствию с моноой или ее сольюприсутствии щевыделением целево дном виде или вИзобретение относится к способу получения новых карбоксиметилированных 15-1,3-глюканов, обладающих противоопухолевой активностью.Цель изобретения - получение новых соединений, расширяющих арсенал средств воздействия на живой органим.Поставленная цель достигается тем, что согласно основанному на известной реакции карбоксиметилирования углеводов ). 1) способу получения карбоксиметилированных 1 "1,3,-глюканов общей формулы го э К представляет стальные - атомыодин ООН, а собой СН С водорода,и25 со средне (и + 2) о степенью полимеризац 2 до 1000, где и - 0 число, или их со ан Формулы еи мли целое -1,3 глю теПень волимеризацииимеют вышеуказанные 3 где средняя с(и + 2) и и5значения,подвергают взаимодействию с монохлоруксусной кислоой и ее солью щелочного металлас последующи 40продукта в с иде соли,Используемый согласно настоящемуизобретению в исходный -1,3-глюкан(ТАК-Й) содержит-1,3-связи в своих 45основных гликозидных звеньях и является водонерастворимым, обладает средней степенью полимериэации (бР) иможет желатинировать при 0 Р 170 приО60 в присутствии воды; его получаютпутем выращивания микроорганизмов,таких как АцгоЬасег 1 цв гад 1 оЬасег(1 Г 013127 АТСС 6466), АдгоЬассег 1 цщгас 11 оЬасег (1 ГО 13126, АТСС 21679,ГеКМ Р), АцгоЬасйег 1 цщ Гаеса 11 ьайаг, щуходепев МТЕ-Ч(1 Г 0-13140, АТСС21680, ГЕКМ Р),В соответствии с настоящим изобретением используются также и низшие в присутствии щелочи м выделением целевого вободном виде или в в полимеры (ТАК-О), получаемые причастичном гидролизе ( -глюкана(ТАК-й). ТАКполучают при частичном гидролизе ТАК-й (например,прикислотном гидролизе, щелочном и ферментативном гидролизе с Ъ -1,3-глюканазой),П р и м е р 1. В 80 мл изопропилового спирта суспендируют 3 гТАК-й (средняя степень полимеризации 540) и суспензию перемешиваютпри комнатной температуре в течение30 мин. Затем медленно добавляют 8 мл30/-ного раствора гидрата окиси натрия при перемешивании в течение примерно 69 мин. Затем смесь интенсивно перемешивают при комнатной температуре еще в течение примерно 90 миндля предотвращения образования геля,Добавляют 3,6 г монохлоруксуснойкислоты и смесь перемешивают при60-70 С в течение 5 ч, чтобы прошлокарбоксиметилирование, Продукт выделяют Фильтрованием и тщательно промывают смесью метанола и уксусной кислоты (7:3 по объему), Осадок собираютфильтрованием, хорошо промывают80-ным водным метанолом, метаноломи ацетоном в вышеуказанном порядкеи высушивают под пониженным давлением, Получают 2,9 г карбоксиметилированного-1,3-глюкана ( СМТАК ).Карбоксиметильное содержание (числокарбоксиметильных групп на глюкозныйостаток) 0,54.П р и м е р 2. В 40 мл изопропилового спирта суспендируют 1,5 гТАК-И (степень полимеризации 540)и суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин,Затем при перемешивании добавляют2 мл 304-ного раствора гидрата окисинатрия четырьмя порциями, т.е. по0,5 мл с интервалом в 15 мин, Затемсмесь перемешивают при комнатной температуре еще в течение 90 мин, послечего тремя порциями добавляют 0,9 гмонохлоруксусной кислоты, т.е, по0,3 г, с интервалами по 10 мин,Карбоксиметилирование проводят при50 С при перемешивании в течение150 мин. Продукт собирают центрифугированием,растворяют в 50 мл воды и нейтрализуют уксусной кислотой, К нейтральному раствору добавляют 120 млметанола и полученный осадок собираютцентрифугировзнием, Осадок промываютсмесью 300 мл 803-ного водного метанола и 100 мл зтанола, а затем смесью10240300 мл 80-ного водного метанола и200 мл эфира. Продукт лиофилизируют, .выделяется 1,7 г С 1 ТАК.Карбоксиме.тильное содержание 0,75,П р и м е р 3. В 40 мл изопропиловго спирта суспендируют 1,5 г ТАК-М(степень полимеризации 540) и суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем четырьмя порциями добавляют 4 мл 30 ного раствора гидрата окиси натрия,т.е. по 1 мл с интервалами по 15 минпосле чего перемешивают при комнатной температуре в течение 90 мин.После этого добавляют 1,8 г монохлор" 15уксусной кислоты тремя порциями, т.е.по 0,6 г каждая с интервалами по10 минут. Смесь перемешивают при50 С в течение 150 мин, Образовавошийся в результате карГюксиметилирования продукт собирают центрифугированием, растворяют в 40 млводы и нейтрализуют уксусной кислотой. К нейтральному растворудобавляют 90 мл метанола и полученный осадок собирают центрифугированием. Осадок хорошо промываютсмесью 200 мл 80-ного водного метанола и 100 мл этанола, а затемсмесью 200 мл 807.-ного водного эта- З 0нола и 200 мл эфира. Затем продуктлиофилизируют, получают 2,0 гСМТАК. Карбоксиметильное содержание 1,07.П р и м е р 4, В 33 мл воды сус 35пендируют 3,2 г ТАК-М (степень поли.меризации 255) и при перемешиваниипри комнатной температуре добавляют1 г гидрата окиси натрия с последующим добавлением 2,4 г монохлорацета 40та натрия. Карбоксиметилированиепроводят при комнатной температурепри постоянном перемешивании в течение 2 ч. После этого добавляют снова1 г гидрата окиси натрия и 2,4 г45монохлорацетата натрия и затем реакцию проводят при комнатной темпера"туре при перемешивании в течение3 ч.Затем добавляют еще 1 г гидрата окиси натрия и 2,4 монохлорацетата натрия. Реакцию продолжают прикомнатной температуре при перемешивании еще в течение 2 ч. К этой реак.ционной смеси добавляют 1 л этанолаи полученный осадок хорошо промываютэтанолом на стеклянном фильтре дотех пор, пока фильтрат не перестаетдавать красный цвет с фенолфталеином. 11 4Затем осадок высушивают при 50 С и пониженном давлении. Полученный порошок (3,7 г) растворяют в 90 мл воды и нейтрализуют уксусной кислотой с последующим добавлением 210 мл этанола. Полученный осадок собирают центрифугированием, промывают 80-ным этанолом и лиофилизируют. Получают,.2,6 г СМТАК. Карбоксиметильное содержание 0,30.П р и и е р 5 В 66 мл воды суспендируют 6,4 г ТАК-М (степень полимеризации 255)и в условиях охлаждения льдом при перемешивании добавляют 4 г гидрата окиси натрия, а затем 9,6 г монохлорацетата натрия. Карбоксиметилирование проводят при охлажде нии льдом, при перемешивании в течении 2 ч. Затеи снова добавляют 4 г гидрата окиси натрия и 9,6 г монохлорацетата натрия и смесь перемешивают при охлаждениильдом в течение З.ч. После этого добавляют еще 4 г гидрата окиси натрия и 9,6 г с монохлорацетата натрия и реакцию продолжают при охлаждении льдом и при перемешивании в течение 3. К реакционной смеси добавляют 1 л этанола и полученный осадок хорошо промывают этанолом на стеклянном фильтре до тех пор, пока фильтрат не перестает давать красную окраску с фенолфталеином, после чего продукт высушивают при 50 С и пониженномодавлении. Полученный порошок ( 8,6 г), растворяют в 172 мл воды и нейтрали" зуют уксусной кислотой. Затем после добавления 480 мл этанола осадок собирают центрифугированием, промывают 80"ным этанолом и лиофилизируют. Получают 5,6 г СМТАК. Карбоксиметильное содержание 0,36.П р и м е р 6. В 40 мл изопропилового спирта суспендируют 1,5 г ТАК-О - низший полимер, получаемый при частичном гидролизе ТАК-М, степень полимеризации 299. Карбоксиметилирование проводят аналогично примеру 2. Продукт промывают, как в примере 2, получают 1,9 г СМТАК. Карбокси" метильное содержание 0,59,Указанный ТАК-О суспендируют в 40 мл изопропилового спирта и аналогично примеру 3 осуществляют карбоксиметилирование. Реакционный продукт промывают, как в примере 3, получают 2,2 г СМТАК. Карбоксиметильное содержаниеП р и м е р 7, В 40 мл изопропилового спирта суспендируют 1,5 гТАК-О (степень полимеризации 113).Аналогично примеру 2 проводят карбоксиметилирование, Реакционный продукт собирают центрифугированием,растворяют в 40 мл воды и нейтрализуют уксусной кислотой. К нейтральному раствору добавляют 90 мл метанола и полученный осадок собираютцентрифугированием, а затем хорошопромывают сначала 200 мл 803-ногометанола, а потом 200 мл водногоэтанола, после чего лиофилизируют.Получают 1,4 г СМТАК. Карбоксильноесодержание 0,51.Аналогично описанному из 15 гТАК-О (степень полимеризации 68)получают 1,4 г СМТАК. Карбоксильноесодержание 0,36,П р и и е р 8. В 40 мл изопропилового спирта суспендируют 15 гТАК-О (степень полимеризации 113).АналогичнО примеру 3 проводят карбо" 25ксиметилирование. Реакционный продуктпромывают, как в примере 7, по- .лучают 2,3 г СИТА( (карбоксильное содержание 1,22).Аналогично Описанному из 1 5 г 30ТАК- Э (степень полимеризации 68) получают 1,4 г СМТАК, Карбоксильноесодержание 0,45.П р и и е р 91 В 40 мл изопропи"лового спирта суспендируют 1,5 г35ТАК-й(ОР 960), и суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем при перемешиваниичетырьмя равными горциями добавляют2 мл 30-ного раствора гидрата окисинатрия с интервалами по 15 мин, Смесьзатем перемешивают прикомнатной температуре в течение 90 мин. Затемдобавляют 0,9 г монохлоруксусной кис"лоты тремя равными порциями с интевалами по 10 мин. Карбоксиметилирование проводят таким образом при50 С при перемешивании в течение150 мин. Продукт собирают центрифугированием и промывают 20 мл50953-ного изопропилового спирта. Оста,ток повторно суспендируют в 20 мл953-ного изопропилового спирта инейтрализуют уксусной кислотой. Полученный осадок собирают центрифугированием, хорошо промывают 903-ным55водным метанолом, метанолом и ацетоном в указанном порядке и высушиваютпод пониженным давлением. Получают 1,6 г СМТАК, Карбоксиметильное содержание 0,40,П р и м е р 10. В 40 мл изопропилового спирта суспендируют 1,5 гТАК-О(ОР 15) и суспензию перемешива,ют при комнатной температуре в .течение 30 мин. Затем при перемешиваниидобавляют 2,4 мл 301-ного гидратаокиси натрия четырьмя равными порциями с интервалами по 15 мин. Смесьперемешивают при комнатной температуре 90 мин, добавляют 1,08 г монохлоруксусной кислоты тремя равными порциями с интервалами по 10 мин. Карбоксиметилирование проводят при 50 фСпри перемешивании в течение 150 мин.Продукт промывают, как в примере 7,получают 0,8 г СМТАК. Карбоксильноесодержание 0,19.П р и м е р 11. В 33 мл воды растворяют 3,42 г ТАК-О(степень полимеризации 2), при перемешивании прикомнатной температуре добавляют 1 ггидрата окиси натрия, а затем2,9 г монохлорацетата натрия.Реакцию карбоксиметилирования проводят,при комнатной температуре припостоянном перемешивании в течение2 ч, Затем снова добавляют 1 г гидрата окиси натрия и 2,9 г монохлорацетата натрия, затем реакцию проводят при тех же условиях в течение3 ч, После чего добавляют 1 г гидратаокиси натрия и 2,9 г монохлорацетатанатрия. Реакцию проводят при тех жеусловиях еще в течение 2 ч. К реакционной смеси добавляют 1 л этанолаи полученный осадок хорошо промываютэтанолом на стеклянном фильтре, высушивают при 50 С и пониженном давлении.полученный; порошок ( 3,7 г ) добавляют к 80 мл горячего ( 95 С ) этиленгликоля и смесь перемешивают. Полученный осадок удаляют фильтрованиемна етеклянном Фильтре как можнобыстрее. Фильтрат концентрируют подпониженным давлением и остаток сушатпри 60 С. Получают 2,5 г СМТАК, Карбоксильное содержание 0,30,Данные, характеризующие полученныеновые соединения, представлены втабл.). П р и м е р 12. В 30 мл раствора азотной кислоты (70".-ная азотная кислота: метанол - 1:10 по обьему)суспендируют 1,5 г СМТАК. Суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч и Фильтруют через стеклянный фильтр. Твердый остаток настеклянном фильтре промывают 60 мл903-ного метанола и после этого 30(ГМлметанола. Промытый твердый осадоксу 1 пендируют в 300 мл дистиллирован.ной воды. Затем прибавляют 370 мггидрата окиси кальция и смесь пере. мешивают в течение 4 ч, после чегофильтруют через фильтровальную бумагу. Фильтрат нейтрализуют 0,1 н.соляной кислотой. К нейтральному раствору прибавляют 450 мл этанола и полученный осадок собирают путем центрифугироввния. Осадок промывают120 мл 80-ного этанола и сушат припониженном давлении. Получают .13 гкальциевой соли СИТАК,Противоопухолевую активность трех .видов СИТАК, полученного из ТАК-М,и обработанного в автоклаве СИТАК 20исследовали на мышах.Образцы растворяли в дистиллированной воде для инъекции (рН л 7,0).Один из этих образцов стерилизовалив автоклаве ( 120 С, 25 мин ) передвведением. Шесть миллионов клеток180 трансплантировали подкожнов правую паховую зону мышам 1 СРС 1.,вес тела которых составлял 23 г.Узлы опухолей удалили на 35-й день ЗОпосле трансплантации и взвесили. Средний вес опухоли обработанной группы Т, включающей 5 мышей, сравни. вался с контрольной группой С, включающей 10 мышей, и рассчитывалась степень подавления опухоли (Ф подавления (С-Т)(Сх 100), На 35-й день были также подсчитаны результаты по нескольким животным с удаленной опу холью (полная регрессия). Результаты испытаний представлены в табл.2.Как показано в таблице 2, все образцы СМТАК при уровне дозы 10 мг/кг существенно подавляют рост опухоли. Это подавление роста СИТАК наблюдалось при уровнях дозы от 1 до 40 мг/кг.Эти результаты показывают, что СМТАК можно стерилизовать без потери его противоопухолевой активности и можно использовать в Форме, пригодной для инъекции, для лечения рака.Исследовали противоопухолевое,: действие ТАК-й, ТАК-О и СМТАК при различных способах введения.ТАК-й (степень полимеризации 540), ТАК-О (степень полимеризации 50), ТАК-О (степень полимериза" ции 1 б) и СМТАК по примеру 1 вводили по 5 мг/кг внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно в течение 10 дней ежедневно мышам 1 С РС 1. которым трансплантировали 4 ф 10 клеток за 24 ч до первой инъекции; Степень подавления роста опухоли рассчитывали так же, как описано выше,Результаты испытаний представлены в табл.3.Как видно из табл.3, в каждом случае наблюдалось существенное подавление роста опухоли. При внутривенном введении ТАК"М, СИТАК почти полностью подавляли рост опухоли, причем степень подавления составляал свыше 853 при полной регрессии опухоли у 4 или 5 мышей из 5 обработанных мышей.Таким оаразому ТАК-К,СМТАК и ,ТАК-О эффективны для подавления опухоли при любом способе введения.1 020111 1 й1 51 фф 00ло оД Ио иСЧ СЧ л ф фль о о Д Д о о сО 1,1 Ъ л л 4о ф л с л о о Д Д о о- ой Оо еЩ й л л о мъ л Оь л с СЧ Ч ОЪ Фь лЧ л л СЧ Сч К 1- х о ф О О а Ц О о х м ь( ьл 1 х Ом 9 й г, а о:ь1024011 12 Степень Средний Образец вес опухоли,г Контроль попримеру 2,87 0,7 СМТАК 1 7/7 1.0 0 0,28 4/7 90,2 6/7 99,7 0,01 Простерилизованный в авто=клаве О/6 0,77 78,9 1/6 5/6 СИТАК по примеру 1 0,03 99,2 4/6 93,7 0,23 Простерилизованный в автоО/6 2,17 клаве 100 6/6 96,8 5/6 0,07 СИТАК по примеру 1 5/6 0,08 96,3 3/6 0,21 0,18 1/6 91,7Доза,Образец , мг/кгспособ введеСтепень подавления опуоли,З 7,30 Контрол 5 х 10 ч 0,84%+Ы подкожнофф+1 р интраперитонально Составитель Л,НикулинаРедактор Л.Веселовская Техред А.Ач Корректор Г.Огар Заказ 4248/52 Тираж 494 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Рауаская наб., д. 4/5Подписное Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная,5 х 10 5 х 10 5 х 10 5 х 10 5 х 10 зс 5 х 10 1 р 5 х 10 Ь 5 х 10 зс Степень подавле" ния опухоли,Фа