Способ получения антибиотика к 582 м

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз СоветскихСоциалистиЧескихРеспублик К ПАТЕ НТУ(31) 52-157416 (33) Япония Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(72) Автор изобретения Иностранная фирма(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА К 582 М 1Изобретение относится к области микробиологии, к получению антибиотиков.Предложенный антибиотик новый и способ его попучения в патентной и 5 научно-технической литературе не описан.Целью изобретения является получение нового антибиотика К 582 М.эта цель достигается тем; что О штамм МегагЬь 1 ца ап 1 ьор 11 ае (Месьси) Бого 1.Маг,ап 1 ьор 11 ае 582 М выращивают в аэробных условиях в жидкой питательной среде при 20-37 Со .и рН 3,0-8,0 с последующим выделе нием целевого продукта.Штамм Месагйгця ап 1 ьор 1 ае (Месьсп) 5 огоМ Лаг,апьор 1 ае 582 М, продуцирувщий антибиотик, депонирован в коллекции (банк вирусов) ве домства Японии (Кодуо 913 цсьциВ 1 ье 1 Ьцсьп-Кодуо - е)ц 1 ьц 1 Кеп Куц)о) и зарегистрирован под номером ГЕН М-Р У 4217 и под номером АТСС Р 20500. 25Культурально-морФологические признаки. Колонии на солодовом агаре достигают диаметра 4;5-5,0 см за две недели при 25 оС, имеют Форму пучка или снопа. Колонии плоские или в 30 2некоторых случаях радиально вдавленные,. цвет колонии от темно-сероватозеленого до желтовато-зеленого ибелого по краям.Обратная сторона колонии от желтого до кремового цвета.Мицелий бесцветный, имеет перего"родки и ответвления; конидиофоры короткие, бесцветные и имеют перегородки, мицелий мелкоразветвленной формы, затем образует массу тесно скомпонованных гирлянд. Гирлянда имеетцилиндрическую Форму, бесцветная,концы тонкие с длинными цепями конидий,Конидий представляют собой одноклеточные плоские героспоры бледного желтовато-зеленого цвета, которыеимеют цилиндрическую или удлиненнуюэллипсоидную Форму и черыте закругленных угла. Длина и ширина конидиисоставляет 4,0-8,0 и 2,0-2,5 мкмсоответственно.Агар Чапека: рост хороший, Формаподушки, край ресничный, образуетспоры от желтовато-зеленого до темно-зеленого цвета, пигменг продуцирует.Агар Докса-Чапека: рост хороший,Форма пуговицы, споры от желтоватозеленого до темно-зеленого цвета,пигмент продуцирует. Агар Сабуро:рост хороший, форма подушки, образу.т споры от желтовато-зеленого дотемно-зеленого цвета. Пигмент отсутствует,О Агар на отваре из кукур зной муки: рост плохой, край в Аорме зубцов в нерегулярном наборе, образует споры темно-зеленого цвета, Пигмент отсутствует.Солодовый агар: рост довольно плохой. Мицелий представляет собой тонкую плоскую структуру, край волнообразный, опоры от серовато-зеленого до темно-зеленого цвета. Пигмент продуцирует. Картофельный агар с декстрозой: рост довольно плохой, мицелий тонкий и плоский, край ресничный, Образует .споры темно-зеленого цвета. Пигмент продуцирует.Желатиновый агар: рост довольно плохой, мицелий тонкий и плоский, край волнообразный, споры темно-зеленого цвета, Пигмента нет.Обычный агар: рост плохой. Мицелий имеет Аорму тяжелых снежных хлопьев, край волнообразный. Спор нет, пигмента не образует.В качестве среды для культивирования используют различные питательные вещества.В качестве источников углерода используют различные сахара, такие как декстроза, сахароза, левулеза (Аруктоза), манноза, глицерин, различные сорта крахмала, мальтозу, ксилозу, лактозу, мелассу, маннан.В качестве источников азота используют различные неорганические соли, такие как нитрат натрия, нитрат аммония, хлористый аммоний, а также органические азотистые вещества, такие как питательный бульон, пептон, жидкий кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, осевая мука, мука земляного ореха (арахиса.), аминокислоты. При необходимости используют подходящие неорганические соли и вспомогательные вещества.Культивирование предпочтительно осуществлять в жидкой среде.Культивирование проводят в аэробных условиях при 20-37, предпочтитель но 28-30 С при рН 3,0-8,0, предпочтительно рН 5,4-5,6.При необходимости в среду добавляют пеногаситель.После завершения ферментации выделяют продукт Ферментации путем осаждения гидрофильным органическим растворителем, таким как этанол, ацетон, органической кислотой, например пикриновой, Флавиановой, фосйовольфрамовой кислотой, пентахлорфенолятом натрия, бензальдегидом, экстракцией метанолом или активными адсорбентами различного типа. А также используют способ очИстки, основанный на применении ионообменных носителей, хроматографии на молекулярных ситах, способа плотности ориентации, метода противоточного распределения, способа Аракционирования солями, растворителями или ионами металлов, метода электрофореэа в различных его вариантах, способа выделения путем образования комплексного вещества.Целевой продукт может быть выде- О лен из культуральной среды с помощью осаждения с очисткой ионообменными смолами. Способ включает стадии фильтрования культуральной среды с применением фильтрующих средств,обработки фильтрата катионообменной смолой в кислой среде или основным ионообменником и последующего элюирования целевого продукта кислотой или щелочью.Полученный таким образом концентрат дополнительно концентрируют ионообменной смолой, после чего к нему прибавляют соответствующие количества этанола и ацетона.В результате получают сырую порошкообразную смесь К 582 М-А и К 582 М-В.Полученный сырой порошок обрабатывают затем метанолом, окисью алюминия, активированным углем и прово- ЗО дят хроматографирование с помощью молекулярных сит, в результате чего получают очищенный продукт.Полученный очищенный продукт может быть в дальнейшем подвергнут 35 обработке различными хроматограАическими методами с использованием таких сорбентов и носителей, как полиакриламидный гель, карбоксиметил (СМ)-сефадекс, с целью выделения ийдивидуальных продуктов К 582 М-А и К 582 М-В.В табл.1 приведены физико-химические свойства полученных продуктов К 582 М-А и К 582 М-В, 45 Таблица 1 К 582 М-В солянокислая соль) 39,35 ,2 018,62 б4,064,83В табл.2 приведен молекулярный ес указанных продуктов, измеренн реми оиисанными ниже методами о786915 Таблица 3 2 б л 0 О,Сапдда аЬ 1 сап Сапдсна1 гор 1 са Гель-фильтция апд 1 д 5 ЕЦОЬ 120 0,2 1 с 81Криоскопичкий пдда ц 11 О,220 ап 0 дац 111 егоопд зопиестичеий 0,2 О,0,2 О,00 01 да Кгц ЗассЬагоеусегеч 15 аеВг.= 60 ниеа(. 3 =+О, б"енйем) ЗОунтов ВассЬаговусе 5гоцх 1 Ьоййцсц 0 О,С Удо 5 аспв гоеусе 5 д 15 ц 5 4 0,4 0,2 111 а апова 1 а гц 1 а 5 ро 1 Ьгцсс 0,2 Яподогогц 1 е,4 ОК=19 0 ГО;ЕЦ 55 йарЬУоацгец 5 2 атри 10 елы Вас 111 ц 5 5 цЬг.115 Езспег 1 с раль ныхых сре 00 и не щело кислых льны в Стабильнедах, нес 10 а со 1 )100 ивностьопределенриведена в Актибиотическая и 582 М-.А и К 582 М- тодом разбавления,ЗагспаНаса еа б 00)10 нако поскольку эти методы дают значительную погрешность в указанном ниже диапазоне молекулярных весов, характеристики веществ не ограничиваются измеренными таким образом значениями молекулярного весаУдельное оптическое вращесД 2 Л=+0,2 , (С=1%, НО ) и(,(С=13, НдО); т.пл. (с разлож 192-198 и 197-203 С для прод К 582 М-А и К 582 М"В.К 582 М-А солянокислая соль хо рошо растворима в воде, метаноле. Умеренно растворима в этаноле, нерастворима в диэтиловом эфире, петр лейном эфире, бутаноле, хлороформе .и бензоле. Такая же растворимость и К 582 М-В. Сульфаты К 582 М-А иК 582 М-В хорошо растворимы в воде, умеренно в метаноле, нерастворимы во всех прочих растворителях.Цветные реакции К 582 М-А и К 582 М В. Нингидрая (+),КсантопРеакцияРеакцияРеакцияРеакцияРеакцияРеакция К 582 М-А и К .582аморфные порошки. БЬдеа 5 оппе10) 100 Тгс 8 овопаьНадпа 15 000 ) 100 а б а в тив род ток К 5 40 100 0 120-144 24,1-34,8( Как видно из данных, приведенных абл.3, К 582 М-А и К 582 М-В прояют высокую антибиотическую акность против микроорганизмов а Оапсда и других дрожжей.Данные, характеризующие острую сичность продуктов К 582 М-А и 82 М-В, приведены в табл.4.Таблица 4 3 0 5 О 5 Активность К 582 М-А и К 582 М-В в ингибировании роста раковых опухолей. Противоопухолевое действие укаэанных веществ испытывалось на крысах, являющихся носителями раковых клеток.Нескольким группам крыс, каждая из которых состояла из десяти крыс линии Донриу (самки весом 150- 200 г трансплантировали по 10 асцитных клетокрака печени АН 44 и АН 66, соответственно, причем пересадку кле ток производили в хвостовую вену животных. По прошествии 72 ч подопытным крысам вводили перорально препараты К 582 М-А или К 582 М-В в дозе 30 мг/кг непрерывно в течение 10 дней, после чего крысы находились под наблюдением в течение 60 дней. Затем определяли процент выживаемости крыс, участвовавших в эксперименте. Как видно из данных, приведен- . ных в табл.5, при использовании укаэанных препаратов в каждой группе крыс, которым предварительно пересаживали раковые клетки, отчетливо проявлялся эФфект ингибирования подавления) опухолевых клеток, особенно наглядный при сравнении с выживаемостью в контроле, где крысы после пересадки опухоли получали только кормовую диету. В результате различных эксперймен.тов обнаружено,что продукты К 582 М-А и К 582 МВ способны оказывать влияние на иммунитет живых организмов (как гуморальный, так и клеточный). Вещества обладают как ускоряющим, так и тормозящим (ингибирующим) действием на иммунную систему, что .было показано гемолизиновым титровальным методом при введении 30 эритроцитов овцы.Нескольким группам мышей, каждая из которых состояла.из 5-10 самок линии дс 1,вводили внутрибрюшинно препаюат К 582 И-, В в дозе 25 мг/кг и в дозе 2,5 мг/кг в течение 4 дней, затем в хвостовые вены мышей трансплантировали каждой 410 эритроцитов овцы и введение К 582 М-В продолжали еще в течение 4 дней, После завершения, этой процедуры производи 786915 10ли измерение уровня антител в крови. Группа мышей, которым вводили по 25 мг/кг препарата К 582 М-В, показала содержание антител в крови на уровне 77 в расчете на аналогичную величину у контрольной группы, тогда как группа мышей, которым вводили 2,5 йг/кг, показала средний уровень антител в крови порядка 234, считая на содержание антител в крови животных контрольной группы. Группы мышей, которые получали более высокие концентрации прй введении указанного препарата, продемонстрировали тенденцию к ингибированию иммунитета, тогда как. группы, получавшие более низкие концентрации препарата 15 К 582 М-В, продемонстрировали тенденцию к акселерации иммунитета.Было обнаружено, что при введении препаратов К 582 М-А и К 582 М-В в живой организм наблюдается повышение Я уровня индуцирования интерферона в крови.П р и м е р 1а) 200 мл культура-, льной среды (рН около 6), имеющей состав,: 3,0 глюкозы,1,0 полипептона, 0,2 нитрата. натрия,0,1 дигидрофосфата калия, 0,05 хлористого калия, 0,05 сульфата магния, 0,01 сульФата двухвалентного железа, инокулируют куль,турой Мейагй 1 я 1 цв ап 1 ьор 11 ае (Мейьсй),э Ього 1 с.Чаг.ап 1 ьор 11 ае 582 М (штамм В 11 со 1 сеп ГЕКМ-Р 4217, АТСС 9 20500) и проводят культивацию в условиях встряхивания при температуре 30 фС в течение 14-20 дней.б) Процедуру примера 1 а) повторяют, но вместо 1,0 полипептона в культуральную.среду добавляют 0,1 смеси аминокислот (глицина, аспарагина, аргинина, гистидина, аланина и некоторых других, которые добавля ют отдельно).П р и м е р 2. 5 л фильтрата культурального бульйона,полученного в примере 1, Фильтруют с добавлением гифло-суперцеля (средства, представ ляющего собой очищенную диатомитовую землю).После доведения величины рН до 6,0-7,0 полученный Фильтрат пропускают через колонку, имеющую внутрен- Я ний диаметр 20 и высоту 500 мм и заполненную ионообменной смолой ,1 РСв смешанной водородно-натровой форме (Н, йа ) с целью поглощения целевых веществ из культурально- у го бульона, Колонку промывают водой и затем пропускают через нее 500 мл 1,0 н. раствора соляной кислоты со скоростью 10 мл/мин для элюирования целевых веществ. Величину рН элюата доводят до 6,0 и нейтрализованный та- ф ким образом элюат концентрируют н вакууме. Полученный концентрат оставо ляют на ночь при температуре 35 С с добавлением пентахлорфенолята натрия с тем, чтобы вызвать осаждение 65 пентахлорфенолята смеси К 582 М-А и К 582 М-В, Полученный осадок пентахлорфенолята смеси К 582 М-А и К 582 М-В промывают всдой, затем растворяют в бутилацетате и полученный раствор дважды экстрагируют в делительной воронке разбавленным раствором соляной кислоты, имеющим рН 2,0-3,0 с целью получения водного раствора смеси солянокислых солей гидрохлоридов) К 582 М-А и К 582 М-В, Этот водный раствор промывают несколько раз бутилацетатом, водный слой доводят до рН 4,0 и затем концентрируют при пониженном давлении. К остатку прибавляют количество этанола, достаточное для осаждения смеси солянокислых солей К 582 М-А и К 582 М-В. Таким образом получают 5,0 г сырого порошка, представляющего собой смесь солянокислых солей К 582 М-А и К 582 М-В.Полученный порошок сиона растворяют в метаноле и, прибавляя к метанольному раствору достаточное количество ацетона и этанола, производят осаждение смеси солянокислых солей К 582 М-А и К 582 М-В, которую отделяют Фильтронанием. Полученную таким образом смесь К 582 М-А и К 582 М-В (в виде солянокислых солей) растворяют в метаноле и очищают пропусканием через колонку с сесьадексом 1.Н, в результате чего ;получают 4,0 г смеси К 582 М-А и К 582 М-В (в виде солянокислых солей), представляющей собой белое порошкообразное вещество.П р и м е р 3. 1 г смеси солянокислых солей К 582 М-А и К 582 М-В полученной в соответствии с процедурой, описанной в примере 2, растворяют в 5 мл воды и водный растнор обрабатывают хроматографически, используя колонку (внутренний диаметр26, высота 1200 мм) с биогелем Р, имеющим размер частиц 100-200 меш. Используя.в качестве элюата 0,1 М водный раствор хлористого натрия и проводя элюацию со скоростью.30 мл/ч, получают на выходе из колонки сначала Фракцию К 582 М-В (тоже н ниде солянокислой соли), Полученные таким образом элюаты А и В снова хроматографируют и после повторного выхода из колонки концентрируют при пониженном давлении. К полученным н остатке веществам прибавляют для осаждения смесь ацетона и этанола (4:1) и после высушивания полученные осадки повторно экстрагируют метанолом.Метанольный раствор концентрируют н вакууме и остаток дифундируют добавлением смеси ацетона и этанола . (4. 1). После высушивания полученных осадков получают в виде порошкообразных продуктов К 582 М-А (солянокислую соль) или К 582 М-В (солянокислую соль). Затем каждый из полученных порошков А и В растворяют в небольшом количестве 80-ного метанола и полученные метанольные раствбры очищают хроматографически с использованием колонки (внутренний диаметр 26, высота 1200 мм), заполненной сефадексом 1.Н. Полученные элюаты концентрируют при пониженном давлении и вещества, содержащиеся в остатках после упаривания, осаждают смесью ацетона и этанола (4:1), После высушивания полученных осадков до постоянного веса получают 0,41 г К 582 М-А в виде солянокислой соли (выход 41,0) и 0,35 г К 582 М-В тоже в виде солянокислой соли (выход 35,0).П р и м е р 4, 1 г смеси солянокислых солей К 582 М-А и К 582 М-В, полученной в соответствии с примером 2,растворяют в 5 мл воды и этот водный раствор хроматографируют, используй колонку (внутренний диаметр 20, высота 500 мм) с карбоксиметилсефадексом С(100-200 меш). Хроматографию проводят при использовании в качестве элюатов сначала 0,1 М буферного раствора ФосФорной кислоты (рН 6), затем 0,4 М раствора хлористого натрия и в заключение 0,9 И раствора хлористого натрия. После изменения элюата на 0,9 М раствор НаС 1 сначала из колонки элюируется К 582 М-А (в виде соля.нокислой соли),а затемК 582 И-В (тоже в виде соляной соли). Элюаты К 582 И-А (солянокислая соль) и К 582 М-В (солянокислая соль)концентрируют, высушивают, повторно экстрагируют метанолом и полученные метанольные растворы сначала концентрируют в вакууме до образования небольшого по объему остатка, а затем этот остаток обрабатывают смесью ацетона и этанола (4:1) с целью,по.лучения соответственно К 582 И-А(тоже солянокислой соли). Каждый из полученных таким образом порошков растворяют в небольшом количес-тве 80-ного метанола и этот метанольный раствор очищают обессолива- , нием с помощью хроматографии на колонке с сефадексом 1.Н. После концентрирования соответствующих элюатов при пониженном давлении ве- щества, содержащиеся,в остатках, осаждают прибавлеНием смеси ацето-, на и этанола (4:1). После высушивания осадков получают соответственно 0,40 г очищенного К 582 М-А (соля- нокислой соли) (выход 40,0) и 0,43 г очищенного К 582 И-В (солянокислой соли) (выход 43,0).П р и м е р 5. 5 л культуральной среды, полученной в соответствии с примером 1, фильтруют с добавлением 10 г гифло-суперцеля. Полученный фильтрат доводят до рН 5,0-6,0, концентрируют до объема, составляющего1/10 - 1/20 от первоначальногообъема, удаляют содержащиеся в концентрате неорганические соли, сноваупаривают (на этот раз досуха) иполученный остаток экстрагируют несколькими порциями метанола общимобъемом 200 мл,Объединенный экстрактконцентрируют в вакууме и остатокповторно экстрагируют метанолом, используя для этой цели последовательно уменьшающиеся количества метанола. Полученные экстракты полностьюрастворяют в воде и этот водный раствор хроматографируют на колонке(внутренний диаметр 50, высота 35 1000 мм) с биогелем Р(100-200 меш.При использовании в качестве элюента 0,1 И раствора хлористого натрия,пропускаемого через упомянутую колонку со скоростью 30 мл/ч, сначала Я получают Фракцию К 582 М-А (солянокислую соль), а затем ФракциюК 582 И-В (солянокислую соль). Элюаты, соответствующие этим Фракциям,очищают каждый путем обессоливанияв соответствии с процедурой, описанной в примере 3 (экстракция метанолом, прибавление смеси ацетона и и этанола, хроматография на колонкес сефадексом 1.Н), в результатечего получают 1;4 г высушенногоК 582 И-А (солянокислую соль) и1,2 г высушенного К 582 И-В (солянокислую соль), соответственно.П р и м е р 6. 5 л культуральной З среды, полученной в соответствии спримером 1, Фильтруют с добавлениемФильтрующего средства гифло-суперцель, После концентрирования в ваку,уме фильтрат отделяют от выделившихся твердых веществ Фильтрованием, 4 О доводят его рН до величины порядка5,0-7,0 и затем пропускают через колонку (внутренний диаметр 20 , высота 1000 мм) с СМ-сефадексом С(100-200 меш.) с целью поглощения Я целевых веществ. Затем адсорбированные вещества элюируют с колонки снаала 0,1 И буферным раствором Фосйорной кислоты, имеющим рН 6,0, затем0,4 И раствором хлористого натрия у и в дальнейшем 0,9 М раствором МаС 1,После замены элюирующег 9 растворана 0,9 М раствор хлористого натрияиз колонки выходит сначала ФракцияК 582 И-А (солянокислая соль),а затем Фракция К 582 И-В (тоже в видесолянокислой соли),Эти разделенныена фракции элюаты,один из которыхсодержит солянокислую соль К 582 И-А,а другой солянокислую соль К 582 М-В,концентрируют в вакууме,обессоливают бО с помощью метода, описанного в примере 4 (метанольная экстракция, добавление смеси ацетона и зтанола, хроматография на колонке с сефадексомЗаказ 8892/66 Тираж, 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, )-35, Раушская наб., д.4/5(его солянокислой соли) и 1,3 г высушенного К 582 М-В (солянокислой соли) соответственно.П р и м е р 7. 2 г гидрохлорида К 582 М-А, полученного по методу, описанному в примере 3 илй 4, растворяют в 5 мл дистиллированной воды и раствор наносят на колонку со слоббкислотным катионитом.Амберлит 1 КС(4 25 см). После промывки ко" лонки 400 мл дистиллированной воды К 582 М-А (сульфат) элюируют 1 н.раствором серной кислоты. Элюат, содержащий К 582 М-А в виде сульфата, обрабатывают ионитом 1 РА. После доведения рН смеси до 6,0 смолу отфильтровывают и фнльтрат концентрируют в вакууме. К этому концентрату прибавляют смесь ацетона и этанола (4:1) и выпавший осадок отделяют фильтрованием. Полученный К 582 М-А (сульфат) хроматографируют с целью обесаоливания и очистки на колонке с сейадексом 1.Н(колонка 2,2 м 80 см) Для элюирования вещества из колонки используют дистиллированную воду.Предложенный способ позволяет получить новый антибиотик К 582 М. 1 Оформула изобретенияСпособ получения антибиотикаК 582 М, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что штамм МесагЬ 1 д 1 оа ап 1 ьор 11 ае (МейьсЬ) 5 ого)с, Чаг. ао 1 ьор 11 ае 582 М 35 выращивают в аэробных условиях вжидкой питательной среде при 20-37 фС и рН 3,0-8,0 с последующим выделением целевого продукта.